全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (11) : 1581 - 1588
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 07 - 03; 修回日期 : 2009 - 09 - 21
基金项目 : 英东青年教师基金项目 (111024) ; 山东省科技攻关项目 (2008GG10009011)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: haoyujin@ sdau1edu1cn)
M dMYB1转录因子调控红星苹果果实着色的计算
机模拟分析及表达验证
张华磊 1, 2 , 毛　柯 1, 2 , 刘　志 2, 3 , 谢兴斌 1, 2 , 冯晓明 1, 2 , 郝玉金 1, 23
(1山东农业大学作物生物学国家重点实验室 , 山东泰安 271018; 2山东农业大学园艺科学与工程学院 , 山东泰安
271018; 3辽宁省果树科学研究所 , 辽宁熊岳 115009)
摘 　要 : 从 ‘红星 ’苹果 (M alus dom estica‘Delicious’) 果实中克隆获得了 M dM YB 1基因 , 通过生物
信息学分析 ( in silico analysis) 和活体细胞融合蛋白荧光观察 , 确定其编码蛋白定位于细胞核。同时 , 克
隆了 M dD FR和 M dU FGT基因的启动子 , 模拟分析表明 2个基因的启动子序列中含有 MYB结合的顺式作用
元件。为了探讨 MdMYB1转录因子是否调控 M dD FR和 M dU FGT基因的表达 , 对不同光照条件下果皮花青
素含量和基因表达进行了检测 , 结果表明光照能够诱导花青素积累 , 并迅速启动 3个基因表达 , 且 3个基
因表现出高度相似的表达模式 , 表明 MdMYB1转录因子可能直接调控 M dD FR和 M dU FGT基因的表达。
关键词 : 苹果 ; 果实 ; 着色基因 ; 光诱导 ; 表达分析
中图分类号 : S 66111　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 1121581208
In silico Ana lysis and Expression Conf irma tion of the Regula tion of Fru it
Colora tion by Tran scr iptiona l Factor M dM BY1 in D elic ious Apple
ZHANG Hua2lei1, 2 , MAO Ke1, 2 , L IU Zhi2, 3 , X IE Xing2bin1, 2 , FENG Xiao2m ing1, 2 , and HAO Yu2jin1, 23
(1 S ta te Key Laboratory of C rop B iology, Shandong A gricultural U niversity, Taipian, Shandong 271018, Ch ina; 2 College of
Horticulture Science and Engineering, Shandong A gricultural U niversity, Taipian, Shandong 271018, China; 3L iaon ing Institu te of
Pom ology, X iongyue, L iaoning 115009, Ch ina)
Abstract: In this study, M dM YB 1 was cloned from Delicious app le. It was found thatMdMYB1 p rotein
was localized in nucleus indicated by in silico p redication and GFP fusion p rotein fluorescence observation. In
parallel, the p romoter regions ofM dD FT and M dU FGT were isolated and analyzed in silico. The result showed
that both p romoters contained cis2elements characterized as MYB binding sites. Furthermore, to exam ine if
MdMYB1 triggers the exp ression ofM dD FR and M dU FGT during fruit coloration, anthocyanin content, exp res2
sion levels ofM dM YB 1, M dD FR and M dU FGT were investigated. The results demonstrated that light exposure
markedly induced anthocyanin accumulation in fruit peel, along with a rap id initiation of gene exp ression.
Interestingly, three genes were exp ressed in a highly sim ilar pattern. In one word, our findings suggest that
transcrip tion factorMdMYB1 may directly regulate the exp ression ofM dD FR and M dU FGT genes.
Key words: app le; fruit; coloration gene; light induction, exp ression analysis
花青素主要通过类黄酮途径合成 (Holton & Cornish 1995; Stintzing & Carle, 2004) , 并受环境和
发育信号的影响。现在已经知道 , 植物感应各种信号后 , 通过一个复杂的信号传导网络感应和传递各
种信号 , 其中 WD40 - MYB2bHLH转录因子复合体等在花青素生物合成中起核心作用 , 调控花青素合
成相关结构基因的表达 , 导致果实和花等器官的不同颜色 ( Stracke et al. , 2001)。
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苹果果实花青素必须在光下才能进行生物合成 ( Saure, 1990; Lancaster, 1992; Ju et al. , 1995;
Dong et al. , 1998; W eiss, 2000)。MYB蛋白是植物转录因子中最大的家族之一 , 目前已从拟南芥、
水稻、玉米和棉花中分别鉴定了大量的 M YB 基因 ( Rabinowicz et al. , 1999; Cedroni et al. , 2003;
Chen et al. , 2006)。在众多 M YB 基因中 , 有些参与调控花青素合成 , 如 A tPA P1和 A tPA P2调节拟南
芥种皮中的花青素合成 (Borevitz et al. , 2000) , C1调控玉米胚乳的花青素合成 (Cone et al. , 1986) ,
PhM YBAN 2调控矮牵牛花中的花青素合成 (Quattrocchio et al. , 1999)。在果树中 , 葡萄 VvMYBA1和
VvMYBA2通过调节 VvU FGT的表达影响果实着色 ( Kobayashi et al. , 2004; W alker et al. , 2007) ; 草
莓 FaMYB1可以抑制转基因烟草的花青素合成 (Aharoni et al. , 2001) ; 在苹果中 , 目前已经克隆的
着色相关 MYB类转录因子基因有 M dM YB 1、M dM YB 10和 M dM YBA等 ( Takos et al. , 2006; Ban et al. ,
2007; Esp ley et al. , 2007) , 这些转录因子在光诱导的苹果果实着色中起着重要调控作用。
在苹果中 , 与果实着色相关的多个 MYB转录因子基因及其下游结构基因的启动子都已被克隆。
对这些基因进行比对分析有利于对果实着色调控分子机理的认识 , 但在已经发表的报告中 , 这些基因
或启动子克隆自不同苹果种或品种 , 不利于进行精确的比较分析。鉴于此 , 本研究中利用红星苹果为
材料 , 克隆 M YB 基因和结构基因启动子序列 , 通过比对分析鉴定不同 M YB 基因的亲缘关系 ; 通过表
达分析初步判定 MYB转录因子与下游结构基因 D FR和 U FGT表达的相关性。该研究有助于认识光诱
导果实着色的分子机理 , 并对利用基因工程对相关性状 (如果色、功能成分含量等 ) 进行分子改良
具有指导意义。
1　材料与方法
111　材料
选山东省曲阜市市郊果园 21年生 ‘红星 ’苹果树 (M alus dom estica Borkh. ‘Delicious’) , 果实生
长期套袋 , 成熟期 (2008年 9月中旬 ) 去袋后在自然光下着色。取见光 0、24、48、72、96和 144 h
的果实削取果皮 , 用液氮速冻保存于 - 80 ℃, 用于提取 RNA, 同时取幼叶冷冻后用于提取 DNA。
112　总 RNA提取和 cD NA克隆
用改良 CTAB法提取总 RNA (Chang et al. , 1993) , 用反转录试剂盒 PrimeScrip tTM 1ST Strand cDNA
Synthesis Kit ( TaKaRa) 合成 cDNA。根据 GenBank中登录的苹果 MdMYB1 (DQ886414) 编码框和
UTR序列设计特异引物。上游引物 M12F: 5′2TATGAAGTGGGTAGCAGGCA23′, 下游引物 M12R: 5′2
ATCCCACATTTACAAGCAAGG23′。以 cDNA为模板进行 PCR扩增 : 94 ℃ 5 m in; 94 ℃ 45 s, 58 ℃ 45
s, 72 ℃ 90 s, 32个循环 ; 72 ℃延伸 10 m in。PCR产物电泳检测后回收 , 与 pMD182T载体 ( TaKa2
Ra) 连接 , 构建重组质粒 pMD2MdMYB1, 转化大肠杆菌 DH5α, 筛选阳性克隆 , PCR确认后测序。
113　D NA提取和启动子克隆
以 ‘红星 ’幼嫩叶片为试材 , 采用改良 CTAB法 (傅荣昭 等 , 1994) 提取 DNA。根据苹果 M d2
D FR和 M dU FGT基因 (DQ886412和 DQ886413) 的启动子序列设计引物。M dD FR基因启动子的上游
引物为 dfrp2f: 5′2ATTATCAAACGAAACACCCAACC23′, 下游引物 dfrp2r: 5′2ATCTCAGCTTCCAGGG
CATCA23′; M dU FGT基因启动子的上游引物 ufgtp2f: 5′2ATGATTGTTGACCTCAGCAGG23′, 下游引物
ufgtp2r: 5′2GAAAAGGAGTTGAATAGAAGTAGCA23′, 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以
DNA为模板进行 PCR扩增。扩增程序 : 94 ℃ 5 m in; 94 ℃ 45 s, 56 ℃ 45 s, 72 ℃ 90 s, 30个循环 ;
72 ℃延伸 10 m in。
114　花青素测定
花青素测定参考仝月澳和周厚基 (1982) 的方法 , 将果实洗净后擦干取皮 , 果皮剪碎后采用 115
mol·L - 1 HCl ∶95%乙醇 = 15 ∶85 (体积比 ) 混合液 , 在黑暗条件下浸提 24 h。浸提液用 TU21900双
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光束可见分光光度计检测 535 nm波长的光密度值。
115　M dM YB 12G F P融合载体的构建、洋葱表皮细胞的基因枪转化和荧光观察
利用引物 M12F1和下游引物 5′2TCGGGATCCCTTCTTCTTTTGAATGATT23′(下划线碱基为 B am H
Ⅰ酶切位点 ) 扩增 M dM YB 1基因后 , 将该基因插入 pB IN : : GFP载体中 CaMV 35S启动子下游、GFP
基因下游 , 获得表达载体 35S: : M dM YB 12GFP , 利用 B iolistic PDS21000 /He Particle Delivery System包
埋质粒 (安千里 等 , 2001)。采用 B io2Rad PDS21000 /He基因枪 (美国 ) 遗传转化洋葱表皮 , 可裂膜
压力为 111 kPa, 洋葱表皮 (约 1 cm ×1 cm) 放在 MS培养基上 , 至可裂膜距离为 7 cm , 真空度达到
2815 inches Hg后轰击洋葱表皮 , 然后在 22 ℃暗培养 16～24 h, 制片后用激光共聚焦显微镜 (Leica
M i2crosystem , 德国 ) 观察细胞中的绿色荧光。
116　M dM YB 1、M dD FR和 M dU FG T基因表达的实时定量 PCR分析
M dM YB 1的上下游引物分别为 MYB12F: 5′2CCCAGCATTGAGTTAGAGGAAGA23′和 MYB12R: 5′2
CCAAAGGTCCGTGCTAAAGG23′; M dD FR 的上下游引物分别为 DFR2F: 5′2CCCCGAATACAATATAC2
CCACAA23′和 DFR2R: 5′2GAACTCAAACCCTATCTCCCTCAA23′; M dU FGT的上下游引物分别为 UFGT2
F: 5′2AATGCTTACAGTCCGGTGCAG23′和 UFGT2R: 5′2CAAGAGCCAGCCCGAAAA23′; M d18sRNA 为内
标基因 , 上下游引物分别为 18 s2F: 5′2CGGCGGGTGTTACTTTTAGG23′和 18 s2R: 5′2GTTTCAGCCTT2
GCGACCATAC23′。
采用见光着色不同时间的果皮 cDNA为模板 , 对各个基因进行荧光定量 PCR分析。采用 SYBR
Green I荧光染料法 , 根据 SYBR Prem ix ExTaqTM ( Perfect Real Time) 试剂盒 ( TaKaRa公司 ) 操作说
明配制反应体系 , 每个样品设 3个重复。反应体系含 cDNA 1μL、上下游引物 ( 5μmol·L - 1 ) 各
1μL、215 ×RealMasterM ix/20 ×SYBR Solution 10μL、 ddH2 O 7μL, 总体积为 20μL。反应程序为
95 ℃变性 10 s, 56 ℃ 30 s, 72 ℃ 20 s, 40个循环。
数据处理采用 2 -ΔΔCT算法 (L ivak & Schm ittgen, 2001 ) , 其 ΔΔCT = ( CT,M dM YB1 - CT, 18 s ) Time x
(CT,M dM YB1 CT, 18 s ) Time 0。CT,M dM YB1和 CT, 18 s分别是目标基因 M dM YB 1和内参基因 18sRNA的 CT值 ; Time
x和 Time 0分别指处理的不同时间点 (摘袋后自然光诱导着色 24、48、72、96和 144 h) 和对照
(摘袋 0 h)。
117　生物信息学分析方法
氨基酸序列比对采用软件为 DNAMan, 蛋白功能保守域分析采用 NCB I数据库 ( http: ∥
www1ncbi1nlm1nih1gov/ ) , 亚细胞定位预测采用 PLOC 数据库 ( http: ∥www1genome1 jp /SIT/p loc2
dir/ ) , 基因启动子顺式作用元件分析采用 PLACE 数据库 ( http: ∥ bioinformatics1p sb1ugent1be /
webtools/p lantcare /htm l/ ) 的在线分析功能。
2　结果与分析
211　苹果果实着色相关 MY B转录因子的序列分析与亚细胞定位
在苹果中 , 目前已经有 3个 MYB类转录因子基因得到克隆 , 它们分别是从 ‘Cripp s Pink’苹果
中克隆的 M dM YB 1 (DQ886414; Takos et al. , 2006)、从 ‘Red Field’红肉苹果中克隆的 M dM YB 10
( EU518248; Esp ley et al. , 2007 ) 和从 ‘津轻 ’苹果中克隆的 M dM YBA (AB279598; Ban et al. ,
2007)。通过对这 3个已发表基因编码的氨基酸序列进行比对 , 发现 M dM YB 1和 M dM YBA氨基酸序列
完全相同 , M dM YB 1与 M dM YB 10只有 3个氨基酸序列不同 , 同源性高达 99159% , 说明这 3个基因
是在不同苹果品种中的等位基因。
为了进一步分析着色相关 M YB 基因的功能和表达特性 , 从 ‘红星 ’苹果中克隆了 M dM YB 1基
因 , M dM YB 1 cDNA长为 865 bp, 开放阅读框 (ORF) 为 732 bp, 可编码 243个氨基酸 , 5′端非编码
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区长 56 bp , 3′端非编码区长 77 bp。核酸序列同源性比较发现 , ‘红星 ’M dM YB 1基因与 ‘Cripp s
Pink’苹果 MdMYB1 (DQ886414) 的同源性高达 98177% , 表明该基因序列正确 , 是在 ‘红星 ’中
的等位基因。另外 , 氨基酸序列分析发现 , 该基因编码的氨基酸序列具有 MYB类转录因子家族成员
的典型特征 : 高度保守的 R2和 R3结构域以及 1个与 bHLH蛋白结合的 ID结构域 (图 1)。
图 1　M dMY B1蛋白的功能域分析
灰色背景部分为 ID基序。
F ig. 1　The con served doma in s of M dMY B1 prote in
ID motif p rofile was highlighted with gray background.
蛋白的亚细胞定位可以为预测其功能提供信息 , 故本研究对 MdMYB1蛋白的亚细胞定位进行了
预测和验证。首先 , 采用电子数据库在线分析其功能 ( http: ∥www1genome1 jp /SIT/p locdir/ ) , 结果
表明 MdMYB1蛋白定位于细胞核中。为了证明 MdMYB1蛋白在活体细胞中的定位情况 , 构建了 Md2
MYB12GFP融合蛋白的植物表达载体 , 将该载体通过基因枪介导法导入洋葱表皮细胞 , 激光共聚焦显
微镜观察发现 , CaMV 35S 启动子驱动的 GFP荧光 (对照 ) 充满了整个洋葱表皮细胞中 , 而 Md2
MYB12GFP融合蛋白荧光只存在于细胞核内 (图 2) , 表明 MdMYB1蛋白定位于细胞核。
图 2　M dMY B12GFP融合蛋白定位于细胞核
35S: : GFP为组成型 GFP表达载体 , 作为阳性对照 , 荧光充满整个细胞 ;
35S: : M dM YB 12GFP为融合蛋白表达载体 , 融合蛋白
荧光只发生在细胞核 (箭头所指 )。
比例棒长度为 69μm。
F ig. 2　M dMY B12GFP fusion prote in wa s loca lized in nucleus ( bars = 69μm )
35S: : GFP was the constitutive exp ression construct using as for positive control. GFP fluorescence
was full of the whole cell. 35S: : M dM YB 12GFP was the construct for fusion p rotein.
MdMYB12GFP fluorescence appeared only in
nucleus as indicated by arrowheads.
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　11期 张华磊等 : MdMYB1转录因子调控红星苹果果实着色的计算机模拟分析及表达验证 　
212　M dD FR和 M dU FG T基因启动子的克隆与序列分析
作为控制花青素合成的结构基因 , M dD FR和 M dU FGT可能受转录因子 MdMYB1的调控。为了预
测这种调控作用 , 以 ‘红星 ’苹果基因组 DNA为模版 , 克隆了 M dD FR 和 M dU FGT基因的启动子 ,
长度分别为 1 145 bp和 1 674 bp。
如果 M dD FR和 M dU FGT基因受 MdMYB1转录因子直接调控 , 则其启动子序列中应该具有识别或
结合 MYB转录因子的顺式作用元件。为了验证这种假设 , 采用 PLACE数据库 ( http: ∥bioinformat2
ics1p sb1ugent1be /webtools/p lantcare /htm l/ ) 提供的在线分析功能 , 对两个基因的启动子序列进行分
析。结果表明 , 两个基因的启动子序列中均含有 MRE、MBS或 MBSI等 MYB识别顺式作用元件 (图
3, A、B ) , 其中 MRE是与光响应有关的 MYB结合位点 , MBS是干旱诱导响应相关的 MYB结合位
点 , MBSI是类黄酮合成调控相关的 MYB结合位点。
图 3　M dD FR ( A) 和 M dU FGT ( B) 基因启动子的顺式作用元件
F ig. 3　The cis2elem en ts of M dD FR ( A) and M dU FG T ( B) prom oters
213　不同光照条件下 M dM YB 1、M dD FR和 M dU FG T基因的共表达分析
将摘袋的成熟果实进行自然光着色处理后 , 对着色果实的果皮花青素含量进行测定 , 结果表明 ,
摘袋后的第一天花青素含量变化很小 , 24 h后增加明显 , 随着自然光处理时间的增加 , 花青素含量
逐渐增加 , 到 144 h时花青素达到初始含量的 10倍左右 (图 4, A) , 与果实着色进程一致 , 表明光照
是促进苹果果实花青素积累和果实着色的关键环境因子。
在果实着色过程中 , 如果 MdMYB1是启动 M dD FR 和 M dU FGT基因表达的关键转录因子 , M d2
M YB 1、M dD FR和 M dU FGT基因应该是共表达的 , 即 M dD FR和 M dU FGT基因应该与 M dM YB 1基因具
有相似的表达模式。
为了验证这个假设 , 本研究对果实着色过程中 3个基因的表达模式进行了实时定量 RT2PCR分
析。结果表明 , 在自然光诱导的果实着色过程中 , M dM YB 1基因表达明显受光诱导 , 在摘袋前只有很
低的本底表达 , 但在光照早期表达水平整体上调 , 光照 72 h时表达水平达到峰值 , 72 h后开始下降
(图 4, B )。与 M dM YB 1基因的表达模式高度相似 , M dD FR和 M dU FGT表达水平也是在光照后 0～72
h逐渐升高 , 72 h表达水平最高 (图 4, C、D )。
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图 4　光照对花青素含量 ( A) 以及基因 M dM YB 1 ( B)、M dD FR ( C) 和
M dU FGT ( D ) 的表达水平的影响
F ig. 4　Effects of light on an thocyan in con ten t ( A) and the rela tive expression levels of
M dM YB 1 ( B) , M dD FR ( C) and M dU FGT ( D )
3　讨论
在苹果中 , M dM YB 1 ( Takos et al. , 2006)、M dM YBA (Ban et al. , 2007) 和 M dM YB 10 ( Esp ley et
al. , 2007) 等均调控光诱导的果实着色 , 比对这 3个基因的序列 , 发现它们高度相似 , 并且不能从同
一个品种中同时克隆到 3个基因 , 表明 3个基因互为等位基因。‘Red Field’为红肉苹果品种 , 整株
植株均表现为红色 , 原因在于 M dM YB 10基因的启动子中含有结合 MdMYB10蛋白的重复序列 , 从而
实现级联放大式的自调控 (相当于该基因组成型过量表达 ) , 在整个植株水平上产生更多的花青苷 ,
最终导致果肉、叶片、枝条等器官均呈现红色 ( Esp ley et al. , 2009) ; 另外 , M dM YB 1和 M dM YBA的
过量表达也可以导致花青素的组成型积累 ( Takos et al. , 2006; Esp ley et al. , 2007) , 表明 M dM YB 1、
M dM YB 10和 M dM YBA基因的功能也高度相似 , 进一步表明三者互为等位基因。
Takos等 (2006) 和 Esp ley等 (2007) 的研究表明 , 红皮 (或红肉 ) 苹果中的 M dM YB 1 (或 M d2
M YB 10 )、M dD FR、M dU FGT表达量远高于非红色苹果 , 说明 M dM YB 1、M dD FR和 M dU FGT在红色苹
果着色过程中起着重要的作用。Takos等 (2006) 的结果显示 M dM YB 1去袋见光 24 h表达量是刚去
袋时的 20倍左右 , 144 h为刚去袋的 25倍 , 其后表达量开始下降 , 而本研究中 M dM YB 1的表达水平
在 72 h达到最高 , 随后下降 ; 另外 , Kim等 (2003) 研究发现 , DFR在去袋 5 d后表达最高 , 随后
降低 , UFGT在刚去袋时表达很低 , 11 d后达到最高 , 而本研究中 M dD FR和 M dU FGT的表达都是在
72 h达到峰值 , 这可能是由品种和气候差异等原因造成的。
为了探讨 MYB转录因子对下游结构基因 M dD FR和 M dU FGT的调控作用 , 本研究首先采用基于
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　11期 张华磊等 : MdMYB1转录因子调控红星苹果果实着色的计算机模拟分析及表达验证 　
生物信息学的计算机模拟分析 , 预测了 MdMYB1蛋白的功能域和亚细胞定位信息 , 并通过 GFP融合
蛋白验证了其定位于细胞核 , 证明该蛋白具有 MYB转录因子的相关特性 ( Stracke et al. , 2001)。另
外 , M dD FR和 M dU FGT启动子的序列分析表明 , 二者均包含 MRE、MBS或 MBSI等 MYB识别顺式作
用元件 , 暗示了 MYB转录因子可能直接结合到这些顺式作用元件上 , 进而调控相关结构基因的表达
( http: / / bioinformatics1p sb1ugent1be /webtools/p lantcare /htm l/ ) , M dM YB 1、M dD FR 和 M dU FGT 高度
相似的表达模式进一步表明 , M dM YB 1可能对下游的 M dD FR 和 M dU FGT基因具有调控作用。另外 ,
表达分析表明 , 3个基因表达明显下调后 , 花青素仍在大量合成 , 这可能是由于 3个基因均位于花青
素合成的上游 , 结构基因大量表达后 , 果皮产生花青素合成相关酶蛋白 , 此时即便上游基因不再大量
表达 , 已有酶活性也能维持花青素合成 , 同时 , 大量合成的花青素也可能反馈抑制上游基因的表达 ,
导致花青素含量的峰值与基因表达水平不一致。
鉴于 MdMYB1蛋白中的 R2R3 MYB功能域以及 M dD FR和 M dU FGT启动子中包含 MYB结合位点 ,
结合这些基因的表达模式 , 提出光诱导着色的工作模型 , 即光激活的 MdMYB1转录因子可能直接结
合 M dD FR和 M dU FGT启动子的顺式元件 , 调控它们的表达 , 从而启动花青素合成 , 最终导致果实着
色 , 该过程的分子机理有待深入研究。
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