全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（7）：1293–1302 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2012–03–19；修回日期：2012–06–18
基金项目：教育部新世纪优秀人才支持计划项目（NECT-11-0670）；江苏高校优势学科建设项目（2011PAPD）；江苏省双创计划项目
（2011JSSC）；南京农业大学高层次人才引进项目
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：xiongaisheng@njau.edu.cn）
芹菜非特异性脂转移蛋白基因的克隆与表达分析
蒋 倩，王 枫，侯喜林，王 镇，李梦瑶，马 静，刘梦叠，熊爱生*
（南京农业大学园艺学院，作物遗传与种质创新国家重点实验室，农业部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点
实验室，南京 210095）
摘 要：以芹菜（Apium graveolens）‘六合黄心芹’、‘津南实芹’和‘美国西芹’为试验材料，采用
RT-PCR 技术分别获得其 cDNA 序列。序列分析表明：来源于 3 个芹菜品种的非特异性脂转移蛋白
（Non-specific lipid transfer protein，nsLTP）基因核苷酸序列高度保守，全长 357 bp，编码 118 个氨基酸，
起始密码子 ATG 之后含有 27 个氨基酸残基的信号肽序列，推测其成熟的蛋白含 91 个氨基酸残基，预测
其蛋白质分子量为 11.75 kD，pI 值为 9.36。芹菜的 nsLTP 蛋白主要由 α–螺旋和随机卷曲组成。空间结构
上分析显示，芹菜 nsLTP 蛋白中 H1 区域明显分为 H1a 和 H1b 两个亚区域，而模板碧桃中 H1 区域为一个
连续的螺旋结构，存在明显的差异。进化分析显示，芹菜 nsLTP 与香石竹、大洋洲滨藜等植物的 nsLTP
相似性较高，在保守位置具有 8 个半胱氨酸残基。实时定量 PCR 表达分析表明，该基因主要在芹菜的茎
以及茎尖生长活跃中心表达，具有明显的组织特异性。
关键词：芹菜；脂转移蛋白；基因克隆；实时定量 PCR；基因表达
中图分类号：S 636.3 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）07-1293-10

Cloning and Expression Pattern Analysis of nsLTP Gene in Celery
JIANG Qian，WANG Feng，HOU Xi-lin，WANG Zhen，LI Meng-yao，MA Jing，LIU Meng-die，and
XIONG Ai-sheng*
（College of Horticulture，Nanjing Agricultural University，State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm
Enhancement，Ministry of Agriculture Key Laboratory of Biology and Germplasm Enhancement of Horticultural Crops in
East China，Nanjing 210095，China）
Abstract：In this study，full-length of cDNA sequences of non-specific lipid transfer protein （nsLTP）
gene were cloned from celery（Apium graveolens）cultivars‘Liuhe Huangxinqin’，‘Jinnan Shiqin’and
‘Meiguo Xiqin’using reverse transcript PCR（RT-PCR）. Sequence analysis shows：The cDNA nucleotide
sequences are highly conserved from the three cultivars. The length of the gene is 357 bp，containing a
complete open reading frame to encode 118 amino acids. There is a signal peptide sequence with 27 amino
acid residues. The mature protein contains 91 amino acid residues. Its molecular mass is 11.75 kD，and pI
is 9.36. Amino acid sequence comparison indicates that the nsLTP from celery has a high similarity with
the nsLTPs from Dianthus caryophyllus and Atriplex nummularia. There are 8 Cys amino acid residues in
the conservative position. The nsLTP protein from celery is mainly composed by α-helixs and random

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coils. Spatial structure analysis shows significant differences. The H1 region of nsLTP protein from celery
was divided into two sub-region：H1a and H1b，while the H1 region of template is a continuous helical
structure. Quantitative real-time PCR analysis shows that the gene is tissue-specific and mainly expressed
in the stem and active center of shoot apex in celery.
Key words：Apium graveolens；nsLTP；gene clone；quantitative real-time PCR；gene expression

非特异性脂转移蛋白（Non-specific lipid transfer protein，nsLTP）广泛存在于高等植物中，是一
类能在膜间转移脂类的相对分子质量较小的富含 Cys 的碱性蛋白质的总称。nsLTP 在植物中含量丰
富，占植物可溶性总蛋白的 4%左右（Werner et al.，1991）。根据其一级结构，nsLTP 一般被分为 3
类：nsLTP I、nsLTP II 和 nsLTP III（Boutrot et al.，2005）。自 1975 年首次从马铃薯块茎中分离得到
非特异性脂质转移蛋白（Kader，1975），现已从玉米（Sossountzov et al.，1991）、甘蓝（Hincha et al.，
2001）、小麦（Boutrot et al.，2005）、拟南芥（Boutrot et al.，2008）、向日葵（Pagnussat et al.，2009）
等许多植物中分离出多种非特异性脂质转移蛋白或基因。但目前对芹菜 nsLTP 的研究很少，国内未
见报道。
nsLTP 是一种多功能的蛋白，除了参与磷脂在生物膜之间的运输外，还在生物膜、角质和脂质
的形成、植物的生殖发育以及信号转导等生物过程中发挥重要作用（Kimberly et al.，2006；Chae et
al.，2009；Debono et al.，2009；Pii et al.，2010）。少数 nsLTP（如在银杏种子中）还具有蛋白酶抑
制子的功能（Sawano et al.，2008）。另外 nsLTP 作为一种食物过敏原（Gadermaier et al.，2010）和
防御蛋白（Maldonado et al.，2002；Lee et al.，2009）也引起了科研人员越来越多的关注。
早前已通过单晶衍射和 NMR 两种方法得到了多个 nsLTP 蛋白的三维结构，这些研究揭示了
nsLTP 蛋白的一些基本结构：4 个 α–螺旋、4 对二硫键和一个可结合、容纳脂肪酸分子的口袋状疏
水穴（Gincel et al.，1994；Shin et al.，1995；Gomar et al.，1996；Lerche et al.，1997；Lee et al.，
1998；Poznanski et al.，1999）。研究还发现，4 对二硫键连接 8 个半胱氨酸残基 3 ~ 50、13 ~ 27、
28 ~ 73、48 ~ 87（Pasquato et al.，2006）。疏水穴贯穿整个分子，它的存在有利于 nsLTP 蛋白结合
疏水配体（如酰基链、磷脂），并为配体的结合与释放提供信息。疏水穴结构上的可塑性使它们可容
纳从 C10–C18 不同大小的配体（Han et al.，2001）。
目前相对于模式植物和其它主要作物而言，伞形花科植物的分子生物学研究非常少。由于物种
间巨大的差异，加上进化顺序的不同以及千差万别的环境因素，伞形花科植物与模式植物相比具有
鲜明的特性。
芹菜（Apium graveolens）是伞形花科植物的一种典型代表。本试验中分别从 3 个芹菜品种中克
隆获得 nsLTP 基因，进行了较为详细的序列分析，并利用实时定量 PCR 方法进行了组织特异表达研
究，为进一步深入研究芹菜中脂转移蛋白的功能奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 菌种、质粒与植物材料
大肠杆菌菌株 DH5α，由本实验室保存；载体 pMD18-T、LA Taq 酶、反转录酶 MluⅠ、dNTP
荧光定量染料 SYBR GreenⅠ、DNA 回收试剂盒和 DL marker2000 等购自大连 TaKaRa 公司。
芹菜（Apium graveolens）材料‘六合黄心芹’、‘津南实芹’和‘美国西芹’，分别由本研究室
保存，于 2011 年秋季种植于南京农业大学江浦实验农场和人工气候室。
7 期 蒋 倩等：芹菜非特异性脂转移蛋白基因的克隆与表达分析 1295

图 1 RT-PCR 克隆芹菜 nsLTP
M：分子量标准；1：六合黄心芹；2：津南实芹；3：美国西芹。
Fig. 1 nsLTP gene from celery amplified by RT-PCR
M：Marker；1：Liuhe Huangxinqin；2：Jinnan Shiqin；
3：Meiguo Xiqin.
1.2 芹菜 nsLTP 基因的克隆及序列分析
采用 RNA simple Total RNA Kit（Tiangen 公司）从 3 个芹菜品种中分别提取总 RNA。用 Prime
Script RT reagent Kit（大连 TaKaRa 公司）将提取的总 RNA 反转录成 cDNA。根据 GenBank 中旱芹
茎杆组织的 nsLTP1（登录号：FJ643539）设计一对引物 NXR09（GGATCCATGGGAGTTTCAAAG
GTAG）和 NXR10（GAGCTCTTAATTCACCCTGCTGCAG）。
分别以 3 个品种芹菜的 cDNA 第 1 链为模板进行扩增。PCR 反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃
30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共 30 个循环；72 ℃ 10 min。反应产物经 1.2%琼脂糖凝胶电泳回
收后，连接 pMD18-T 载体并转化大肠杆菌 DH5α，提取质粒经 PCR 鉴定后委托南京金斯瑞生物科
技有限公司测序。
各类植物的 nsLTP 序列均来自于 NCBI 数据库，使用 BLAST 进行序列比对。用分子系统进化
树的构建用软件 Clustal X（http：//bioinformatics. ubc. ca/resources tools/clustalx）对序列进行多重比
对后，用 NJ 法完成系统树的构建，并用 MEGA5 对系统树进行测试和编辑，生成报告图形（Tamura
et al.，2011），即 nsLTP 氨基酸序列的系统进化树。利用 Signal P 分析蛋白信号肽（von Heijne，1983；
Hegde & Bernstein，2006）。蛋白质基本性质分析用 http：//www. expasy. org 网站相关软件完成（Wilkins
et al.，1999；Gasteiger et al.，2003）。蛋白质空间结构模型通过 Swiss-Model（http：//swiss-mode1. expasy.
org）建立（Peitsch，1995；Schwede et al.，2003；Arnold et al.，2006；Kiefer et al.，2009）。利用
Swiss-viever 4.0 对模建结果进行检测，计算得出 Ramachandran 图（Guex & Peitsch，1997；Bosco &
Robert，2005）。
1.3 实时定量 PCR 反应
荧光定量 PCR（Relative quantitative real-time RT-PCR）采用 ABI 7300 Real-time PCR System 和
7300 System software 完成。用芹菜 actin 基因作为参考基因，与目标基因一起扩增，表达检测引物
为 ACTIN-F（CTTCCTGCCATATATGATTGG）和 ACTIN-R（GCCAGCACCTCGATCTTCATG）。
根据从芹菜中扩增的 nsLTP序列分别设计表达检测引物NXR75（CCTCAAGGGAGGTGGATAT）
和 NXR76（TAGCGAATACCGCACTTTCC）。
实时定量 PCR 使用大连 TaKaRa 公司的 SYBR Premix Ex Taq 试剂盒，按照操作说明进行。相
对定量使用参照基因的 ΔCT 法，表达差异等于 2-ΔCT，ΔCT = CT, 目标基因–CT, actin（Pfaffl，2001）。
2 结果与分析
2.1 芹菜 nsLTP 基因的克隆
分别以 3 个芹菜品种的 cDNA 为模板，以
NXR09 和 NXR10 为引物，经 PCR 扩增后分别
得到 360 bp 左右的片段（图 1）。
序列测定与分析表明，来源于 3 个品种的
nsLTP 完全一致，均含有一个 357 bp 的开放阅
读框，编码 118 个氨基酸，在起始密码子 ATG
之后有 27 个氨基酸残基的信号肽序列
（MGVSKVAIAVAVMLMVVVINHPAVVEG），
剪切位点在第 27 位甘氨酸与第 28 位亮氨酸之
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间，推测其成熟的蛋白含有 91 个氨基酸残基，预测其蛋白质分子量为 11.75 kD，pI 值为 9.36。
2.2 芹菜 nsLTP 的氨基酸序列分析
对‘六合黄心芹’nsLTP 氨基酸序列进行 Blast 同源性检索与比对，结果表明该蛋白与香石竹、
大洋洲滨藜、葡萄、向日葵、马铃薯、甜椒、籼稻、棉花、樱桃、碧桃、烟草、苹果、蒺藜苜蓿、
花生、西洋梨、玉米和绿豆相似性较高。其中与大洋洲滨藜和香石竹的一致性分别达到 61%和 59%。
‘六合黄心芹’的 nsLTP 属于 Non-specific lipid-transfer protein type I（nsLTP I），并具有 AAL-LTSS
超家族保守结构域（图 2，A）。AAL-LTSS 结构域是 α–淀粉酶抑制剂（AAI）、种子储藏蛋白（SSP）
以及脂转移蛋白（LTP）所共有的特征。将来源于‘六合黄心芹’的 nsLTP 与来源于这些植物的 nsLTP
的氨基酸序列进行多重对比，结果表明这些 nsLTP 在保守位置都具有 8 个半胱氨酸残基（图 2，B）。



图 2 芹菜 nsLTP 的保守域预测及其与其它物种 nsLTP 氨基酸序列的多重比对
A：保守域预测；B：序列比对。箭头所示为 8 个半胱氨酸残基保守位点。
Fig. 2 Prediction of the conserved domain and alignment of amino acid of nsLTP from celery and other different plants
A：Prediction of the conserved domain；B：Alignment of amino acid.
The arrow marks the 8 Cys amino acid residues in the conservative position.

7 期 蒋 倩等：芹菜非特异性脂转移蛋白基因的克隆与表达分析 1297

对上述植物中的 nsLTP 进行氨基酸组成成分及理化性质分析，结果表明：这些植物中的 nsLTP
氨基酸残基数较少，为 100 ~ 120 个，分子量也较小，只有 10 ~ 11 kD。碱性氨基酸明显多于酸性氨
基酸，理论等电点在 9 左右，是碱性蛋白。脂肪族氨基酸所占比例较高，芳香族氨基酸只占 2% ~ 4%，
蛋白质可溶性预测中不溶蛋白的比例都大于 80%。
2.3 芹菜 nsLTP 的进化分析
选取图 2 中所列的 17 种植物与‘六合黄心芹’的 nsLTP 蛋白进行同源进化比对，构建同源进
化树。结果表明，‘六合黄心芹’的 nsLTP 蛋白同香石竹进化关系最近，来源于‘六合黄心芹’、香
石竹和大洋洲滨藜的 nsLTP 蛋白同属于一个分支（图 3）。


图 3 部分物种的 nsLTP 氨基酸序列的系统进化树
Fig. 3 Phylogenetic tree of amino acid sequences of the nsLTP from several plant species

2.4 芹菜 nsLTP 的氨基酸疏水性/亲水性分析
对克隆的芹菜 nsLTP 推导的氨基酸序列进行了 DNAMAN 疏水性/亲水性分析。结果表明，该
蛋白的第 16 位缬氨酸（Val）疏水性最强，其次疏水性强的位点分别出现在第 14 位亮氨酸（Leu）
和第 15 位甲硫氨酸（Met）；第 71 位精氨酸（Arg）亲水性最强，其次亲水性强的位点出现在第 72 位
赖氨酸（Lys）。总体来看，‘六合黄心芹’来源的 nsLTP 大部分的氨基酸属于疏水性氨基酸，是疏
水性蛋白。
2.5 芹菜 nsLTP 蛋白的二级和三级结构预测与分析
根据 Hierarchical Neural Network 的分析（Combet et al.，2000），‘六合黄心芹’nsLTP 由 38.46%
的 α–螺旋（Alpha helix）、6.59%的延伸主链（Extended strand）、3.30%的 β–转角（Beta turn）和
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51.65%的随机卷曲（Random coil）组成。其中 α–螺旋和随机卷曲是主要组成部分，而延伸主链和
β–转角则散布在蛋白序列中。
除去信号肽序列的比对分析显示，碧桃与本试验中克隆的芹菜的 nsLTP 序列相似性最高，相似
度达到 53.8%。因此选取碧桃的 nsLTP（PDB ID：2alg_A）为模型，通过 Swiss-Model 进行三维结
构同源建模。
图 4 是‘六合黄心芹’和碧桃的 nsLTP 蛋白的三维结构预测以及两者去掉信号肽后的序列比对。
‘六合黄心芹’和碧桃的 nsLTP 蛋白都具有 4 个 α–螺旋和一个口袋状疏水穴，两者在每个 α–螺
旋上都存在一定差异，尤其在第 1 个 α–螺旋区域 H1 上差异最大。芹菜 H1 区域中的 KLG 为非螺
旋结构，导致整个 H1 区域明显分为 H1a 和 H1b 两个亚区域，而碧桃中 H1 区域为一个连续的螺旋
结构，两者存在明显的差异。H4 差异最小，氨基酸序列具有 50%的一致性。

图 4 芹菜和碧桃 nsLTP 蛋白的三维结构图（A）和同源建模氨基酸序列（B）
N：表示 N 端；C：表示 C 端；H：表示 α–螺旋；彩色区分不同的 α–螺旋。
Fig. 4 The three-dimension structrues（A）and alignment modeling sequence（B）of
nsLTP from celery（A. graveolens）and peach（P. persica）
N：The N-terminal residue；C：The C-terminal residue；H：Alpha helix；
Different alpha helixs colored by different colors.

Ramachandran plots 是反映立体化学质量（Stereochemical quality）的参数。通过分析‘六合黄
心芹’Φ角和 Ψ角的分布方式对本文模拟的三维结构是否与自然结构趋势相同进行评估（图 5），虚
线区域是最理想的 Φ角和 Ψ角分布区域，而实线区域外部则为不合理区域。如果预测的蛋白质残基
的二面角有 90%以上位于虚线区域，则表明其有稳定的空间结构。
从图 5 可见，模拟得到的‘六合黄心芹’nsLTP 蛋白的三维结构的 Φ 角和 Ψ 角有 97.8%位于
Ramachandran 图中合理区域，结构总能量为–1 910.905 kJ · mol-1，表明模拟得到的‘六合黄心芹’
nsLTP 的三维结构是可靠的。
7 期 蒋 倩等：芹菜非特异性脂转移蛋白基因的克隆与表达分析 1299




图 5 芹菜 nsLTP 的 Ramachandran 图
方格代表甘氨酸；加号代表所有别的氨基酸残基。
Fig. 5 The Ramachandran plot of nsLTP from celery
Square for glycines and plus sign for all other residues.

2.6 nsLTP 在 3 个芹菜品种中不同组织部位的表达分析
通过荧光定量 PCR 检测 nsLTP 在 3 个芹菜品种的不同组织中的表达情况（图 6），nsLTP 主要
在茎和茎尖中表达，叶片中表达较低。
在茎尖中，‘美国西芹’的表达量明显高于其它两个品种。‘六合黄心芹’和‘美国西芹’在茎
中表达量相当，而‘津南实芹’表达量相对比较低。叶片中，‘津南实芹’的表达量也高于另外两个
检测品种。在根中，3 个不同芹菜品种中均没有检测出明显的表达。

图 6 芹菜中 nsLTP 在不同组织中的表达水平
Fig. 6 Expression analysis of nsLTP in different tissues of celery
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3 讨论
本试验中采用的 3 个芹菜品种各有特色，差异较为明显。从 3 个地域不同，外形差异较为明显
的芹菜中分离的 nsLTP 基因具有完全一致的核苷酸序列，表明该基因在这 3 个芹菜品种中是完全保
守的。从 3 个芹菜品种中克隆的非特异性脂转移蛋白均属于 nsLTPⅠ类。对水稻、高粱等 9 种植物
的多个 nsLTP 进行研究，发现 nsLTPⅠ类中的 nsLTP 相对保守（Wang et al.，2012a）。同时，3 种芹
菜中的 nsLTP 非常保守的原因还可能与该蛋白在磷脂运输、角质形成（Pyee et al.，1994；Lee et al.，
2009）和植物防御（Blein et al.，2002；Carvalho & Gomes，2007；Jung et al.，2009）等过程中发挥
的重要作用相关。
通过进化分析发现，本试验中克隆的芹菜 nsLTP 基因编码的蛋白在进化关系上同香石竹和大洋
洲滨藜最近。香石竹和大洋洲滨藜均属于石竹目，‘六合黄心芹’nsLTP 与这两种植物的 nsLTP 共处
一个分支，可见属于伞形目伞形花科的芹菜与石竹目进化关系较近。樱桃、碧桃、苹果和西洋梨为
蔷薇科植物，这 4 种植物来源的 nsLTP 蛋白在进化上同处于一个分支。烟草、马铃薯和甜椒来源的
nsLTP 蛋白属于另外一个分支，它们均为茄科植物。而籼稻和玉米是单子叶禾本科植物，区别于其
它双子叶植物，在进化树上单独位于一个分支。可见不同物种的 nsLTP 蛋白的进化呈现明显种属特
性，可以为伞形花科植物进化分析提供一定的证据。
目前，植物中关于 nsLTP 蛋白的研究较为深入，水稻（Lee et al.，1998）、烟草（da Silva et al.，
2005）、碧桃（Pasquato et al.，2006）、玉米（Han et al.，2001）和绿豆（Lin et al.，2005）等都已有
三维空间结构模型。通过对上述 5 种植物和本试验中克隆的芹菜中的 nsLTP 氨基酸序列的比对，发
现它们在氨基酸序列上存在较大的差异，氨基酸的相似性为 64.96%。尤其是在 α–螺旋区域差异较
大，其中与水稻差异最大，与碧桃差异最小。对碧桃和‘六合黄心芹’nsLTP 蛋白的空间结构进行
比较，发现两者都具有 nsLTP 蛋白的典型结构：4 个 α–螺旋结构、一个口袋状疏水穴和一段曲折
延长的 C 末端（Wang et al.，2012b）。但由于部分氨基酸残基的不同，导致具体的结构上也有一定
的差异。三维结构比对显示：两者在 H1 区域差别最大，‘六合黄心芹’nsLTP 蛋白的 H1 区域被分
为了 H1a 和 H1b 两个亚区域；H4 区域差别最小，经比对有 50%的氨基酸表现一致。
3 个芹菜品种中的表达分析显示，nsLTP 在茎及茎尖生长活跃部位表达较高，叶片表达较低，
根部未检测到表达，可见该基因具有较明显的组织特异性。这些表达特点可能与芹菜非特异性脂转
移蛋白在芹菜生长发育中发挥的一些功能相关，例如体细胞胚胎发生（Sterk et al.，1991）、花粉附
着（Park et al.，2000；Chae et al.，2010）以及植物防御等。
References
Arnold K，Bordoli L，Kopp J，Schwede T. 2006. The SWISS-MODEL workspace：A web-based environment for protein structure homology
modelling. Bioinformatics，22：195–201.
Blein J P，Coutos-Thevenot P，Marion D，Ponchet M. 2002. From elicitins to lipid-transfer proteins：A new insight in cell signaling involved in plant
defence mechanisms. Trends Plant Science，7：293–296.
Bosco K Ho，Robert B. 2005. The Ramachandran plots of glycine and pre-proline BMC. Structural Biology，5：141.
Boutrot F，Guirao A，Alary R，Joudrier P，Gautier M F. 2005. Wheat non-specific lipid transfer protein genes display a complex pattern of expression
in developing seeds. Biochemical et Biophysica Acta，1730：114–125.
Boutrot F，Chantret N，Gautier M F. 2008. Genome-wide analysis of the rice and Arabidopsis non-specific lipid transfer protein（nsLtp）gene families
and identification of wheat nsLtp genes by EST data mining. BMC Genomics，9：86.
Carvalho A D O，Gomes V M. 2007. Role of plant lipid transfer proteins in plant cell physiology：A concise review. Peptides，28：
7 期 蒋 倩等：芹菜非特异性脂转移蛋白基因的克隆与表达分析 1301

1144–1153.
Chae K，Kieslich C A，Morikis D，Kim S C，Lord E M. 2009. A gain-of-function mutation of Arabidopsis lipid transfer protein 5 disturbs pollen tube
tip growth and fertilization. The Plant Cell，21：3902–3914.
Chae K，Gonong B J，Kim S C，Kieslich C A，Morikis D，Balasubramanian S，Lord E M. 2010. A multifaceted study of stigma/style cysteine-rich
adhesion (SCA)-like Arabidopsis lipid transfer proteins（LTPs）suggests diversified roles for these LTPs in plant growth and reproduction.
Journal of Experimental Botany，61：4277–4290.
Combet C，Blanchet C，Geourjon C，Deléage G. 2000. NPS@：Network protein sequence analysis. Trends in Biochemical Sciences，25：
147–150.
da Silva P，Landon C，Industri B，Marais A，Marion D，Ponchet M，Vovelle F. 2005. Solution structure of a tobacco lipid transfer protein exhibiting
new biophysical and biological features. Proteins，59：356–367.
Debono A，Yeats T H，Rose J K，Bird D，Jetter R，Kunst L，Samuels L. 2009. Arabidopsis LTPG is a glycosylphosphatidylinositol-anchored lipid
transfer protein required for export of lipids to the plant surface. The Plant Cell，21：1230–1238.
Gadermaier G，Egger M，Girbl T，Erler A，Harrer A，Vejvar E，Liso M，Richter K，Zuidmeer L，Mari A，Ferreira F. 2010. Molecular characterization
of Api g 2，a novel allergenic member of the lipid-transfer protein 1 family from celery stalks. Mol Nutr Food Res，55：568–577.
Gasteiger E，Gattiker A，Hoogland C，Ivanyi I，Appel R D，Bairoch A. 2003. ExPASy：The proteomics server for in-depth protein knowledge
and analysis. Nucleic Acids Research，31：3784–3788.
Guex N，Peitsch M C. 1997. SWISS - MODEL and the Swiss-Pdb-Viewer：An environment for comparative protein modelling. Electrophoresis，18：
2714–2723.
Gincel E，Simorre J P，Caille A，Marion D，Ptak M，Vovelle F. 1994. Three-dimensional structurein solution of a wheat lipid-transfer protein from
multidimensional 1H-NMR data. A new folding for lipid carriers. European Journal of Biochemistry，226：413–422.
Gomar J，Petit M C，Sodano P，Sy D，Marion D，Kader J C，Vovelle F，Ptak M. 1996. Solution structure and lipid binding of a nonspecific
lipid-transfer protein extracted from maize seeds. Protein Science，5：565–577.
Han G W，Lee J Y，Song H K，Chang C，Min K，Moon J，Shin D H，Kopka M L，Sawaya M R，Yuan H S，Kim T D，Choe J，Lim D，
Moon H J，Suh S W. 2001. Structural basis of non-specific lipid binding in maize lipid-transfer protein complexes revealed by high-resolution
X-ray crystallography. Journal of Molecular Biology，308：263–278.
Hegde R S，Bernstein H D. 2006. The surprising complexity of signal sequences. Trends in Biochemical Sciences，31 (10)：563–571.
Hincha D K，Neukamm B，Sror H A，Sieg F，Weckwarth W，Ruckels M，Lullien-Pellerin V，Schroder W，Schmitt J M. 2001. Cabbage cryoprotectin
is a member of the nonspecific plant lipid transfer protein gene family. Plant Physiology，125：835–846.
Jung H W，Tschaplinski T J，Wang L，Glazebrook J，Greenberg J T. 2009. Priming in systemic plant immunity. Science，324：89–91.
Kader J C. 1975. Protein and intracellular exchange of lipids：Stimulation of phospholipid exchange between mitochondria and microssomal fractions
by protein isolated from potato tuber. Biochimica et Biophysica Acta，380：31–44.
Kiefer F，Arnold K，Künzli M，Bordoli L，Schwede T. 2009. The SWISS-MODEL repository and associated resources. Nucleic Acids Research，
37： 387–392.
Kimberly D C，Mark A T，Lawrence B S.2006. Increased accumulation of cuticular wax and expression of lipid transfer protein in response to
periodic drying events in leaves of tree tobacco. Plant Physiology，140：176–183.
Lee J Y，Min K，Cha H，Shin D H，Hwang K Y，Suh S W. 1998. Rice non-specific lipid transfer protein：The 1.6 A crystal structure in the unliganded
state reveals a small hydrophobic cavity. Journal of Molecular Biology，276：437–448.
Lee S B，Go Y S，Bae H J，Park J H，Cho S H，Cho H J，Lee D S，Park O K，Hwang I，Suh M C. 2009. Disruption of glycosylphosphatidylinositol-
anchored lipid transfer protein gene altered cuticular lipid composition，increased plastoglobules，and enhanced susceptibility to infection by the
fungal pathogen Alternaria brassicicola. Plant Physiology，150：42–54.
Lerche M H，Kragelund B B，Bech L M，Poulsen F M. 1997. Barley lipid-transfer protein complexed with palmitoyl CoA：The structure reveals a
hydrophobic binding site that can expand to fit both large and small lipid-like ligands. Structure，5：291–306.
Lin K F，Liu Y N，Hsu S T，Samuel D，Cheng C S，Bonvin A M，Lyu P C. 2005. Characterization and structural analyses of nonspecific lipid transfer
1302 园 艺 学 报 39 卷
protein 1 from mung bean. Biochemistry，44：5703–5712.
Maldonado A M，Doerner P，Dixon R A，Lamb C J，Cameron R K. 2002. A putative lipid transfer protein involved in systemic resistance signalling
in Arabidopsis. Nature，419：399–403.
Pagnussat L A，Lombardo C，Regente M，Pinedo M，Martin M，de la Canal L. 2009. Unexpected localization of a lipid transfer protein in germinating
sunflower seeds. Journal of Plant Physiology，166：797–806.
Park S Y，Jauh G Y，Mollet J C，Kathleen J E，Nothnagel E A，Walling L L，Lord E M. 2000. A lipid transfer-like protein is necessary for lily pollen
tube adhesion to an in vitro Stylar Matrix. Plant Cell，12：151–164.
Pasquato N，Berni R，Folli C，Folloni S，Cianci M，Pantano S，Helliwell J R，Zanotti G. 2006. Crystal structure of peach Pru p 3，the prototypic
member of the family of plant non-specific lipid transfer protein pan-allergens. Journal of Molecular Biology，356 (3)：684–694.
Peitsch M C. 1995. Protein modeling by E-mail. Nature Biotechnology，13：658–660.
Pfaffl M W. 2001. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research，29：2002–2007.
Pii Y，Pandolfini T，Crimi M. 2010. Signaling LTPs：A new plant LTPs sub-family. Plant Signal Behav，5 (5)：594–597.
Poznanski J，Sodano P，Suh S W，Lee J Y，Ptak M，Vovelle F. 1999. Solution structure of a lipidtransfer protein extracted from rice seeds.
Comparison with homologous proteins. European Journal of Biochemistry，259：692–708.
Pyee J，Yu H S，Kolattukudy P E. 1994. Identification of a lipid transfer protein as the major protein in the surface wax of broccoli（Brassica
oleracea）leaves. Archives of Biochemistry and Biophysics，311：460–468.
Sawano Y，Hatano K，Miyakawa T，Komagata H，Miyauchi Y，Yamazaki H，Tanokura M. 2008. Proteinase inhibitor from ginkgo seeds is a member
of the plant nonspecific lipid transfer protein gene family. Plant Physiology，146：1909–1919.
Schwede T，Kopp J，Guex N，Peitsch M C. 2003. SWISS-MODEL：An automated protein homology-modeling server. Nucleic Acids Reseach，
31：3381–3385.
Shin D H，Lee J Y，Hwang K Y，Kim K K，Suh S W. 1995. High-resolution crystal structure of the non-specific lipid-transfer protein from maize
seedlings. Structure，3：189–199.
Sossountzov L，Ruiz-Avila L，Vignols F，Jolliot A，Arondel V，Tchang F，Grosbois M，Guerbette F，Miginiac E，Delseny M，Puigdomenèch
P，Kader J C. 1991. Spatial and temporal expression of a maize lipid transfer protein gene. The Plant Cell，3：923–933.
Sterk P，Booij H，Schellekens G A，Van Kammen A，De Vries S C. 1991. Cell-specific expression of the carrot EP2 lipid transfer protein gene. Plant
Cell，3：907–921.
Tamura K，Peterson D，Peterson N，Stecher G，Nei M，Kumar S. 2011. MEGA5：Molecular evolutionary genetics analysis using maximum
likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods. Molecular Biology and Evolution，28：2731–2739.
von Heijne G. 1983. Patterns of amino acids near signal-sequence cleavage sites. European Journal of Biochemistry，133：17–21.
Wang H W，Hwang S G，Karuppanapandian T，Liu A，Kim W，Jang C S. 2012a. Insight into the molecular evolution of non-specific lipid transfer
proteins via comparative analysis between rice and sorghum. DNA Reseach，19：179–194.
Wang N J，Lee C C，Cheng C S，Lo WC，Yang Y F，Chen M N，Lyu P C. 2012b. Construction and analysis of a plant non-specific lipid transfer
protein database（nsLTPDB）. BMC Genomics，13：1–9.
Werner R B，Sharon T，Jose B，Chris R S. 1991. Isolation of a cDNA clone for spinach lipid transfer protein and evidence that the ptotein is
synthesized by the secretory pathway. Plant Physiology，95：164–170.
Wilkins M R，Gasteiger E，Bairoch A，VSanchez J C，Williams K L，Appel R D. 1999. Protein identification and analysis tools in the ExPASy server.
Methods in Molecular Biology，112：531–552.