全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（3）：503–511 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2010–11–02；修回日期：2011–03–10
基金项目：国家自然科学基金项目（39870055）；国家重点基础研究发展计划项目（2009CB119102）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zhangdm@ibcas.ac.cn）
感谢潘锦、董玉柱和王宝生博士在实验开展中的指导和帮助！感谢袁军辉、王士泉博士在论文撰写过程中提出诸多宝贵的意见和建议！
同时感谢葛颂研究员对研究过程中所给予的帮助和支持！
芍药野生居群父系分析与遗传结构研究
胡文清 1,2，鲁 衡 1，刘 伟 1，袁俊霞 1，张大明 1,*
（1 中国科学院植物研究所系统与进化国家重点实验室，北京 100093；2中国科学院研究生院，北京 100049）
摘 要：采用 AFLP 分子标记，对中国芍药（Paeonia lactiflora Pallas）代表居群——山西省交城县嵛
岭山居群半同胞家系进行了父本组成、繁殖适合度、花粉散布、代际间遗传多样性水平和空间遗传结构
的分析。9 对引物共得到清晰判读的 AFLP 扩增带 255 条，其中多态性条带 113 条。对半同胞家系的父系
分析结果表明，25 个候选父系亲本在 95%的可信度内检测出总的雄性繁殖贡献率为 78.07%。芍药仅存在
微弱的自交（自交率为 2.25%），花粉散布以 5 m 为中心呈现尖峰分布，最远可达 50 m，平均花粉散布距
离 23 m。亲代的多态性比率（P）为 42.75%，平均 Nei’s 基因多样度指数（He）为 0.1683 ± 0.2083，Shannon
指数（I）为 0.2462 ± 0.2982；子代 P 为 52.94%，He 为 0.1921 ± 0.2055，I 为 0.2855 ± 0.2920。0 ~ 32 m 距
离范围内呈现显著的空间遗传结构。研究结果表明，芍药作为一种异交植物，花粉散布尺度小，受地理
距离的影响显著，花粉散布符合邻近距离散布模式；遗传多样性水平不高，亲本和子代代际之间的遗传
多样性水平差别不明显；近距离范围内存在显著的空间遗传结构。
关键词：芍药；父本分析；花粉散布；遗传结构
中图分类号：S 682.1+2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）03-0503-09

Paternity Identification and Genetic Structure Analysis on the Wild
Population in Paeonia lactiflora Pallas（Paeoniaceae）
HU Wen-qing 1,2，LU Heng1，LIU Wei1，YUAN Jun-xia1，and ZHANG Da-ming1,*
（1State Key Laboratory of Systematic & Evolutionary Botany，Institute of Botany，Chinese Academy of Sciences，Beijing
100093，China；2Graduate School of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China）
Abstract：Paternal identification and constitution，reproductive fitness，pollen dispersal，genetic
diversity levels and genetic distance in the semi-sibling families of a wild population of Paeonia lactiflora
（Paeoniaceae），were analyzed based on AFLP markers. The pedigree between parental and seed
populations was reconstructed，and gene flow，including its obstacles among pollen donors and acceptors
within the population，was revealed. Nine pairs of selective AFLP primers amplified 255 clear bands，
among which 113 were polymorphic. Analysis on the paternity of the semi-sibling families showed that
selfing was as low as 2.25%，and total reproductive fitness with 95% confidence interval was 78.07%. The
pollen dispersal showed a leptokurtic distances around a median of 5 meters（average 23 meters），reaching
a farthest distance of 50 meters. The polymorphic ratio of parental population was 42.75%，the genetic

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diversity index，He，was 0.1683 ± 0.2083，and I was 0.2462 ± 0.2982；whereas P in seed population was
52.94%，He was 0.1921 ± 0.2055，and I was 0.2855 ± 0.2920. The range of genetic distances between the
seeds（2.646–7.937）was slightly wider than that between the parental individuals（3.742–8.062）. The
spatial genetic structure was visible only from 0 to 32 meters. The result showed that P. lactiflora is a strict
out breeding species，but the distance of pollen dispersal was short，being influenced significantly by the
geographic distances，which was accordance to neighbor dispersal model. The genetic diversity of the wild
population was very low，and the genetic diversity level of the parental individuals was similar to that of
the seeds. Merely in short distance the genetic structure was significant.
Key words：Paeonia lactiflora；paternity analysis；pollen dispersal；genetic structure

芍药（Paeonia lactiflora Pallas）属于芍药科芍药属芍药组，其野生居群是栽培品种的主要来源
（郭先锋和王莲英，2007），在我国分布于从四川到甘肃南部、陕西、山西、内蒙古，北达吉林和黑
龙江的广大地区（方文培，1958）。野生芍药根不去栓皮即为“赤芍”（谢成科，1986）。
芍药属是异花授粉植物，虫媒传粉，普遍具有花粉败育（Walters，1942，1962；潘开玉 等，
1999）和胚胎败育现象，种子结实率低，野生居群只有 23.27%的胚珠发育成种子（红雨和刘强，2006），
该属存在染色体结构杂合和减数分裂异常（Walters，1942；Zhang & Sang，1998；潘开玉 等，1999；
Wang & Zhang，2007）。由此看来芍药属的繁育代价很高，但为什么却仍能在进化上长期维系，并
形成地理上相对较为广泛的分布，这些异常的繁育方式对野生居群的遗传结构有何影响，目前尚无
答案。芍药是芍药属中野生居群分布较广，居群规模较大的材料，而且多花，心皮和种子数量较多，
是回答上述问题的理想研究对象。此外，由于环境变迁及人类活动的影响，芍药的野生居群日渐萎
缩，某些地区已经趋于濒危，对其研究具有紧迫性。
本研究中用 AFLP 分子标记对芍药野生居群——山西省交城县嵛岭山居群的半同胞家系进行了
父本组成、花粉散布、代际间遗传多样性水平以及空间遗传结构研究，对野生芍药资源保护、栽培
芍药品种的开发与改良以及栽培起源的探讨均具有十分重要的意义和实用价值。
1 材料与方法
1.1 材料来源
试验材料采自山西省交城县嵛岭山（37°50′N，111°28′E，海拔 1 800 m）野生孤立居群。自 2000
年来共进行了 5 次野外调查，发现成龄开花植株在 30 株左右。2007 年 8 月对该居群全部成龄开花
植株进行了穷尽式采集，取样包括新鲜叶片、全部果实及其种子。获得成龄植株（Y1 ~ Y26）26 个，
作为候选父系亲本（其中 Y15 植株的叶片未获得 DNA），每株所结种子，属于母本相同、父本未知
的半同胞家系。
选择结实最多的植株（编号 Y19，种子达 114 粒）及其种子，作为半同胞家系研究对象。采样
过程中用 GPS 精确定位，并记录每个植株的地理及采样信息。
1.2 方法
成株 DNA 自硅胶干燥的叶片提取，种子 DNA 则从新鲜剥取的种子胚乳中提取。DNA 提取采
用改进的 CTAB 法（Doyle & Doyle，1987）。AFLP 的方法和流程参考 Vos 等（1995）和 Zawko 等
（2001）并做了如下改进：样品总 DNA 的酶切和接头的连接在同一反应中进行，即用 EcoRⅠ和
3 期 胡文清等：芍药野生居群父系分析与遗传结构研究 505

MseⅠ两种酶进行酶切的同时，加入 T4 连接酶进行酶切—连接反应，在 37 ℃反应 6 h 以确保反应完
全；预扩增反应的模板取自 2 μL 酶切连接产物，并作 1︰10 倍的稀释；取预扩增产物 2 μL 按照 1︰
10 倍稀释进行选择性扩增。使用筛选出的 9 对引物组合进行 PCR 选择性扩增：E-ACG/M-GCC，
E-AGA/M-GCC，E-AGA/M-GCG，E-AAC/M-GCC，E-AAG/M-GCC，E-AAG/M-GCG，E-ACC/M-GCG，
E-AGG/M-GCG，E-AGC/M-GCC。
选择性扩增产物用 4%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，电泳功率为 65 W，电泳时间 3 h。染色
采用用银染法（邹喻苹 等，2001），并选择清晰可辨的电泳带，按照条带的有无进行判读，在相同
迁移位置上检测到的条带记作“1”，没有检测到的记作“0”，统计结果以“0/1”矩阵的方式记录，
用作以后的分析。
用 FaMoZ 软件（Gerber et al.，2003）对 AFLP 引物扩增产物所得数据矩阵作标准化处理，以最
大似然分配法（Marshall et al.，1998）对基因型进行分析和判别。在母本已知的情况下，对子代进
行父本分析，通过对 LOD 值（a logarithm of the likelihood ratio）与 LOD 阈值（score threshold）比
较来判定候选父本作为真实父本的可能性。
用 PopGene 1.31（Yeh et al.，1999）软件，分析以下 3 种最常用的遗传多样性参数，并对居群
内亲子代之间的遗传多样性进行评估和比较：多态位点百分数 P（%）=（多态位点数/检测位点总
数）× 100，Nei’s 遗传多样性指数 He（Nei，1987）和 Shannon 多样性指数（I）（Weaver & Shannon，
1959；Lewontin，1972）。
空间自相关方法是研究遗传变异尤其是在小尺度空间范围内遗传结构的一种有效方法（Sokal &
Oden，1978）。在用 GenAlEx 6.1 软件进行的空间自相关分析中，遗传相关系数随距离等级的变化而
变化，95%的置信区间以内是基因型的随机分布，被列为无效假设，95%置信区间通过 999 次模拟
bootstrapping 计算得出。
本研究中所用的 EcoRⅠ和 MseⅠ购自 NEB 公司（美国），T4 Ligase 和 rTaq 由 TaKaRa 公司（日
本）提供，所用接头和扩增引物均由上海生工生物技术有限公司合成。PCR 扩增在 T-personal PCR
仪上进行，聚丙烯酰胺凝胶电泳在 JunYi 公司 JY-CX2B 型（规格为 35 cm × 45 cm）电泳仪上进行。
2 结果与分析
2.1 半同胞父本分析
9 对引物共得到 255 条清晰扩增带，其中多态性条带 113 条。以 FaMoZ 软件进行多态位点分析
得出的 LOD 阈值为 2.96，单父本总的排除概率为 0.944（P < 0.05），双亲总的排除概率为 0.993（P <
0.05）。Y19 植株 114 粒种子（图 1）中，89 粒种子可在 95%显著性水平上（P < 0.05）确定其父本，
占总数的 78.07%。其中仅 2 粒种子由自交产生，自交率为 2.25%。
根据父本分析结果进一步检测每个候选亲本的雄性繁殖适合度。25 个候选父系亲本可在 95%可
信度内，总的雄性繁殖贡献率为 78.07%。所有候选亲本中，有 17 株（占总植株数的 68%）为子代
群体提供了有效花粉。从半同胞家系父本鉴定结果（图 1）可以看出，每朵花中成功授粉的父本数
为 5 ~ 13 个，单个心皮内全部种子检测出 1 ~ 9 个父本不等。值得注意的是，距离母本 Y19 植株最
近的 Y18 植株，作为父本参与到母本植株 4 朵花的成功授粉（16 次），其雄性繁殖贡献率最大
（17.98%）；其次是距离母本植株次近的 Y20 植株，同样作为父本参与到母本植株 4 朵花的成功授
粉（13 次），其雄性繁殖贡献率仅次之（14.61%）；其它父本的繁殖贡献率在 1.12% ~ 8.99%之间，
Y10、Y13、Y17 的繁殖贡献率最低（1.12%）。
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图 1 半同胞家系种子的父本鉴定结果
Y19-1-1 代表母本植株 Y19 第 1 个果实的第 1 个心皮，依此类推，Y1 ~ Y26 为不同父本的编号。
Fig. 1 Seeds of the semi-sibling families and corresponding paternity
Y19-1-1 represents the first carpel of the first follicle on the mother plant Y19，and so on，Y1–Y26 represent the number of different fathers.

图 2 芍药 25 个采样植株分布图与交配格局
线条代表有效花粉流，线条的粗细程度代表有效花粉的数量。
Fig. 2 Sampling distribution and mating system of 25 peony parents
The line represent effective pollen flow，the thickness degree of line represent the number of effective pollen dispersal.

3 期 胡文清等：芍药野生居群父系分析与遗传结构研究 507

图 2 显示所有候选父本的地理分布与交配格局。可以看出，子代花粉的来源并不是均匀的。距
离母本植株最近的候选父本授粉成功率远大于距离相对较远的候选父本，而位于居群靠近边缘的候
选父本植株，繁殖贡献率多为 0。
根据 89 次成功授粉事件，以母本植株 Y19 为中心，将花粉散布的地理距离划分为 10 个等级（间
距 5 m）。其中 87 次异花授粉事件所涉及的 16 个父本植株，与母本植株邻近（≤5 m）的 2 个植株
（Y18 和 Y20）成功授粉 29 次，占 33.3%，距离最近的植株 Y18（与母本植株距离 1 m）成功授粉
次数最多，达 16 次，其余 14 株分布在距离 Y19 植株 5 ~ 50 m 范围内，父本单株成功授粉次数与其
授粉距离（即与母本之间的地理距离）呈弱的正相关（P = 0.02 < 0.05），但与母本植株之间的遗传
距离无相关性（P = 0.11 > 0.05）。除 25 m 的 Y16 植株单株成功授粉次数稍有增加外，自 5 ~ 50 m
成功授粉次数呈现逐级递减的趋势。
2.2 亲子代遗传多样性与遗传距离分析
对全部 9 对引物 255 个位点的分析表明，亲代 P 为 42.75%，He为 0.1683 ± 0.2083，I 为 0.2462 ±
0.2982；子代 P 为 52.94%，He为 0.1921 ± 0.2055，I 为 0.2855 ± 0.2920。亲代遗传多样性略小于子代。
对亲—子代遗传距离的分析中，亲代之间遗传距离分布范围为 3.742 ~ 8.062，平均值为 5.689，
子代之间遗传距离分布范围为 2.646 ~ 7.937，平均值为 5.479。亲—子代的遗传距离分布在较为狭窄
的范围内，亲代之间遗传距离略高于子代间，但统计检验表明，差异不显著（P = 0.835 > 0.05），且
双亲遗传距离对单株成功授粉次数的影响不显著（P = 0.11 > 0.05）。
将雄性繁殖适合度 > 0 的亲本与雄性繁殖适合度 = 0 的亲本的遗传距离进行显著性检验，发现
二者的遗传距离呈现极显著的差异（P < 0.01）。而作为父本的成株个体，它们与母本之间的遗传距
离彼此相差很小。双亲的平均遗传距离为 5.69（SD = 0.572）；除自交产生的两个子代个体的遗传距
离最低，分别为 3.32 和 3.0（平均遗传距离为 3.16，SD = 0.224）之外，其余子代个体与母本之间的
遗传距离平均值为 4.88（SD = 0.644），略低于双亲之间的平均遗传距离。
2.3 居群的空间遗传结构
对居群内亲代的空间遗传结构（SGS）进行空间自相关分析发现，显著的正相关只出现在 32 m
以内的距离等级上。其中在 0 ~ 16 m 范围内，相关系数 r = 0.035，P = 0.01 ≤ 0.01，呈极显著的正
相关；在 16 ~ 32 m 范围内，相关系数 r = 0.015，P = 0.03 < 0.05，呈显著的正相关。而显著的负相
关则出现在 48 m 左右和 112 m 左右，相关系数分别为 r =–0.019，P = 0.01 ≤ 0.01 和 r =–0.117，
P = 0.05 ≤ 0.05。不同地理距离等级区间，居群内部成株个体之间遗传相关值均很低，在 0.95 置信
区间围绕零轴呈现小幅度变化（图 3）。
图 3 居群的空间遗传结构
Fig. 3 The spatial genetic structure of population
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3 讨论
3.1 父本鉴定结果探讨
父系分析是直接估算基因流最常用方法之一（Meagher，1986；Snow & Lewis，1993）。本研究
得到抽样种子的父本鉴定率为 78.07%，与 Krauss 等（2009）以 AFLP 证据对 Banksia hookeriana 家
系得出的鉴定率类似，略高于 Yoichi 等（2009）以 SSR 证据对日本栗 Castanea crenata 3 个家系的
父本鉴定率，明显高于隋心（2009）以 SSR 证据对红松的父本鉴定率，表明显性分子标记与共显性
标记同样是非常有效的父本鉴定工具，运用于父本分析是非常可行的。
21.93%的种子的父本未能鉴定，其原因除了显性标记的缺陷，还由于不同位点选择机制不同而
降低了多位点情况下父本的鉴定率。选择排除了与母本相同的父本等位基因的结合，在多位点时混
淆了真实父本与非父本之间的差异。本研究所得芍药的自交率仅 2.25%，这与 Schlising（1976）、罗
毅波等（1998）、Zhou 等（1999）以及红雨和刘强（2006）通过传粉生物学研究认为芍药属植物是
严格异交植物的结论相吻合。
3.2 亲本交配距离与雄性繁殖适合度
亲本的交配距离受居群大小、居群内个体分布密度、亲本的性选择以及传粉媒介有效传粉能力
等因素的影响（孙亚光和李火根，2007）。本研究中，芍药亲本的雄性繁殖适合度在个体之间存在差
异，这与亲本的交配距离有很大关系。交配距离在 1 ~ 5 m 范围内，总的雄性繁殖贡献率为 32.59%。
特别是位于母本植株最近的开花个体（Y18），其雄性繁殖贡献率最高（17.98%）。随着双亲交配距
离的增加，在 5 ~ 30 m 范围内其雄性繁殖贡献率呈现逐级下降的趋势，到了 30 ~ 35 m 范围内，总
的雄性繁殖贡献率略有增加（13.48%），之后呈下降趋势。这种趋势与一定交配距离范围内的个体
分布密度没有明显的相关性，在 0 ~ 5 m 的交配距离等级上，植株数量虽少却占据了 1/3 的繁殖贡献
率。回归分析进一步证实，亲本的雄性繁殖适合度与双亲的交配距离之间存在弱的正相关（P = 0.02 <
0.05），而与居群内个体分布密度没有显著的相关性（P = 0.201 < 0.05）。由此可以认为，芍药雄性繁
殖适合度与距离成反比，受植株数量的影响程度不大，与芍药本身花粉的散布模式有很大关系。芍
药的交配格局呈现丰富的多样性。
3.3 有效花粉散布模式
芍药虽然是异交植物，但种子主要依靠重力传播，传布距离短，同时花粉粒散布距离亦很近
（Schlising，1976；罗毅波 等，1998），天然居群内个体分布多为聚集式，个体数少，植株距离越
近，成功授粉的概率越大。本研究中根据 89 次成功授粉事件分析发现，超过 1/3 的花粉来自于 5 m
之内，平均传播距离为 23 m。如此短的传粉距离和种子传播距离将导致参与交配的亲本均系近亲，
进而产生遗传距离更近的后代，在居群内形成家系。长期的近亲繁殖，必将导致基因型的纯合现象，
最终致使居群受到近交衰退的严重影响。
3.4 遗传多样性与遗传距离分析
遗传多样性是生物多样性的基础和重要组成部分，正确评价物种及其居群的遗传多样性是有效
保护和利用生物物种资源的必要条件（赵茹 等，2006）。本研究对该居群亲本和种子两个世代的遗
传多样性分析表明，两个世代遗传多样性均处于很低水平（亲代：Nei’s 遗传多样性指数 He = 0.1683，
Shannon 多样性指数 I = 0.2462；子代：Nei’s 遗传多样性指数 He = 0.1921，Shannon 多样性指数 I =
0.2855），且亲代遗传距离平均值（5.689）与子代遗传距离平均值（5.479）大致相等，只是亲本间
3 期 胡文清等：芍药野生居群父系分析与遗传结构研究 509

遗传距离分布（3.742 ~ 8.062）较种子世代偏窄（2.646 ~ 7.937）。
Zona 等（1991）对 8 个 P. lactiflora 居群进行同工酶分析发现，23 个位点中只有 2 个为多态性
位点，显示了芍药 P. lactiflora 的居群遗传多样性普遍较低；周红涛等（2002）用 RAPD 分子标记对
17 株野生植株和 25 株栽培植株的遗传多样性进行分析，结果也显示了较低的遗传多样性水平（Nei’s
遗传多样性指数 He = 0.17）。
本研究得到的结果与前人一致。亲本间、子代间的遗传距离较大，但子代之间的遗传距离，相
对于亲本之间的遗传距离，并无明显降低。统计检验表明，二者差别不显著。对亲本之间遗传距离
与成功授粉次数的回归分析表明，授粉成功率与双亲之间遗传距离大小没有相关性。为何芍药传粉
成功率与父母本之间的地理距离相关，却与遗传距离不相关，作者认为其原因在于芍药传粉存在一
种内在的选择机制，值得进一步深入研究。
3.5 居群的空间遗传结构
一个居群的空间遗传结构（Spatial genetic structure，SGS）揭示该居群内部遗传变异的空间分
布格局，更有利于准确了解该居群的形成过程和机制。对居群 SGS 的研究是当前进化生态与遗传结
构等相关研究中的热点之一（Kalisz et al.，2001；Hardesty et al.，2005；Hardy et al.，2005；周会平，
2008）。
芍药有效传粉距离很近，本研究表明平均距离只有 23 m，其种子主要依靠重力传播，传播距离
亦很近，由此推断，芍药居群应该在整体上存在明显的空间遗传结构。空间自相关的检测表明，芍
药野生居群在整体上并未表现出明显的空间遗传结构，只在 32 m 范围之内存在很弱、但统计上显
著的正相关，以及在 48 m 和 112 m 左右存在一定程度的负显著，相关系数很低（r≤0.05）。空间自
相关的检测中，随着地理距离的增加，相关系数呈下降趋势，32 m 之外，相关系数 r 值多数落在 95%
的置信区间之内，表现出随距离增大而缓慢降低的趋势，此时空间遗传结构缺失，个体呈现随机分
布状态。
Wright（1951）曾提出“距离—隔离”模型，即与“距离”有关的变量会导致空间遗传结构的
产生，其中基因流是“距离”形成的决定因素，包括花粉流和种子流，尤其在居群的空间遗传结构
形成中基因流和交配系统具有决定性（Vekemans & Hardy，2004；Tero et al.，2005；Tim et al.，2007；
Jump & Penuelas，2007）。
本试验结果表明，芍药花粉流是受限制的，花粉传播并非随机，且芍药种子进行脱落式传播，
即重力传播，种子传播距离同样受到限制。限制性的种子流和花粉流形成了芍药天然居群 32 m 内
微弱但统计显著的空间遗传结构。32 m 之外没有空间遗传结构则可以认为是芍药内在的传粉选择机
制所致。
迄今对芍药野生居群的研究，大多是在居群水平之上的比较研究，而本试验通过对芍药野生居
群家系中的子代进行父系分析，进而对小尺度（fine scale）花粉散布、亲—子代遗传多样性以及居
群空间遗传结构进行研究，从而加深了对这一物种交配系统及繁育模式的了解，同时为野生芍药资
源的保护以及栽培芍药品种的开发和改良提供了重要的科学依据。因此，在对日渐萎缩的芍药野生
资源的保护和利用中，有必要尽可能多地掌握芍药野生居群信息，在此基础上监控种质多样性状况，
在原位保护的基础上，人为解除居群间的隔离屏障，促进居群间基因的交流；其次，挖掘其潜在的
利用价值，在进一步分区域开展调查、收集和评价的基础上，将野生种质引进栽培品种，改良芍药
品种，培育出具有优良观赏和药用性状的新品种。今后的研究工作，将野生芍药的基础研究与园艺
工作的开展相结合，研究芍药野生资源的保护、开发和利用的潜力，为我国野生种质资源的研究提
供科学依据。
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