全 文 ：园 艺 学 报 2010，37（2）：173–178
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期：2009–08–31；修回日期：2010–01–14
基金项目：国家自然科学基金项目（30771299）；高等学校博士学科点专项科研基金项目（20060319005）；江苏省高校自然科学基金项
目（08KJB180004）
﹡ 通信作者 Author for correspondence (E-mail: gxchen@njnu.edu.cn)
0B银杏叶片衰老过程中PSⅡ荧光动力学特性变化
1B韩 彪，陈国祥P*P，高志萍，魏晓东，解凯彬，杨贤松
2B(南京师范大学生命科学学院，南京 210046)
摘 要：以自然生长条件下银杏叶片为材料，测定叶片衰老过程中净光合速率，叶绿素含量，类囊体膜
室温荧光发射光谱和叶绿素荧光参数的变化。结果表明：光系统Ⅱ(PSⅡ)功能的衰退与叶片衰老程度是一致
的，PSⅡ功能衰退是由于天线色素被破坏和受体侧电子传递受阻造成的。PSⅡ天线色素受破坏程度与净光合
速率和叶绿素含量变化显著正相关，而PSⅡ中心色素结构一直到 11 月才受到较大的影响；随着叶片衰老加
剧，PSⅡ反应中心数不断减少，其中活性反应中心数骤降 49%，大于反应中心 27%的降幅，这表明有活性的
反应中心更容易受破坏；叶片衰老过程中PSⅡ受体侧QA被还原的速率、次数和还原需要的能量都不断增加，
此时用于推动QA下游电子传递的能量越来越少；快速叶绿素荧光诱导动力学曲线表明电子传递链受阻导致了
PSⅡ功能下降，PSⅡ主体结构瓦解于 11 月。
关键词：银杏；光系统Ⅱ；发射光谱；叶绿素荧光参数；JIP 测定
中图分类号：S 664.3；Q 945.11 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）02-0173-06

3BThe Changes of PSⅡ Chlorophyll Fluorescence Dynamic Characteristic
During Leaf Senescence of Ginkgo
4BHAN Biao，CHEN Guo-xiangP*P，GAO Zhi-ping，WEI Xiao-dong，XIE Kai-bin，and YANG Xian-song
5B(College of Life Sciences，Nanjing Normal University，Nanjing 210046, China)
Abstract: Use natural growth ginkgo leaves as experimental materials, the net photosynthetic rate, the
chlorophyll content, the fluorescence emission spectra of thylakoids membranes at room temperature and the
chlorophyll fluorescence parameters were measured. The results showed that photosystemⅡ（PSⅡ）function
declined the same as leaf senescence. The reasons of PSⅡ function declined were that the antenna pigment
were destroyed and the receptor side of electron transfer of PSⅡ was impeded. The damaged extent of PSⅡ
antenna pigments was directly proportional to net photosynthetic rate and chlorophyll content, but the center
pigment structure of PSⅡ was damaged until November. With the aging of leaves, the number of PSⅡ
reaction center continual decreased, in which the number of PSⅡ active reaction centers dropped 49%, but
the PSⅡ reaction centers only dropped 27%. It showed that the active reaction centers were more vulnerable
be damaged than the reaction centers. At the side of PSⅡ receptor, the rate, the frequency and the energy
needing of QA reduction continual increase. At the same time, less energy was used for electron transfer of QA
downstream. Changes of chlorophyll fluorescence transient showed that the impeded electron transport chain
led to PSⅡ function descent. In November, the structure of PSⅡ mostly been destroyed.

174 园 艺 学 报 37 卷
Key words：ginkgo；PSⅡ；emission spectra；chlorophyll fluorescence parameters；JIP-test

银杏（Ginkgo biloba L.）集食用、材用、观赏、保健和药用等多种功能于一体，尤其是银杏叶含
有黄酮、银杏内酯等多种生理活性物质，对心脑血管疾病等具有独特疗效（陈学森 等，1997），因此
研究银杏叶片生理活性具有重要意义。植物光系统Ⅱ(PSⅡ)功能活性是光合作用的基础，研究叶片衰
老过程中 PSⅡ功能衰退机制，对于提高植物光合作用效率，增加作物产量和品质具有重大意义。目前
对于银杏 PSⅡ生理功能的研究多集中于环境胁迫方面，自然条件下银杏叶片衰老过程中 PSⅡ功能衰
退机制的研究尚未见报道。本试验中利用无损伤叶绿素荧光诱导动力学分析技术，系统分析了银杏叶
片衰老过程中 PSⅡ功能衰退原因，以期为光合作用研究和银杏资源的开发利用提供理论和试验依据。
6B1 材料与方法
选用江苏省江都林业管理站育种园内 10 a 生嫁接银杏树雌株，取向阳一侧无病变损伤新枝顶端功
能叶片为试验材料，每次取相同的叶片进行荧光参数测定。采样日期为 2008 年 7 月 20 日—11月2 0 日
（落叶），每月 20 日采样。叶绿素荧光参数重复 8 次，其它数据重复 3 次，最后取平均值。
9B1.1 净光合速率和叶片叶绿素含量的测定
采用CIRAS-2 型便携式光合作用测定系统(英国PP Systems公司)测定净光合速率PRnR，温度、湿度均
为环境水平，由系统自带的液化CO2小钢瓶提供稳定可调气源，CO2浓度控制在 360 μmol · molP-1P，利
用系统自带人工光源将光强PAR设定为 1 000 μmol · mP-2P · sP-1P，测定时间为上午 10：00 左右。叶绿素含
量参照Arnon（1949）和叶济宇（1985）的方法。
10B .2 类囊体膜的制备及叶绿素含量的测定
参照Dunahay等（1984）所介绍的B.B.Y法加以改进，用纱布将银杏叶片擦干净，准确称取 5 g，
剪碎， 4 ℃下预冷，加入冷却的缓冲液B1 0.4 mol · L-1 蔗糖、2 mmol · L-1MgCl2、0.1% BSA、20
mmol · L-1 Tricine，pH 8.0）冰浴研磨，4 层纱布过滤，滤液在 4 ℃下经 300 × g离心 2 min，上清液在
4 ℃下经 4 000 × g 离心 10 min，得破碎叶绿体沉淀。沉淀用缓冲液B2（0.15 mol · L-1蔗糖、5 mmol · L-1
MgCl2、0.2%BSA、20 mmol · L-1 Tricine，pH 8.0）匀浆，然后在 4 ℃下经 4 000 × g离心 10 min，得类
囊体膜沉淀。取沉淀用B3（15 mmol · LP-1 NaCl、5 mmol · L-1 MgCl2、20 mmol · L-1 MES，pH 6.5）匀浆
即得类囊体膜悬浮液。取类囊体膜悬浮液 0.05 mL加 1.45 mL 80%的丙酮，6 000 r · min-1离心 10 min取
上清液，用分光光度计测定，计算叶绿素含量。
11B .3 类囊体膜室温荧光发射光谱的测定
用美国Perkin Elmer公司生产的 Luminescence spectrometer LS50B，测定类囊体膜室温荧光发射光
谱，测定时固定叶绿素含量为 4 μg · mL-1。波长范围 600 ~ 800 nm，激发光波长为 480 nm。测定方法
参考刘晓等（2004）的方法并作适当改进。
12B .4 叶绿素荧光参数的测定
使用英国Hansatech公司生产的连续激发式荧光仪Handy PEA测定活体银杏叶片的荧光参数，利用
配套软件对数据进行处理分析。每次上午 10：00 取相同叶片进行测定，重复 8 次，取平均值。具体步
骤如下：叶片暗适应 20 min后，用 3 000 μmol · m-2 · s-1 饱和红闪光照射，仪器自动记录从 10 μs 到 1 s
之间高分辨率间隔荧光信号，测得叶绿素荧光诱导参数。
叶绿素荧光参数参考 Strasser 等（2000，2004）和李鹏民等（2005）的计算方法。单位面积的光
2 期 韩 彪等：银杏叶片衰老过程中 PSⅡ荧光动力学特性的变化 175

合机构含有的反应中心数RC/CSo = (Fv/Fm) × (VJ/Mo) × Fo；复合体吸收能量中活性反应中心的数
RC/ABS = [1–(Fo/Fm)]/(Mo/VJ)；单位反应中心吸收的光能ABS/RC = Mo· (1/VJ) · (1/φPo)；单位反应中
心捕获的用于还原QA的能量TRo/RC = Mo · (1/VJ)；单位反应中心捕获的用于电子传递的能量ETo/RC =
Mo· (1/VJ) ·ψo；单位反应中心耗散掉的能量DIo/RC = (ABS/RC)–(TRo/RC)。荧光诱导曲线的初始斜率
Mo = 4(F300 μs–Fo)/(Fm–Fo)，标准化后的荧光诱导曲线、荧光强度F = Fm及y轴之间的面积Sm=
(Area)/(Fm–Fo)；从开始照光到到达Fm的时间段内QA被还原的次数N = Sm · Mo · (1/VJ)；最大光化学效
率φPo = [1–(Fo/Fm)]；反应中心捕获的激子中用来推动电子传递到电子传递链中超过QRAR的其它电子受
体的激子占用来推动QA还原激子的比率ψo = ETo/TRo = (1–VJ)；用于电子传递的量子产额φEo =
ETo/ABS = [1–(Fo/Fm)] ·ψo。
7B2 结果与分析
13B2.1 银杏叶片净光合速率和叶绿素含量的变化
图 1 显示银杏叶片净光合速率和叶绿素含量在 8 月 20 日达到最大值，之后均随叶片衰老而下降，
且两者呈显著正相关（相关系数为 0.963），净光合速率和叶绿素含量下降阶段的直线回归斜率分别为
k净光合 =–0.0712 和 k叶绿素 =–0.0141，这反映出叶片衰老的速率。
14B2.2 类囊体膜室温荧光发射光谱的变化
类囊体膜室温荧光发射光谱能够在宏观水平上反映 PSⅡ活性（Wang & Hua，2001）。研究表明波
长 630 ~ 640 nm 的荧光代表 PSⅡ天线色素的含量，波长 670 ~ 680 nm 的荧光代表 PSⅡ中心色素的含
量（姬茜茹 等，2008）。由图 2 可知，波长 630 ~ 640 nm 荧光变化显示出 PSⅡ天线色素含量变化与净
光合速率和叶绿素含量变化呈显著正相关（相关系数分别为 0.860 和 0.916）。波长 670 ~ 680 nm 的荧
光 7—10 月差异不大，但是在 11 月叶片衰老的最后阶段荧光数值迅速下降了 30%，这一变化表明 PS
Ⅱ中心色素结构在叶片衰老前期未受太大的影响，但在衰老后期却迅速被破坏。

15B2.3 PSⅡ反应中心和活性反应中心数的变化
JIP测定得到的光合机构的比活性能够反映植物光合器官对光能的吸收、转化和耗散状况
（Appenroth et al., 2001；van Heerden et al., 2003, 2004）。图 3 表明 8—11 月单位面积叶片含有的PSⅡ
反应中心数（RC/CSo）下降了 27%，而PSⅡ活性反应中心数（RC/ABS）却下降了 49%，这表明在叶
图 1 银杏叶片衰老过程中净光合速率和叶绿素含量的变化
Fig. 1 Changes in net photosynthetic rate and chlorophyll
content during leaf senescence of ginkgo
图 2 银杏叶片衰老过程中类囊体膜室温荧光发射光谱的变化
Fig. 2 Changes in fluorescence emission spectra of thylakoid
membranes at room temperature during leaf senescence of ginkgo
176 园 艺 学 报 37 卷
片衰老过程中，那些有活性的反应中心更容易受到破环。
16B2.4 PSⅡ反应中心能流分配的变化
Strasser以生物膜中能量流动理论为基础，通过计算能量流和能量比率来衡量在给定物理状态下样
品材料内部变化，建立了高度简化的能量流动模型（Strasser et al., 1995）。图 4 中ABS/RC和TRO/RC
的变化表明：在 8 月PSⅡ反应中心总体活性最强的时候，单位反应中心吸收的光能和用于还原QA的能
量最少，8 月之后二者都迅速增加。ETo/RC数值保持平稳表明：在叶片衰老过程中用于电子传递的能
量变化不大。DIo/RC在 8 月之后迅速增加表明在叶片衰老过程中单位反应中心有越来越多的能量以其
它方式被耗散掉。

17B2.5 PSⅡ受体侧的变化
Mo、Sm、φEo、ψo等参数主要反映了PSⅡ受体侧的变化，PSⅡ受体侧主要包括QA、QB、PQ库等
（李鹏民 等，2005）。为了更直观的比较PSⅡ受体侧的众多参数，取某一参数不同时期的数值除以该
参数的平均数，将平均值设定为 1，做PSⅡ受体侧荧光参数雷达坐标图。图 5 中Mo、N和Sm的数值随
着时间进程叶片的衰老不断增加，Mo和N的变化说明在叶片衰老过程中QA被还原的速率（Mo）和次数
（N）都迅速增加，Sm的数值渐增说明叶片衰老越严重，QA完全被还原所需要的能量越多。在PSⅡ受
体侧下降的几个指标中，最大光化学效率（φPo）下降最少，这表明在叶片衰老时细胞仍然尽量保持
PSⅡ的功能活性，φEo的下降表明在叶片衰老过程中用于QA下游电子传递的量子不断减少，ψo的下降
表明衰老过程中PSⅡ反应中心捕获的激子中用于QA下游电子传递的激子占捕获激子总数的比例不断
减少，φEo和ψo的变化表明叶片衰老过程中PSⅡ受体侧QA下游的电子传递接收的能量无论绝对值还是
占总能量的比例值都是不断降低的。
18B2.6 快速叶绿素荧光诱导动力学曲线
典型的快速叶绿素荧光诱导动力学曲线有O（20 ~ 50 μs）、J（2×103 μs）、I（3 × 104 μs）、P（3 ~ 10×
10P5 μs）等相，O ~ J段是当样品经过暗处理以后照以强光时，PSⅡ反应中心被激发后产生的电子经由
Pheo传给QA，将其还原成QA–的过程，QA–的大量积累导致了J点的出现；J ~ I段的荧光是电子传递过
程中快还原型PQ库先被完全还原造成的，I ~ P段的荧光是慢还原型PQ库被还原造成的（Govindjee,
1995；Strasser et al.,1995, 2000, 2004）。图 6 中 7—10 月的O-J-I-P曲线交于同一个J点表明此时QA–
的产量没有受到影响，J-I-P段荧光数值在 7—11 月间不断下降；11 月份的荧光曲线呈现O-K-J-I-P特征，
而K点（300 μs）的出现是由于放氧复合体（OEC）受伤害导致的（Eggenberg et al., 1995；Strasser et al.,
图 3 银杏叶片衰老过程中 PSII 反应中心数和活性反应中心数变化
Fig. 3 Changes in PSII reaction center numbers and activity
reaction center numbers during leaf senescence of ginkgo
图 4 银杏叶片衰老过程中 PSII 反应中心能量分配的变化
Fig. 4 Changes in PSII reaction center energy allocation
during leaf senescence of ginkgo
2 期 韩 彪等：银杏叶片衰老过程中 PSⅡ荧光动力学特性的变化 177

图 6 银杏叶片衰老过程中快数叶绿素荧光诱导动力学曲线的变化
Fig. 6 Changes in chlorophyll fluorescence transient
During leaf senescence of ginkgo
2000, 2004），11 月的J、I、P点荧光值明显较低，说明 11 月PSⅡ基本结构已经瓦解。

8B3 讨论
研究表明植物叶片衰老的主要生理特征是净光合速率下降和叶绿素含量降低（李向东 等，2002）。
图 1 中净光合速率和叶绿素含量的变化显示出银杏叶片的衰老过程。为了更好的分析PSⅡ功能变化机
制，根据电子在PSⅡ中传递的方向，以PSⅡ反应中心色素P680 为中心将PSⅡ分为供体侧，反应中心
和受体侧 3 部分。在供体侧的变化中，图 2 中 630 ~ 640 nm荧光发射峰值不断下降显示天线色素随着
叶片的衰老不断受到破坏，这直接影响到PSⅡ对光能的聚集。图 6 中 7—10 月的O-J-I-P曲线相交于J
点表明这一时期形成QAP–的能力是正常的，O ~ J段荧光值增加是由于PSⅡ受体侧电子传递受阻导致供
体侧不断产生多余的能量以荧光形式释放形成的；11 月的O-J-I-P曲线出现了明显的K点，说明放氧复
合体（OEC）只在叶片衰老末期结构才受到较大破坏。图 2 中 670 ~ 680 nm的荧光发射峰值在 11 月骤
然下降 30%，这表明PSⅡ中心色素结构只是在衰老的最后阶段（11 月）才瓦解。图 3 表明PSⅡ有活
性的反应中心更容易受到衰老过程的影响。图 4 中ABS/RC、TRo/RC和DIRo/RC的值不断增加，说明叶
片衰老时单位反应中心承担的光能转换任务更多。以上结果表明，在叶片衰老过程中，PSⅡ中心色素结
构基本稳定，有活性的反应中心数目急剧下降，剩下的活性反应中心承担了越来越多的光能转换任务，
活性反应中心捕获的光能优先保证推动PSⅡ电子传递（ETo/RC）。
图 5 中Mo、N和Sm不断增加表明单位QA承担的电子传递任务更大，而φEo和ψo数值的下降说明PS
Ⅱ受体侧电子传递能力不断下降。图 6 中J-I-P区间在 7—11 月荧光数值急剧下降说明此时PQ库被还原
的能力不断下降。以上结果表明，叶片衰老过程中PSⅡ受体侧PQ库被还原的能力急剧降低，库容减少，
QA自身氧化还原越来越困难，导致受体侧电子传递受阻，最终影响了电子传递过程。
关于植物叶片衰老机理的假说中，光碳失衡说重点解释了叶片衰老过程中光合机构衰退的变化（魏
道智 等，1998）。该学说认为叶片衰老时羧化酶活性下降速度较快, 从而打破能量的供需平衡，使光
合碳循环消耗的ATP和NADPH减少,叶绿体中电子受体NADPP+ 馈乏, 最终形成超氧阴离子和H2O2 对
其它结构形成破坏，PSⅡ功能的下降在众多生理指标中属于下降缓慢的那一类。本研究表明，PSⅡ反
应中心的结构在衰老过程中相对稳定，天线色素首先受到破坏，使得PSⅡ聚光能力下降，导致有活性
的反应中心数目减少，为了保持电子传递的正常进行，PSⅡ单位反应中心的效率增加，但是PSⅡ受体
侧接收电子的能力下降，最终导致PSⅡ功能的衰退。至于是不是超氧阴离子和H2O2 破坏了PSⅡ天线
色素，以及什么原因导致了PSⅡ受体侧电子接收能力下降还需要进一步研究。
图 5 银杏叶片衰老过程中 PSII 受体侧的变化
Fig. 5 Changes in PSII receptor side during leaf
senescence of ginkgo
178 园 艺 学 报 37 卷
19BReferences
Appenroth K J, Stöckel J, Srivastava A, Strasser R J. 2001. Multiple effects of chromate on the photosynthetic apparatus of Spirodela polyrhiza as probed
by OJIP chlorophyll a fluorescence measurements. Environ Pollut, 115: 49–64.
Arnon D I. 1949. Copper enzymes in isolated chlorop last polyphenol oxidase in Beta vulgaris. Plant Physical, 24:1–15.
Chen Xue-sen, Zhang Yan-min, Li Jian, Chen Zhang-jiu, Zhang Wen-cai. 1997. The evaluation of leaf–utilization resources and cultivar selection in
Ginkgo biloba. Acta Horticulturae Sinica, 24 (3) : 215. (in Chinese)
陈学森,张艳敏,李 健,陈章久,章文才. 1997. 叶用银杏资源评价及选优研究. 园艺学报，24 (3) : 215.
Dunahay T G, Staehelin L A, Seibert M. 1984. Structural, biochemical and biophysical characterization of four oxygen evolving photosystemⅡ
preparations from spinach. Biochimica et Biophysica Acta, 764:179–193.
Eggenberg P，Rensburg L V，Krüger H J，Strasser R J. 1995. Screening criteria for drought tolerance in Nicotiana tabacum L. derived from the polyphasic
rise of the chlorophyll a fluorescence transient (O-J-I-P)∥Mathis P. Photosynthesis: From light to biosphere (IV). Dordrecht: KAP Press: 4:
661–664.
Govindjee. 1995. Sixty-three years since Kautsky: Chlorophyll a fluorescence. Australian. Plant Physiol, 22: 131–160.
Ji Qian-ru，Liu Xiao，He Jun-fang，Yue Ming. 2008. Steady-state fluorescence spectrum analysis of thylakoid membranes of etiolated Maize seedlings. Acta
Photonica Sinica，37(12): 2486–2492. (in Chinese)
姬茜茹，刘 晓，贺俊芳，岳 明. 2008. 黄化玉米幼苗类囊体膜稳态荧光光谱分析.光子学报, 37(12): 2486–2492.
Li Peng-min, Gao Hui-yuan, Strasser R J. 2005. Application of the chlorophyll fluorescence induction dynamics in photosynthesis study. Journal of Plant
Physiology and Molecular Biology，31 (6): 559–566. (in Chinese)
李鹏民,高辉远,Strasser R J. 2005. 快速叶绿素荧光诱导动力学分析在光合作用研究中的应用.植物生理学与分子生物学学，31(6): 559–566.
Li Xiang-dong, Wang Xiao-yun, Yu Song-lie, Zhang Gao-ying, Wan Yong-shan, Li Jun. 2002. The changes of photosynthetic properties and cell
microstructure in peanut leaves during leaf senescence. Scientia Agricultura Sinica，35(4) : 384–389. (in Chinese)
李向东,王晓云,余松烈,张高英,万勇善,李 军. 2002. 花生叶片衰老过程中光合性能及细胞微结构的变化. 中国农业科学，35(4)：384–
389.
Liu Xiao, Wang Shui-cai, He Jun-fang, Peng Ju-fang, Kuang Ting-yun. 2004. Study on energy transfer in core complex of PSⅡ by femtosecond
fluorescence spectra technique. Acta Biophysica Sinica , 20 (4) : 290–296. (in Chinese)
刘 晓,王水才,贺俊芳,彭菊芳,匡廷云. 2004. PSⅡ核心复合物能量传递的飞秒时间分辨荧光光谱学研究.生物物理学报，20(4)：290–296.
Strasser R.J, Srivastava A, Govindjee. 1995. Polyphasic chlorophyll a fluorescence transient in plants and cyanobacteria.Photochem Photobiol,61: 32–42.
Strasser R J, Tsimilli, Michael M, Srivastava A. 2000. The fluorescence transient as a tool to characterise and screen photosynthetic samples∥Yunus M,
Pathre U , Mohanty E. Probing Photosynthesis：Mechanisms，Regulation and Adaptation. London：Taylor & Francis: 445–483.
Strasser R J, Tsimill-Michael M, Srivastava. 2004. Analysis of the chlorophyll a fluorescence transient∥Papageorgiou G, Govindjee. Advances in
photosynthesis and respiration. Netherlands: KAP Press: 1–47.
van Heerden P D R, Tsimilli-Michael M, Krüger G H J, Strasser R J. 2003. Dark chilling effects on soybean genotypes during vegetative development:
parallel studies of COR2R assimilation, chlorophyll a fluorescence kinetics O-J-I-P and nitrogen fixation. Physiol Plant, 117: 476–491.
van Heerden P D R, Strasser R J, Krüger G H J. 2004. Reduction of dark chilling stress in N2-fixing soybean by nitrate as indicated by chlorophyll a
fluorescence kinetics. Physiol Plant, 121: 239–249.
Wang Ren-lei, Hua Chun. 2001. Study on Photosynthetic characteristics of hybrid rice Shanyou 63. Journal of Nanjing Normal University: Nat Sci, 24（4）：
111–115.
Wei Dao-zhi, Dai Xin-bin, Xu Xiao-ming, Zhang Rong-xian. 1998. Several hypotheses on the mechanism of the plant leaf senescence. Guangxi Plant, 18
(1) : 89–96. (in Chinese)
魏道智,戴新宾,许晓明,张荣铣. 1998. 植物叶片衰老机理的几种假说. 广西植物，18 (1) : 89–96.
Ye Ji-yu. 1985. About Arnon fomula in determination of chlorophyll content. Plant Physiology Communications, (6) : 69. ( in Chinese)
叶济宇. 1985. 关于叶绿素含量测定中的 Arnon 计算公式. 植物生理学通讯，(6) : 69.