全 文 ：园 艺 学 报 2013，40（11）：2189–2198 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–06–17；修回日期：2013–10–24
基金项目：国家自然科学基金项目（31272175）；教育部新世纪优秀人才支持计划项目（NCET-11-0670）；江苏省杰出青年基金项目
（BK20130027）；江苏高校优势学科建设项目（2011PAPD）；江苏省双创计划项目（2011JSSC）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：Xiongaisheng@njau.edu.cn）
芹菜甘露醇脱氢酶基因的分离与表达分析
谭国飞，王 枫，贾晓玲，李 岩，熊爱生*
（南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室，农业部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，园
艺学院，南京 210095）
摘 要：以芹菜（Apium graveolens L.）本芹品种‘六合黄心芹’和西芹品种‘文图拉’为研究对象，
通过克隆测序，分别获得 2 种芹菜的甘露醇脱氢酶基因序列。2 种芹菜来源的该基因全长均为 1 098 bp，
编码 365 个氨基酸，预测 2 种芹菜该酶蛋白质分子量分别为 39.66 kD 和 39.69 kD，pI 值分别为 6.79 和 6.78。
2 种芹菜中甘露醇脱氢酶基因之间有 17 个核苷酸位点不同，3 个氨基酸位点发生改变。通过与其他植物
甘露醇脱氢酶基因与氨基酸序列比对，表明该基因具有高度的保守性。进化分析显示，与同属于伞形科
的植物香芹进化关系最近。实时定量 PCR 表明，芹菜中甘露醇脱氢酶基因在根、茎、叶、花中表达有差
异，其中根中含量最高。对 2 种芹菜分别进行 4 ℃、38 ℃、0.2 mol · L-1 NaCl 和 20% PEG 处理 7 个不同
时间段，实时定量表达分析显示，‘六合黄心芹’中甘露醇脱氢酶基因变化大于西芹‘文图拉’，且不同
处理后甘露醇脱氢酶基因表达响应呈现出较大的差异。
关键词：芹菜；甘露醇脱氢酶；基因克隆；非生物胁迫；表达
中图分类号：S 636.3 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2013）11-2189-10

Isolation and Expression of Mannitol Dehydrogenase Gene in Celery
TAN Guo-fei，WANG Feng，JIA Xiao-ling，LI Yan，and XIONG Ai-sheng*
（State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement，Ministry of Agriculture Key Laboratory of Biology
and Germplasm Enhancement of Horticultural Crops in East China，College of Horticulture，Nanjing Agricultural
University，Nanjing 210095，China）
Abstract：In this study，the genes encoding the mannitol dehydrogenase were cloned from‘Liuhe
Huangxinqin’and‘Ventura’，respectively. The lengths of mannitol dehydrogenase genes from the two
celery cultivars were 1 098 bp，and encoding 365 amino acids. The protein molecular weights of the
enzymes were 39.66 kD and 39.69 kD，and the pI values were 6.79 and 6.78，respectively. There were 17
different nucleotide sites，and 3 different amino acid residues between the mannitol dehydrogenase genes
from the two celery cultivars. Sequence alignment with mannitol dehydrogenase of other plants indicated
that the enzymes were highly conserved. Phylogenetic analysis demonstrated that the enzymes of celery
were closed with coriander，an Apiaceae plant. Real-time quantitative PCR analysis showed that the
mannitol dehydrogenase genes were tissue-specific expressed in the two celery cultivars，the highest
expression level were found in the root. The expression profiles of the mannitol dehydrogenase gene were

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detected by real-time quantitative PCR under different stress treatments（4 ℃，38 ℃，0.2 mol · L-1 NaCl
and 20% PEG）in the two celery varieties. Expression profiles analysis showed that level of the induced or
suppressed the mannitol dehydrogenase gene in‘Liuhe Huangxinqin’were larger than in‘Ventura’. The
responses of the mannitol dehydrogenase gene to abiotic stress treatments were different in the two celery
varieties.
Key words：Apium graveolens；mannitol dehydrogenase；gene cloning；abiotic stress；gene expression

芹菜（Apium graveolens L.）栽培品种主要分为本芹和西芹（张振贤，2009）。本芹主要为中国
特产，通常较西芹矮小，具有植株叶柄细长，香味浓郁等特点。本研究中所用的‘六合黄心芹’为
南京六合地区的地方优良品种，具有典型的本芹特征。西芹主要来源于西方国家，具有植株高大，
茎秆粗大，含水量高，口感脆嫩，香味较淡，抗病能力强，产量高等特点，已经被中国大面积引种
种植，美国‘文图拉’是典型代表。
甘露醇脱氢酶（Mannitol Dehydrogenase，MTD）是植物、细菌、动物体内合成甘露醇的关键酶。
甘露醇是生物体抵抗各种生理、非生理性病害的小分子物质，如植物的抗盐胁迫（苏金 等，1999；
Abebe et al.，2003；Calmes et al.，2013）、抗涝害（Abebe et al.，2003）、抗干旱胁迫和抗冻能力
（Chaturvedi et al.，1996），抗致病性微生物（Chaturvedi et al.，1996），动物的抗病原体（Velez et al.，
2008）、抗氧化能力（Voegele et al.，2004）等。相关研究表明甘露醇代谢在调节植物生长发育（Zamski
et al.，1996）、果实成熟等方面也具有重要作用（Stoop et al.，1996），因此甘露醇相关研究已经在各
种生物中有报道（Pharr et al.，1995；Karakas et al.，1997；Jennings et al.，1998；Conde et al.，2007）。
本研究中以本芹品种‘六合黄心芹’和西芹品种‘文图拉’为材料，分别克隆得到甘露醇脱氢
酶基因，进行序列比对和进化分析，通过实时定量 PCR 技术研究 2 种芹菜该基因的不同组织表达量
情况，以及经 4 ℃低温、38 ℃高温、0.2 mol · L-1 NaCl 盐胁迫、20% PEG 干旱胁迫处理 7 个时间段，
不同芹菜中甘露醇脱氢酶基因非生物胁迫诱导表达情况，以期为深入研究芹菜甘露醇脱氢酶功能研
究提供依据。
1 材料与方法
1.1 菌株、质粒与植物材料
2012 年冬于南京农业大学园艺学院江浦试验园艺场，挖取大田正常生长的‘六合黄心芹’（A.
graveolens‘Liuhe Huangxinqin’）和‘文图拉’（A. graveolens‘Ventura’）芹菜植株，种植于南京农
业大学园艺学院试验大棚，使其安全过冬春化。于 2013 年 5 月在一株成熟的植株上分别取根、茎、
叶、花等材料，进行各部位 RNA 的提取及 cDNA 的合成。
于 2013 年 3 月在南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室人工气候室分别播种 2 种
芹菜，待长到 2 月龄大小时，分别进行 4 ℃低温、38 ℃高温、20% PEG 处理、0.2 mol · L-1 NaCl
处理 0.5、1、2、4、8、12 和 24 h，提取叶片总 RNA 进行反转录成 cDNA，用于实时定量 PCR。
大肠杆菌菌株 DH5α，由本实验室保存；质粒载体 pMD18-T vector、PCR 聚合酶 Ex Taq、各类
限制性内切酶购自大连 TaKaRa 公司。
1.2 RNA 的提取及 cDNA 的合成
采用 RNA simple Total RNA Kit（Tiangen 公司）试剂盒提取实验材料的总 RNA，再用 1.2%的
琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA 的完整性。利用 Prime Script RT reagent Kit（TaKaRa 公司）将提取的
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总 RNA 反转录成 cDNA。cDNA 合成体系的总体积为 20 μL，反应条件及过程为：总 RNA 和 50
μmol · L-1 Oligo（dT）18 混液于 70 ℃水浴 10 min；然后加入 M-MLV 反转录酶（200 U）、dNTP（10
mmol · L-1）、RNase 抑制剂（40 U）（TaKaRa 公司）及灭菌的双蒸水，置于 42 ℃水浴 60 min，最后
于 70℃水浴变性 15 min。
1.3 芹菜甘露醇脱氢酶基因的克隆
根据旱芹（Apium graveolens var. dulce）的甘露糖脱氢酶基因 MTD（AAC61854.1）的 cDNA 序
列作为‘六合黄心芹’和‘文图拉’甘露醇脱氢酶基因克隆引物设计参考序列，设计 1 对引物，上
游 NRX31：5′-ATGGCGAAATCGTCAGAAATTG-3′，下游 NRX32：5′-CTAGGCCCCCAAACTTTCT
TCGG-3′。反应条件为：94 ℃预变性 4 min，然后按照 94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 40 s，72 ℃延伸
1 min 进行 35 个循环，最后 72 ℃延伸 10 min。用 1.2%的琼脂糖凝胶电泳分离 RT-PCR 产物。回收
后的 PCR 产物连接到 pMD18-T 载体上，并转化到大肠杆菌 DH5α。随后进行质粒的酶切与鉴定，
委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行 DNA 测序。
1.4 序列分析
采用 DNAMAN 软件对序列进行多重比较并构建分子系统进化树，同时进行氨基酸疏水/亲水性
鉴定，酸碱氨基酸统计等相关分析，然后用 MEGA5 对进化树进行测试和编辑并生成报告图形
（Tamura et al.，2011）。
1.5 实时定量 PCR 反应和基因表达分析
实时定量 PCR 采用 SYBR Premix Ex Taq 试剂盒（TaKaRa 公司），按照操作说明进行。相对
定量使用参照基因的 ΔCT 法，表达差异等于 2-ΔCT，ΔCT = CT 目标基因–CT actin。相对定量是基于处理和
对照之间，目标基因对参考基因的表达量的比较。采用 iQ™5 software和 iQ™5 Real-time PCR System
完成荧光定量 PCR（Relative quantitative real-time RT-PCR）。以 ACTIN-F：5′-CTTCCTGCCATATA
TGATTGG-3′和 ACTIN-R：3′-GCCAGCACCTCGATCTTCATG -5′为表达检测引物，用芹菜 actin 基
因作为内参基因，与目标基因一起扩增。
根据本研究中克隆的‘六合黄心芹’和‘文图拉’芹菜中扩增 MTD 基因序列分别设计表达检
测上游引物 NRX31BDF1：5′-GAGGCACTATTAATGGTGGGA-3′和下游引物 NRX31BDR1：3′-GAA
CATCTGACTTCACAAGTC-5′。基因表达情况及显著性分析采用Microsoft Excel 2007和 IBM SPASS
20.0 进行。
2 结果与分析
2.1 芹菜甘露醇脱氢基因的克隆
分别以‘六合黄心芹’和‘文图拉’嫩叶的 cDNA 为模板，用引物 NRX31 和 NRX32 扩增出 1
段约 1 000 bp 的扩增产物（图 1）。通过基因克隆及测序分别获得‘六合黄心芹’和‘文图拉’甘露
糖脱氢酶基因序列，2 个芹菜中该基因均含有 1 098 bp 的开放阅读框（Open reading frame，ORF），
编码 365 个氨基酸（图 2）。来源不同的 2 种芹菜核苷酸有 17 处不同（图 3），其中 T/C（六合黄心
芹/文图拉）核苷酸改变有 6 个（131 位、178 位、357 位、370 位、415 位、521 位）。
氨基酸比对表明 2 种芹菜只有 3 个氨基酸不同（图 4），其中在 133 位的核苷酸 T / C（六合黄
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图 1 芹菜甘露糖脱氢酶基因克隆
M：标准分子量；1：六合黄心芹；2：文图拉。
Fig. 1 PCR amplification mannitol dehyrogenase gene from celery
M：Marker；1：Liuhe Huangxinqin；2：Ventura.
心芹/文图拉）改变，导致亮氨酸/苯丙氨酸发
生改变，136 位 C/T 改变，导致丝氨酸/半胱氨
酸改变，357 位核苷酸改变导致异亮氨酸/苏氨
酸发生改变。可见不同来源的芹菜突变主要集
中于同义突变。2 种芹菜的等电点 pI 值分别为
6.79 和 6.78，蛋白质分子量分别为 39.66 kD 和
39.69 kD，酸性和碱性氨基酸数量分析表明，
‘六合黄心芹’和‘文图拉’酸碱性氨基酸都
分别为 61 和 52。
对 2 个芹菜品种甘露醇脱氢酶氨基酸序列
进行亲水性和疏水性分析，2 个品种间亲水性、
疏水性基本一致（图 5）。2 种芹菜亲水、疏水
性氨基酸约各占一半，预测表明芹菜甘露醇脱
氢酶具有亲水性、疏水性双重特性，这为该酶在植物各种抗逆性、调节植物生长发育提供了可能。


图 2 ‘六合黄心芹’甘露醇脱氢酶基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列
* 表示终止密码子。
Fig. 2 Nucleotide acid and deduced amino acid sequences of mannitol dehyrogenase from celery‘Liuhe Huangxinqin’
* Represents the stop codon.

11 期 谭国飞等：芹菜甘露醇脱氢酶基因的分离与表达分析 2193


图 3 两种芹菜甘露醇脱氢酶基因序列比对
Fig. 3 Alignment of gene sequences of mannitol dehydrogenase from two celery cultivars



图 4 两种芹菜甘露醇脱氢酶氨基酸比对
Fig. 4 Alignment of amino acid sequences of mannitol dehydrogenase from two celery cultivars

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图 5 2 种芹菜甘露醇脱氢酶氨基酸序列亲水、疏水性质比较
Fig. 5 Predicted hydrophilic and hydrophobic properties of mannitol dehydrogenase from two celery cultivars

2.2 芹菜甘露醇脱氢酶基因编码的氨基酸序列分析
分析结果显示，2 种芹菜具有 MDR 保守结构域（图 6），属于 MDR 超级家族。2 种芹菜甘露醇脱
氢酶与葡萄（Vitis vinfera XP003635435.1）、草莓（Fragaria vesca XP004288495.1）、香芹（Petroselinum
crispum P42754.1）、黄瓜（Cucumis sativus NP001267599.1）、大豆（Glycine max XP003517258.1）、鹰
嘴豆（Cicer arietinum XP004512561.1）、苜蓿（Medicago truncatula XD003612978.1）等物种的甘露
醇脱氢酶具有很高的相似度。其植物甘露醇脱氢酶氨基酸序列具有高度保守的区域（图 7），相似度
达 81.06%。



图 6 ‘六合黄心芹’甘露醇脱氢酶保守域预测
Fig. 6 Prediction of the conserved domain of mannitol dehydrogenase from celery‘Liuhe Huangxinqin’

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图 7 芹菜甘露醇脱氢酶氨基酸序列的多重比对
Fig. 7 Alignment of amino acid sequences of mannitol dehydrogenase from celery and other different plants
2.3 芹菜甘露醇脱氢酶氨基酸序列的进化分析
如图 8 所示，根据检索结果，选取上述 7 种植物与‘六合黄心芹’和‘文图拉’甘露醇脱氢酶
氨基酸序列进行同源性进化比对，同时增加拟南芥（Arabidopsis thaliana NP195512.1）、酿酒葡萄

图 8 不同物种的甘露醇脱氢酶氨基酸序列的系统进化树
Fig. 8 Phylogenetic tree of amino acid sequences of the mannitol dehydrogenase from several plant species
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图 9 芹菜甘露醇脱氢酶基因在不同组织中的表达水平
Fig. 9 Expression analysis of mannitol dehydrogenase gene in
different tissues of celery
（ Wine grape XP002276703.1 ）、水稻（ Oryza sativa Q10PS6.1 ）、高粱（ Sorghum bicolor
XP002443252.1）、玉米（Zea mays NP001147757.1）、松叶菊（Mesembryanthemum crystallinum
P93257.1）、番茄（Solanum lycopersicum S72477），构建同源进化树，分析它们之间的进化关系。
结果表明：‘六合黄心芹’和‘文图拉’与同属于伞形科的香芹进化关系很近。豆科 3 种作物（大豆、
鹰嘴豆、苜蓿）进化上也归为一个分枝。另外，葡萄科中葡萄与酿酒葡萄，禾本科的水稻、高粱和
玉米，在进化关系上也分别处较近。通过进化关系分析，表明伞形科与禾本科甘露醇脱氢酶进化较
近。
2.4 甘露醇脱氢酶基因在 2 种芹菜不同组织
表达情况
通过实时定量 PCR 检测 2 种芹菜根、茎、
叶、花的甘露醇脱氢酶基因表达情况，结果表
明，2 种芹菜均为根中表达量最高（图 9）。‘六
合黄心芹’中各部位甘露醇脱氢酶基因表达量
为：根 > 茎 > 叶和花。‘文图拉’甘露醇脱氢
酶基因在不同部位表达量为：根 > 叶 > 花 >
茎。
2.5 芹菜叶片甘露醇脱氢酶基因在不同逆境处理下表达情况
从图 10（0 h 基因表达为 1）中可以看出，4 种不同逆境处理 2 种芹菜甘露醇脱氢酶基因表达具
有差异。‘六合黄心芹’在 38 ℃处理 2 h 和 4 h、4 ℃处理 4 h、NaCl 处理 1 h、PEG 处理 1 h 和 8 h
及 12 h 表现出剧烈变化，尤其 PEG 处理 1 h 影响最大，表达量为对照的 96.72 倍，其次为盐处理 1 h
（77.17 倍）。‘文图拉’PEG 处理 2 h 甘露醇基因表达比对照高 37.01 倍，再次为 38 ℃处理 24 h（14.93
倍），再次为盐处理 24 h（12.04 倍）和低温处理 24 h（7.21 倍），其它处理影响不大。


图 10 芹菜甘露醇脱氢酶基因在逆境中的表达水平
Fig. 10 Expression analysis of mannitol dehydrogenase gene in different abiotic stress of celery
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3 讨论
本研究中以本芹品种‘六合黄心芹’与西芹品种‘文图拉’为研究对象，分别克隆出芹菜的甘
露醇脱氢酶基因，对比 2 个芹菜品种的甘露醇脱氢酶基因及编码的氨基酸序列，虽然两者有 17 个核
苷酸位点发生改变，但是大部分属于同义突变，编码的氨基酸序列只有 3 个氨基酸位点发生改变。
可见 2 种地域来源不同的芹菜突变主要集中于同义突变，这对于保持不同地域来源的芹菜甘露醇脱
氢酶的稳定性是有利的，避免了由于核苷酸改变导致氨基酸序列发生过大的变化，从而影响芹菜的
生长发育。
本芹‘六合黄心芹’和西芹‘文图拉’与其它植物甘露醇脱氢酶基因序列、氨基酸序列相比较，
表明不同物种甘露醇脱氢酶基因序列、氨基酸序列高度一致，说明不同植物的甘露醇脱氢酶在进化
上是保守的。构建进化树也表明对于同一科的植物，如伞形科的芹菜与香芹，豆科的大豆、鹰嘴豆
和苜蓿，禾本科的水稻、高粱和玉米等甘露醇脱氢酶进化关系非常接近。从各科的进化关系上看，
伞形科进化更接近于禾本科与十字花科，而与茄科进化上比较远，但从进化树上的长度来看，各科
之间的进化是相对保守的。
植物生长发育过程中，始终处于变化着的环境中，适宜的环境条件能保证植物正常的生长发育，
而恶劣的环境条件则会抑制芹菜的生长发育甚至导致植物死亡。低温、高温、干旱和高盐环境是目
前中国影响蔬菜产量和品质最为明显的环境因子。为了适应这些逆境，植物在生理、生化水平以及
分子细胞水平都有相应的反应，形成完整的抵抗网络系统（Yamaguchi-Shinozaki & Shinozaki，2006）。
逆境胁迫能够诱导多种基因表达，这些基因的表达产物不仅有抗胁迫功能（Mizoi et al.，2012），
还能调节胁迫环境下基因的表达和信号传导（Hasanuzzaman et al.，2000；Nakashima & Yamaguchi-
Shinozaki，2013）。
研究表明，甘露醇脱氢酶对在植物抗逆响应中具有重要的调控作用，在逆境条件下，植物中甘
露醇脱氢酶通过调节合成甘露醇含量，增强植物的抗逆性（Conde et al.，2011；Guo et al.，2012；
Savergave et al.，2013）。例如，橄榄植株受到盐或水胁迫时，其体内甘露醇脱氢酶基因表达会增加
（Conde et al.，2011），在烟草（Solomon et al.，2007）和甘蓝（Calmes et al.，2013）等物种中的
研究也有类似的结果。甘露醇脱氢酶高表达同样能够提高水稻的抗盐能力（张丽 等，2005）。本研
究通过实时定量 PCR 方法，发现 2 种芹菜不同部位的甘露醇脱氢酶基因表达不同，根中表达量最高。
在受到盐胁迫时，2 种芹菜体内的甘露醇脱氢酶基因表达量也表现为增加。但 2 种芹菜对盐胁迫的
甘露醇脱氢酶基因诱导表达是不同的，‘六合黄心芹’在受到盐胁迫 1 h 甘露醇脱氢酶基因表达量
为对照的 77.11 倍，而‘文图拉’在盐处理 24 h 后表达量为最高，表达量为对照的 12.04 倍。另外
本研究中，2 种芹菜在受到低温、高温和干旱胁迫时，甘露醇脱氢酶基因表达量都表现为不同程度
的提高，与盐胁迫类似，‘六合黄心芹’对各种逆境响应均大于‘文图拉’。芹菜生产上需水量大，
具有相对不耐干旱和高温的生物学特性，由 2 种芹菜对逆境的表现对比来看，西芹抗逆性强于本芹
（章镇 2004；张振贤，2009）。本研究中不同逆境处理对 2 种芹菜响应时间上，‘六合黄心芹’响
应时间比‘文图拉’短，这可能与西芹与本芹之间生物特性差异有关。
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