全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（12）：2317–2324 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–08–09；修回日期：2011–10–24
基金项目：国家自然科学基金项目（31000908）；中央高校基本科研业务费专项（XDJK2009C124）；重庆市自然科学基金项目
（2009BB1307，2011BA1002）；西南大学博士基金项目（SWU110009）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：swutql@163.com；swausongm@yahoo.com.cn）
芥菜开花信号整合子的两个核心转录因子 FLC
和 SVP 相互作用的体外检测
汤青林*，许俊强，宋 明*，王志敏
（西南大学园艺园林学院，南方山地园艺学教育部重点实验室，重庆市蔬菜学重点实验室，重庆 400715）
摘 要：为了深入研究调控芥菜开花信号整合子的两个核心转录因子 Flowering Locus C（FLC）和
SHOTR VEGETATIVE PHASE（SVP）的作用机理和进行人工调控，以芥菜‘QJ’为材料，采用 RT-PCR
技术分别扩增 FLC 和 SVP 的编码序列，构建原核表达质粒 pET43.1a-FLC、pET43.1a-SVP，转化宿主菌
大肠杆菌 BL21，通过 SDS-PAGE 检测该蛋白的表达。利用免疫共沉淀原理及 pET43.1a-FLC、pET43.1a-SVP
融合蛋白序列中的 6 × His 标签能与 Ni+结合的特点，对芥菜 FLC 与 SVP 的相互作用进行 SDS-PAGE 检测。
结果表明：FLC 与 SVP 能在体外相互作用并形成复合体，为深入分析 FLC 与 SVP 间的作用机理以及探
讨其与下游开花信号整合子元件的相互作用提供了理论和技术基础。
关键词：芥菜；FLC；SVP；相互作用
中图分类号：S 637.1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）12-2317-08

Determination of Interactions Between the Two Determinant Transcription
Factors of Flowering Signal Integrators in Vitro in Brassica juncea Coss.
（Mustard）
TANG Qing-lin*，XU Jun-qiang，SONG Ming*，and WANG Zhi-min
（College of Horticulture and Landscape Architecture，Southwest University；Key Laboratory of Horticulture Science for
Southern Mountainous Regions，Ministry of Education；Key Laboratory of Olericulture，Chongqing 400715，China）
Abstract：The fate of the flowering signal integrators is determined by Flowering Locus C（FLC）
and SHOTR VEGETATIVE PHASE（SVP），which probably directly interact with each other to regulate
flowering. For further study on mechanism and reagent control of the interactions between the two
transcription factors，the protein interactions in vitro were testified in Brassica juncea Coss.（mustard）
variety‘QJ’. In the present study，the coding sequences of FLC and SVP were amplified，and then inserted
into the expression vector pET43.1a to construct the recombinant plasmids pET43.1a-FLC and
pET43.1a-SVP. After transformation to E. coli（BL21），the expression of recombinant proteins were
detected via SDS-PAGE. With co-immunoprecipitation and characteristic of 6 × His tag in fusion protein
of pET43.1a-FLC and pET43.1a-SVP which could combine with Ni+，a new method was put forward to

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detecting the interactions between FLC and SVP proteins. Using this method，the interactions were
analyzed via SDS-PAGE. The results showed that FLC and SVP could act with each other to combine and
form a complex. This research provides theoretical and technical bases for analyzing the mechanism of
interactions between FLC and SVP，for further probing into interactions between FLC，SVP and
downstream targets of flowering signal integrators.
Key words：Brassica juncea Coss.；FLC；SVP；protein interaction

芥菜（Brassica juncea Coss.）属于典型的种子春化类型。尽管芥菜春化途径、自主途径、光周
期途径和赤霉素途径 4 条开花路径分别受不同的基因网络调控，但最终都汇集到相同的开花信号整
合子，从而调节开花时间（Boss et al.，2004；He & Amassino，2005；Jihyun et al.，2005）。目前拟
南芥开花时间的调控机制研究较为深入，Flowering Locus C（FLC）和 SHOTR VEGETATIVE PHASE
（SVP）是决定开花信号整合子命运的两个特异型核心转录因子（Sheldon et al.，2002；Jeong et al.，
2007），它们能够选择性地与开花信号整合子（例如 SOC1、FT 等基因）的顺式作用元件相互作用，
调控 SOC1、FT 等基因的转录表达（Johannes et al.，2007；Li et al.，2008；Levi et al.，2009）。FLC
和 SVP 均属 MIKC 型 MADS 盒转录调节蛋白（Hartmann et al.，2000；Kerstin et al.，2005；Lee et al.，
2007；Alexandre & Hennig，2008），主要在植物茎尖和根尖分生组织等活跃区域表达，调节开花信
号整合途径（Wigge et al.，2005）。FLC 基因通过对来自 FRI 自主途径和春化途径中信号的反应在拟
南芥成花中起关键作用（Michaels & Amsinor，2001；Sheldon et al.，2006），而 SVP 基因受自主途
径、春化途径、赤霉素途径等调控（Hartmann et al.，2000；Li et al.，2008）。
在拟南芥中，通过 GST 融合技术和免疫沉淀法已经分别证实了 FLC 和 SVP 在体内和体外均存
在相互作用（Li et al.，2008；Jung & Müller，2009），而且推测在十字花科其他植物中该决定开花信
号整合子命运的两个核心转录因子极有可能也存在相互作用，调控开花信号整合子的基因表达。
本研究中拟克隆芥菜开花信号整合子的两个核心转录因子编码基因 FLC 和 SVP，并进行体外表
达和 FLC-SVP 蛋白复合物检测研究，探索两个转录因子作用机制，为调节 FLC-SVP 复合物的锁定
或解聚，决定开花信号整合子的关闭（抑制开花）或开启（促进开花），从而为生产上避免“先期抽
薹开花”，育种上加快品种选育进程，F1 制种上调节父母本花期相遇等深入研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
芥菜材料‘QJ’由重庆市蔬菜学重点实验室提供。种子播种和植株生长均在 RXZ 型智能人工
气候箱中，采用 20 ℃/16 h 光照与 18 ℃/8 h 黑暗的光周期，处理 25 d 后取茎尖于–80 ℃冻存，用
于 RNA 提取。
1.2 引物设计
以拟南芥、油菜 FLC 基因序列（NCBI 登录号分别为 AY850000、AY036889）设计简并引物对
1（FF 和 FR）。FF：5′-CGCGGATCCACAGAAGCCATGGGAAGRAARAAAC-3′，5′为带保护碱基
的 BamHⅠ酶切位点；FR：5′-CGGGGTACCGTGGCTAATWAAGCAGTSGGAGAGT-3′，5′为带保护
碱基的 KpnⅠ酶切位点。
以拟南芥和白菜 SVP 基因序列（NCBI 登录号分别为 AF211171、AY356366）设计特异引物对
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2（SF 和 SR）。SF：5′-CCGGAATTCTTCGTTGTGATGGCGAGAGAAAAGA-3′，5′为带保护碱基
的 EcoRⅠ酶切位点；SR：5′-TTGCGGCCGCATCTCTAACCACCATACGGTAAGCC-3′，5′为带保护
碱基的 NotⅠ酶切位点。
1.3 FLC 与 SVP 基因 cDNA 序列克隆与序列分析
以 TaKaRa RNAiso Reagent 试剂盒提取芥菜茎尖总 RNA，反转录成 cDNA 第 1 条链。并以此作
为扩增模板，采用 TransStart FastPfu DNA Polymerase，分别以引物对 1、引物对 2 扩增芥菜 FLC 和
SVP 基因。PCR 扩增程序均为：95 ℃ 1 min；95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，35 个循环；72 ℃ 5
min。PCR 产物经 1%琼脂糖电泳后，OMEGA Gel Extraction 试剂盒回收 FLC 和 SVP 目的条带，与
pEASY-Blunt Simple Cloning Vector 22 ℃连接 15 min，转化宿主菌 JM109，经菌液 PCR 和酶切鉴定
后挑选正确的克隆送至上海英骏生物技术有限公司测序，并分别命名为 FLC 和 SVP。NCBI 在线 Blast
分析芥菜 FLC、SVP 基因同源性，DNAStar 软件分析同源基因的完整编码区并推导其氨基酸序列，
Vector NTⅠAdvance 软件分析氨基酸序列的分子进化树。
1.4 表达质粒的构建与体外表达
OMEGA Plasmid Miniprep 试剂盒提取 FLC 和 SVP 目的基因质粒，分别经 BamHⅠ/KpnⅠ、
EcoRⅠ/NotⅠ双酶切后定向插入载体 pET43.1a，重组质粒转化大肠杆菌 JM109。提取重组质粒并命
名为 pET43.1a-FLC、pET43.1a-SVP，分别经 BamHⅠ/KpnⅠ、EcoRⅠ/NotⅠ双酶切鉴定和华大基因
公司测序验证。
用质粒 pET43.1a-FLC、pET43.1a-SVP 转化宿主菌 BL21。挑取单菌落，接种于 1 mL 含有 50
μg · mL-1 氨苄青霉素的 LB 液体培养基，37 ℃振荡培养过夜。次日，过夜培养物按 1︰100 扩大培养，
当 OD600 在 0.8 ~ 1.0 时加入 IPTG，按照 L9(34)正交设计筛选融合蛋白表达条件（表 1）。

表 1 IPTG 诱导原核表达条件的正交设计表
Table 1 L9(34) orthogonal layout of IPTG induction condition
编号
No.
因素
Factor
A 温度/℃
Temperature
B 浓度/（mmol · L-1）
Concentration
C 时间/h
Time
1 A1B1C1 22 0.1 1
2 A1B2C2 22 0.5 2
3 A1B3C3 22 1.0 4
4 A2B1C3 25 0.1 4
5 A2B2C1 25 0.5 1
6 A2B3C2 25 1.0 2
7 A3B1C2 30 0.1 2
8 A3B2C3 30 0.5 4
9 A3B3C1 30 1.0 1

1.5 FLC 与 SVP 相互作用的体外检测
由 1.4 中确定的最佳条件培养含有 pET43.1a-SVP 的 BL21（DE3），并按 TOYOBO Mag Extractor-
His-tag–蛋白纯化试剂盒说明纯化其体外表达的重组蛋白产物。参照免疫共沉淀法鉴定相互作用蛋
白质原理，诱导表达蛋白 pET43.1a-SVP 作为诱饵蛋白，以优化的诱导条件表达 pET43.1a-FLC 作为
靶蛋白。靶蛋白和诱饵蛋白的制备、Ni+剩余的假阳性检测以及两者相互作用的检测参考杨洋等
（2009）和牛义等（2009）的方法。蛋白提取液稍有改动：30 mmol · L-1 Tris-HCl（pH 7.5），75 mmol · L-1
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NaCl，1% Triton X-100，10%丙三醇，5 mmol · L-1 维生素 C，2.5 mmol · L-1 偏重亚硫酸钾，1 mmol · L-1
PMSF，10 μg · mL-1 亮肽素，10 μg · mL-1 抑肽酶，1 μg · mL-1 胃蛋白酶抑制剂。
2 结果与分析
2.1 FLC 与 SVP 基因克隆与序列分析
以引物对 1（FF 和 FR）首次从芥菜中扩增的 FLC 片段为 625 bp，含完整编码区，从起始子到
终止子共编码 197 个氨基酸，理论等电点为 5.75，属于 MIKC 型 MADS 域蛋白，其中 MADS 结构
域位于第 12 位氨基酸到第 62 位氨基酸之间，K 结构域位于第 114 位氨基酸到第 167 位氨基酸之间。
NCBI 网上比对：FLC 与白菜（Brassica campestris ssp. chinensis）、油菜（Brassica napus）、甘
蓝（Brassica oleracea var. capitata）和拟南芥（Arabidopsis thaliana）的 FLC 同源性分别高达 95%、
94%、90%和 88%，表明确实克隆到了芥菜 FLC 目的基因。由于克隆的芥菜 FLC 与油菜 5 个 FLC
等位基因（BnFLC1、BnFLC2、BnFLC3、BnFLC4、BnFLC5，NCBI 登录号分别为 AY036888、AY036889、
AY036890、AY036891、AY036892）同源性分别为 87%、94%、90%、93%、88%，其中与 BnFLC2
同源性最高，因此本试验应该克隆到了芥菜 FLC2。
分子进化分析（图 1）发现：FLC 与 BnFLC2（NCBI 登录号为 AY036889）、BrFLC（NCBI 登
录号 AY308848）、BnFLC4（NCBI 登录号 AY036891）亲缘关系较近，但均比这三者多编码 1 个氨
基酸。











图 1 FLC 分子进化树分析
At：拟南芥；Bn：油菜；Br：白菜；Bo：甘蓝；Bj：芥菜。
Fig. 1 Phylogenetic tree of FLC
At：Arabidopsis thaliana；Bn：Brassica napus；Br：Brassica campestris；Bo：Brassica oleracea；
Bj：Brassica juncea.

以引物对 2（SF 和 SR）首次从芥菜中扩增的 SVP 片段为 757 bp，含完整编码区，编码 241 个
氨基酸，理论等电点为 5.57，也属于 MIKC 型 MADS 域蛋白，其中 MADS 结构域位于第 13 位氨基
酸到第 62 位氨基酸之间，K 结构域位于第 96 位氨基酸到第 173 位氨基酸之间。NCBI 网上比对：
SVP 与菜薹（Brassica campestris var. utilis Tsen et Lee）、花椰菜（Brassica oleracea var. botrytis）和
拟南芥（Arabidopsis thaliana）的 SVP 同源性分别高达 99%、97%和 88%，表明确实克隆到了芥菜
SVP 目的基因。分子进化分析（图 2）发现：SVP 与 BrSVP（NCBI 登录号 AY356366）亲缘关系较
近。
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图 2 SVP 分子进化树分析
At：拟南芥；Br：白菜；Bj：芥菜。
Fig. 2 Phylogenetic tree of SVP
At：Arabidopsis thaliana；Br：Brassica campestris；Bj：Brassica juncea.

2.2 表达质粒的构建与鉴定
构建的表达质粒 pET43.1a-FLC 经 BamHⅠ/KpnⅠ双酶切可得到 600 bp 左右条带，pET43.1a-SVP
经 EcoRⅠ/NotⅠ双酶切可得到 750 bp 左右条带。表达质粒送华大基因公司双向测序，结果 FLC、
SVP 插入 pET43.1a 载体的位点和方向完全正确。
2.3 重组蛋白的诱导表达与 SDS-PAGE 检测
表达产物的 SDS-PAGE 结果显示，有 pET43.1a-FLC（图 3）、pET43.1a-SVP（图 4）重组蛋白
表达的特异带出现，其蛋白质相对分子量均与预期值相符，而空载体（图 3、图 4 泳道 1 中标注 a
为空载体表达条带）或未诱导的重组子菌液不见此条带。由此表明表达质粒 pET43.1a-FLC 和
pET43.1a-SVP 均构建正确，且融合蛋白在大肠杆菌中正确表达。

图 3 融合蛋白 pET43.1a-FLC 不同诱导条件的筛选（3-A）与蛋白纯化（3-B）SDS-PAGE 电泳图谱
M：蛋白质分子量标记 B（TaKaRa）；1：空载体诱导对照（a 为 pET43.1a）；
2 ~ 10：不同 IPTG 诱导条件对应表 1 中 1 ~ 9（b 为 pET43.1a-FLC）；
11：未诱导对照；A、B、C 分别表示未诱导、
优化条件下诱导、pET43.1a-FLC 纯化。
Fig. 3 Selection of expression condition（3-A）and protein purification（3-B）
on fusion protein pET43.1a-FLC
M：Protein marker B（TaKaRa）；1：Induction control of pET43.1a；
2–10：Different induction condition of pET43.1a-FLC mentioned in Table 1；
11：Non-induction control；A，B，C respectively represent non-induction，
induction under optimum condition and
purification of pET43.1a-FLC.
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图 4 融合蛋白 pET43.1a-SVP 不同诱导条件的筛选（4-A）与蛋白纯化（4-B）SDS-PAGE 电泳图谱
M：蛋白质分子量标记 B（TaKaRa）；1：空载体诱导对照（a 为 pET43.1a）；
2 ~ 10：不同 IPTG 诱导条件对应表 1 中 1 ~ 9（b 为 pET43.1a-SVP）；
11：未诱导对照；A、B、C 分别表示未诱导、优化条件下诱导、
pET43.1a- SVP 纯化。
Fig. 4 Selection of expression condition（4-A）and protein purification（4-B）on fusion protein pET43.1a-SVP
M：Protein marker B（TaKaRa）；1：Induction control of pET43.1a；2–10：Different induction
condition of pET43.1a-SVP mentioned in Table 1；11：Non-induction control；
A，B，C respectively represent non-induction，induction under optimum
condition and purification of pET43.1a-SVP.

另外，各泳道之间重组蛋白的表达量差异较大，说明 IPTG 浓度和诱导温度对该蛋白表达量有
影响。pET43.1a-FLC 以 0.1 mmol · L-1 IPTG 在 25 ℃诱导 4 h 时目标蛋白（图 3，泳道 5 标注 b 之处）
表达量最高；而 pET43.1a-SVP 以 0.5 mmol · L-1 IPTG 在 30 ℃诱导 4 h 时目标蛋白（图 4，泳道 9 标
注 b 之处）表达量最高。采用 TOYOBO Mag Extractor-His-tag–蛋白纯化试剂盒分别纯化体外表达
的融合蛋白 pET43.1a-FLC（图 3，泳道 C）和 pET43.1a-SVP（图 4，泳道 C），均可得到目标条带。
2.4 FLC 与 SVP 相互作用的体外验证
2.4.1 Ni+剩余检测
为排除相互作用检测过程中可能由于 Ni+没有完全与 pET43.1a-SVP 结合，使得剩余的 Ni+又与
pET43.1a-FLC 结合而带来假阳性结果的问题，设置了 6 个 Ni+梯度。
结果表明：加入 5 和 10 μL MagneHis Ni-Particles 时未见 pET43.1a-FLC 融合蛋白条带，说明 Ni+
完全与 pET43.1a-SVP 结合，而加入 15、20、25 和 30 μL MagneHis Ni-Particles 时就会同时出现
pET43.1a-SVP 和 pET43.1a-FLC 融合蛋白条带，说明过量的 Ni+与 pET43.1a-FLC 结合。
因此确定以 50 mL pET43.1a-SVP 表达菌液，细胞破碎后 4 mL 去离子水重悬。取 0.6 mL 融合蛋
白 pET43.1a-SVP 重悬液，加入 10 μL Ni+为基准进行下一步试验。
2.4.2 电泳检测
将孵育产物和纯化的 pET43.1a-FLC、pET43.1a-SVP，以及对照（Ni+剩余检测的产物）一起电
泳（图 5）。
Ni+磁珠与 pET43.1a-SVP 融合蛋白结合后得到 50 μL Ni+磁珠悬浮液，取其中 20 μL 悬浮液与 300
μL pET43.1a-FLC 上清液室温孵育 2 min 的电泳结果见图 5 泳道 1，只有 pET43.1a-SVP 融合蛋白条
带，没有 pET43.1a-FLC 融合蛋白带，说明 Ni+全部与 pET43.1a-SVP 结合。
剩余 30 μL 悬浮液与 300 μL pET43.1a-FLC 上清液 4 ℃孵育 2 h 后的电泳结果见图 5 泳道 2，既
有 pET43.1a-SVP 融合蛋白条带也有 pET43.1a-FLC 融合蛋白条带，而对照（泳道 1）中没有 pET43.1a-
FLC 融合蛋白条带，说明 FLC 与 SVP 结合并随 Ni+磁珠一起沉淀下来，进而证实了两者间的相互作
用。
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图 5 pET43.1a-FLC 与 pET43.1a-SVP 相互作用的 SDS-PAGE
M：蛋白质分子量标记；1：Ni+剩余检测；2：pET43.1a-FLC 与 pET43.1a-SVP 孵育产物；
3：纯化的 pET43.1a-FLC；4：纯化的 pET43.1a-SVP。
Fig. 5 SDS-PAGE of the interaction of pET43.1a-FLC and pET43.1a-SVP
M：Protein molecular marker；1：Test of the rest Ni+ as control；2：pET43.1a-FLC was incubated
with pET43.1a-SVP；3：Purified pET43.1a-FLC；4：Purified pET43.1a-SVP.
3 讨论
本试验中参照免疫共沉淀法鉴定蛋白质相互作用的原理（贺福初 等，2004），巧妙利用了
pET43.1a-SVP融合蛋白序列中的6 × His标签能与Ni+结合的特性，将结合后的复合物作为诱饵蛋白，
把体外表达的 pET43.1a-FLC 融合蛋白溶于适于相互作用的缓冲液中作为靶蛋白，两者在 4 ℃条件
下孵育后，利用 pET43.1a-SVP上结合的Ni+与磁力架吸附性将诱饵蛋白与靶蛋白的复合体纯化出来，
并经 SDS-PAGE 发现了两条目标蛋白，从而证明芥菜 FLC 与 SVP 蛋白存在相互作用。
在本试验中 FLC 与 SVP 结合产物纯化过程经过了 3 次洗涤，仍能检测到两者的相互作用，表
明 FLC 与 SVP 之间的相互作用并不是瞬间发生，而应是两者结合并形成了稳定的复合体。与免疫
共沉淀法鉴定蛋白质相互作用相比，本方法不需要制备抗体，简化了操作，避免了因抗体特异性不
强可能带来的假阳性结果。
根据所克隆的芥菜 FLC 基因的编码氨基酸序列，预测蛋白质的相互作用（http：//string.embl.de/）：
发现 FLC 蛋白与 SVP、FRI、FLD、ATX1、SIZ1、VIN3、FCA、VRN2、VRN1、FLK 共 10 个蛋白
存在不同程度的相互作用。其中与 SVP 蛋白相互作用的预测值（evidence view）最高，达 0.999。
这与本试验在芥菜 FLC 与 SVP 体外存在相互作用的研究结果一致，同时与 Li 等（2008）在拟南芥
FLC 和 SVP 体内外存在相互作用的结果也相吻合。

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