全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (9) : 1317 - 1326
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 02 - 16; 修回日期 : 2009 - 07 - 27
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30760126) ; 广西科技攻关项目 (053700724) ; 广西创新能力建设项目 (04430226)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: jshcao@zju1edu1cn)
山药 ANS基因的克隆和分子特性及其与花青素积
累的关系
周生茂1, 2 , 王玲平3 , 向　珣1 , 韦本辉4 , 李立志2 , 李杨瑞5 , 方锋学2 , 曹家树13
( 1 浙江大学蔬菜研究所 , 杭州 310029; 2 广西农业科学院蔬菜研究所 , 南宁 530007; 3 浙江农业科学院蔬菜研究所 ,
杭州 310021; 4 广西农业科学院经济作物研究所 , 南宁 530007; 5 广西农业科学院广西省重点实验室 , 南宁 530007)
摘　要 : 为了阐明花青素合成酶 (ANS; EC 1114111119) 基因在山药地下块茎花青素积累过程中的功
能 , 利用 RT2PCR和 RACE技术从田薯 (D ioscorea a la ta L. ) 地下块茎中分离到一个 ANS基因 (D aANS1 ) ,
并运用相关软件、Norhtern杂交和原核表达等技术分析了该基因 ; 同时测定了 ANS酶活性和花青素含量。
结果显示 , 该基因序列大小为 1 387 bp, 最大开放阅读框 (ORF)、5′端和 3′端的非翻译区分别由 1 077 bp、
9 bp和 301 bp组成 , 且有真核生物基因 5′-和 3′- 末端序列的典型特征 , 是一个完整的全长 cDNA序列 ;
D aANS1最大 ORF可编码 358个氨基酸 , 其分子量和等电点分别为 4014 kD和 5126, 并含有依赖于 2 -酮戊
二酸和 Fe2 +氧化的保守结构域 , 其中包括与 2 -酮戊二酸特异结合的精氨酸 2个 (A rg295、304) 及与 Fe2 +
结合的保守组氨酸 5个 (H is238、243、249、276、294) 和天冬氨酸 3个 (A sp240、260、279) ; D aAN S1
与所选被子植物 ANS基因的同源性均远高于与裸子植物的同源性 , 而且与被子植物中双子叶旋花科植物
ANS基因的亲缘关系最近 , 但仅能将属、种间植物合理分类 ; D aANS1 表达丰度从初前期增至最强的盛前
期后一直降至最低的后中期 , 到收获时又稍增强 , 其表达模式与 ANS酶活性和花青素含量的变化具协同
性。这些结果表明 , D aANS1为植物 ANS基因的一员 , 可评价属、种间植物的亲缘关系 , 在转录水平上受
到调控而影响田薯地下块茎花青素形成。
关键词 : 山药 ; 花青素合成酶 ; 基因克隆和分析 ; 酶活性变化 ; 花青素积累
中图分类号 : S 63211　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0921317210
C lon ing and M olecular Character istics of ANS Gene and Its Correla tion s
w ith An thocyan in Accum ula tion in Yam
ZHOU Sheng2mao1, 2 , WANG L ing2p ing3 , X IANG Xun1 , W E I Ben2hui4 , L I L i2zhi2 , L I Yang2rui5 , FANG
Feng2xue2 , and CAO J ia2shu13
(1 Institu te of V egetable Science, Zhejiang U niversity, Hangzhou 310029, China; 2 Institu te of V egetable Science, Guangxi A cadem y
of A griculture Science, N ann ing 530007, China; 3 Institu te of V egetable Science, Zhejiang A cadem y of A griculture Science, Hang2
zhou 310021, Ch ina; 4 Institu te of Econom ical C rops, Guangxi A cadem y of A griculture Science, N ann ing 530007, Ch ina;
5 Province Key Labora tory, Guangxi A cadem y of A gricu lture Science, N anning 530007, Ch ina)
Abstract: To elucidate the effects of anthocyanidin synthase (ANS; EC 1114111119) gene on anthocy2
anin accumulation in underground yam tubers, in the p resent paper, one of ANS gene (D aAN S1 ) was not on2
ly isolated by RT2PCR and RACE techniques from the underground tubers of yam (D ioscorea a la ta L. ) , and
characterized with both the related softwares and the techniques as Northern hybridization and gene exp ression
in E1coli, but also both ANS enzyme activity and anthocyanin concentration were determ ined. The results
shows, that D aAN S1 was a full2length cDNA sequence with 1 387 bp in size in term s of comp rising a 1 077 bp
largest open reading frame (ORF) , a 9 bp 5′noncoding region and a 301 bp 3′noncoding region and having
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the typ ical characteristics of 5′2 and 3′2 ends of eukaryotic gene cDNA sequence; that a polypep tide of 358
am ino acids with a 4014 kD molecular weight and a theoretical p I of 5126 was putatively encoded by the
largest ORF of D aAN S1 , in which had the 22oxoglutarate2 and Fe2 + 2dependent conserved oxidation regions
containing two of conserved A rginine (A rg295, 304) related to the combination of 22oxoglutarate and the Fe2 +
combination2related am ino acid residues as both five of conserved H istidine (H is238, 243, 249, 276, 294)
and three of A spartate (A sp240, 260, 279) ; that D aAN S1 shared the higher sim ilarities with AN S genes of
the selected angiosperm species than gymnosperm AN S genes at the levels of comp lete cDNA sequences, cod2
ing regions and its deduced am ino acid sequences, and had the closest genetic relationship with ANS genes of
convolvulaceae p lants in dicots of angiosperm s, but was used to reasonably sort only between genus or species
p lants; D aAN S1 exp ression abundances were straightly reduced to the lowest at the part of later stage of the
underground tuber bulking after increased from the initiation of early stage to the initiation of m iddle phase with
the highest and thereafter slightly raised at the harvesting time, the p rofiles of which were paralleled with the
change trends of both ANS enzyme activity and anthocyanin content. These results indicate that D aAN S1 as a
member of p lant ANS genes can evaluate the genetic relationship between genus or species p lants, and control
anthocyanin accumulations of underground tubers based on its regulation at transcrip tion level.
Key words: D ioscorea a la ta L. ; anthocyanidin synthase; gene cloning and analysis; enzyme activity
change; anthocyanin accumulation
山药 (D ioscorea spp. ) 是世界上重要的食用地下根茎类园艺作物之一 , 在我国主栽有田薯 (D.
a la ta L. )、普通山药 (D. ba ta tas Decne. ) 和日本山药 (D. japon ica Thunb. ) 等 3个种 (刘新裕 ,
2003)。它们的地下块茎除主要积累淀粉外 , 还富含抗氧化的酚类物质 (刘新裕 等 , 1999)。但是 ,
其中仅有田薯地下块茎富含以矢车菊花色苷为主的花青素 (Martin & Ruberte, 1976)。因此 , 改进和
调控花青素形成对创新山药品种和提高人类膳食营养具有重要意义。
花青素是植物界最为丰富的一组类黄酮化合物 (Jaakola et al. , 2002) , 其生物合成既涉及途径
早期与类黄酮形成所共享的酶 , 也包括途径后期花青素合成酶 ( anthocyanidin synthase, ANS; EC
1114111119) 等特有酶 ( Koes et al. , 2005)。这些酶各自因物种不同而成为主导花青素形成的关键
酶 , 黄烷酮 3 -羟基化酶 ( F3H)、二氢黄酮醇 4 -还原酶 (DFR)、ANS和糖基转移酶 ( GT) 分别是
金鱼草、矮牵牛、石竹和葡萄的关键酶 (Boss et al. , 1996; Shimada et al. , 2006) , 它们依照各自基
因家族成员的表达而起作用 , 在内质网外膜上与途径中其他酶组成多酶复合体 , 共同催化花青素合成
(Jaakola et al. , 2002; Koes et al. , 2005)。植物花青素形成后通常贮藏于花、叶、茎表皮细胞的液泡
中 (Jaakola et al. , 2002) , 所以 , 在蛋白质和基因水平上研究花青素合成的酶及其相关基因的报道
多出自这些器官 , 而在植物块茎和果实的肉细胞中的研究还不多 , 尤其花青素合成途径后期特有酶的
报道更少。
ANS位于花青素生物合成途径的后期 , 依赖 2 -酮戊二酸离子和 Fe2 +催化无色花青素氧化生成花
青素 (苷 ) (Xie et al. , 2004)。在许多植物中 , ANS由一个小基因家族所编码 (Rosati et al. , 1999;
Jaakola et al. , 2002) , 但是至今尚未有山药 AN S基因的报道。所以 , 为了阐明山药地下块茎 AN S基
因的功能 , 本研究拟以地下块茎肉呈紫色的田薯 ‘紫小 ’为材料 , 运用 RT2PCR和 RACE等技术对其
地下块茎 AN S基因的全长 cDNA序列进行克隆和描述 , 并分析 ANS基因表达与其酶活性和花青素积
累的关系 , 阐明 AN S基因的调控水平 , 为进一步调控山药地下块茎营养和创新山药品种打下分子生
物学基础。
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1　材料与方法
111　材料和试剂
以田薯 ‘紫小 ’为材料 , 2004年 4月 23日 —11月 24日在浙江大学蔬菜研究所实验基地 ( 30°
16′N , 120°12′E) 按随机区组设计 , 重复 3次种植。山药幼苗移栽后第 76、87、107、140、172、
204天 , 即块茎形成的初前期、盛前期、盛中期、盛后期、后中期和收获期分小区取块茎 , 藏于 - 80
℃备用。
引物合成、 dNTP、 EcoRⅠ、B am HⅠ、X hoⅠ、DEPC、Amp、 IPTG、X2GaL、 Taq DNA 聚合酶、
T4 DNA连接酶、DNA和蛋白质的标样购自上海生物工程技术服务有限公司 ; SMARTTM PCR cDNA
Synthesis Kit购自 Clontech公司 ; pET232a ( + ) 和 pGEM 2T载体分别购自 Novgen公司、Promega公
司 ; DNA凝胶回收试剂盒购自 V2gene公司 ; 大肠杆菌 DH5α、BL21由浙江大学蔬菜细胞与分子生物
学实验室保存。cyanin chloride ( ID, 24886687)、 (2R, 3S, 4R) 2leucoanthocyanidin ( ID , 11208959) 分
别购自 SIGMA和 NEXTB IO公司。其余试剂均为国产。
112　RNA提取与双链 cD NA合成
参照 Maríaleonor等 (2002) 方法提取总 RNA。等浓度混合同期每份样的总 RNA用作反转录模
板 , 用 SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit提供的 Reverse Transcrip tase M 2MLV、3′端和 5′端的接头序列
及操作程序合成双链 cDNA ( dscDNA )。
113　基因全长 cD NA序列的获得和验证
首先根据 GenBank中已知部分物种 AN S 基因 cDNA序列的保守区域 , 设计上、下游简并引物
ADF和 ADR (表 1) 扩增田薯 AN S基因的中间 cDNA序列 ; 其次以所得中间序列分别设计扩增 3′和
5′末端序列的上游引物 A3SF和 A5SF (表 1) , 以反转录添加的 3′和 5′端接头序列分别设计扩增 3′和
5′末端序列的下游引物 A3SR和 A5SR (表 1) ; 最后以 3段序列拼接的全长 cDNA序列设计包含 3段
部分序列且含最大阅读框的上、下游引物 ZASF1和 ZASR1 (表 1) , 并分别添加 B am HⅠ和 X hoⅠ酶
切位点和 3个保护碱基 (表 1)。
表 1　PCR的引物序列及其退火温度
Table 1 The pr im er sequences and the ir annea ling tem pera tures of PCR
PCR扩增反应
PCR amp lification reaction
引物名称和序列
Name and sequence of p rimers
退火温度 /℃
Annealing temperature
基因 cDNA中间序列 Gene m iddle cDNA sequence ADF: 5′2 TNCAAATGAARATMA AYTACT ACCCAA 23′ 52
ADR: 5′2CARAANACMGCCCAW GAAAYCCTNACC 23′
基因 3′端 cDNA序列 Gene 3′end cDNA sequence A3SF: 5′2CCTTCATCCTCCACAACAACGT 23′ 50
A3SR: 5′2AGGCCGAGGCGGCCGACATGTTTT 23′
基因 5′端 cDNA序列 Gene 5′end cDNA sequence A5SF: 5′2CGTTGTTGTGGAGGATGAAGGA 23′ 50
A5SR: 5′2AAGCAGTGG TATCAACGCAGAGT 23′
基因全长 cDNA验证 Gene comp lete cDNA verification ZASF1: 5′2 GAAGGATCCATGGTGACTACTATT 23′ 56
ZASR1: 5′2 GCGCTCGAGCACACAACAACACTG 23′
基因 RT2PCR分析 Analysis of RT2PCR for gene ZASF2: 5′2 TTCAAATGAAAATCAATTACTACCC 23′ 55
ZASR2: 5′2CAAACACAGCCCAAGATATCCTCAC 23′
Actin1 RT2PCR分析 Analysis of RT2PCR for Actin1 RTAF: 5′2TCTCTATGCCAGTGGTCGTA23′ 55
RTAR: 5′2CTCAGGACAACGGAATC23′
PCR体系 : 014μL dscDNA模板 (约 30 ng) , 10 ×PCR反应缓冲液 (含 20 mmol·L21 MgCl2 )
510μL, dNTP混合物 (10 mmol·L - 1 ) 110μL, 上、下游引物 (10μmol·L - 1 ) 各 2μL, 110μL
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Taq DNA聚合酶 (含 115 U) , 加灭菌 ddH2 O至总体积 50μL。PCR条件 : 94 ℃预变性 3 m in; 94 ℃
变性 45 s, 相应温度 (表 1) 退火 50 s, 72 ℃延伸 2 m in, 共 35个循环 ; 72 ℃延伸 10 m in后冷却至 4
℃。PCR产物按李德葆等 (1996) 的方法电泳、回收、克隆、验证和测序 , 每个产物挑选 3个单菌
落测序。将基因全长验证时扩增产物所构建的重组 T质粒命名为 pGEM 2D aAN S1 。
114　基因在大肠杆菌中的高效表达
参照 Paul Barratt等 ( 2001) 方法进行基因原核表达。pGEM 2D aAN S1 和 pET232a ( + ) 分别经
B am HⅠ和 X hoⅠ双酶切后 , 构建 pET2D aANS1 的重组表达载体 , 并转化到 BL21中表达 ; 以加 IPTG
(1 mmol·L21 ) 的阳性菌落溶液培养为处理、未加 IPTG的为对照 , 30 ℃培养 12 h, 离心收取菌液后 ,
以混合蛋白为标准样品进行 SDS2PAGE分析 , 电泳后银染显色。
115　基因全长 cD NA及其编码氨基酸序列的结构特征和分子进化的分析
将所得中间片段 cDNA序列在线 B last分析 , 确认目的基因。
用 DNASTAR和 DNASIS软件分析基因核苷酸和氨基酸的结构特征和同源性 ; 在线分析氨基酸序
列的保守功能域。应用 CLUSTALW 1182和 TreeV iew软件对基因所推定氨基酸序列进行多序列比较并
构建系统树。
116　田薯 AN S基因的表达分析
参照 Harada等 (2005) 方法分析块茎各期 D aAN S1 的表达。RT2PCR分析以 D aAN S1 全长 cDNA
序列设计上、下游引物 ZASF2和 ZASR2 (表 1) , 以植物基因 A ctin1为表达的内参照系 , 根据其 cD2
NA序列设计上、下游引物 RTAF和 RTAR (表 1) ; PCR反应体系为中间片段扩增的一半 , 反应条件
除退火温度 55 ℃和循环数 30个外 , 其他均与中间片段扩增的相同。
Northern杂交分析除用引物 ZASF2和 ZASR2扩增目的片段后 , 按照 Random Primer DNA Labeling
Kit Ver1 210说明书 (大连宝生物工程有限公司 ) 制备 32 P标记探针外 , 其余均按文献操作。
117　花青素含量和 ANS酶活性的测定
参照 Pazm ino2D uran等 ( 2001 ) 方法略改后测定花青素含量。用 50 %甲醇溶液 (含 0136 %
HC l) 在 200 r ·m in - 1摇床上于黑暗 0～4 ℃下重复振荡提取样品冻干粉。以矢车菊色素氯化物
( cyanin chlo ride) 为标准样品 , 测 522 nm的吸光值 , 每份样重复测 3次。花青素含量和花青素
总量分别以克干样质量和单株为基础 , 用含有矢车菊色素氯化物相当量表示 , 即分别为 m g ·
g- 1 DW 和 g ·p lant- 1。
参照 Nakajima等 (2001) 方法略改后测定 ANS酶活性。用 50 mmol·L - 1中性磷酸钾缓冲液 (含
200 mmol·L - 1 NaCl, 5 mmol·L - 1 DTT, 10%甘油 ) 提取样品冻干粉 , 提取液依次用活性碳和Na2 SO3
脱色 , 再按 Helmerhorst和 Stockes (1980) 方法脱盐制备粗酶液 ; 每份样测定重复 3次。用 B radford
(1976) 方法测定粗酶液可溶性蛋白。酶活性单位以每毫克蛋白每分钟反应生成矢车菊色素氯化物相
当量表示 , 即μg ·mg- 1 ·m in - 1。
2　结果与分析
211　田薯 AN S基因全长 cD NA序列的获得和验证
一段 286 bp的中间 cDNA序列 (图 1, A ) 从地下块茎得到扩增 , 经在线比对 , 与其他植物 AN S
基因在核苷酸和氨基酸的水平上分别有 73% ～78%和 79% ～88%的同源性 , 确知为田薯 AN S基因的
一部分 , 命名为 D ioscorea alata anythocyanidin synthase1 (D aAN S1 ) ; 以该中间序列为基础 , 分别运用
3′2和 5′2RACE技术获得 D aAN S1的 3′2和 5′2末端序列 , 不含引物的大小分别是 623 bp (图 1, B )
和 741 bp (图 1, C) ; 3段序列可拼成 1 387 bp (去掉重叠多余部分和两端接头引物序列 )。
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　　用验证全长 cDNA序列的引物扩增到一条 1 194 bp的预期特异条带 (图 1, D) , 含 3段序列的预
知部分 ; 同时 , 用全长验证所得序列构建的重组表达载体 pET2D aAN S1 能在 BL21中表达 , 表达的融
合蛋白约 6612 kD, 相当于插入基因编码蛋白 (4014 kD ) 和载体上谷胱甘肽巯基转移酶 (2610 kD )
的分子量之和 (图 1, E)。所以 , 3段序列来自同一个基因 , 拼接序列为 D aAN S1 的全长 cDNA序列
(图 2)。
图 1　田薯 D aANS1 全长 cD NA序列的中间片段 ( A)、3′末端 ( B)、5′末端 ( C)、全长验证 ( D ) 的 PCR
扩增产物及 pET2Z ix iaoANS1在 BL21中表达融合蛋白 ( E) 的电泳图
M: 100 bp DNA ladder marker; 1: PCR扩增产物 ; M1: 混合标准蛋白 ;
CK: 无 IPTG的对照 ; 12 h: pET2ZixiaoANS1受 IPTG诱导表达 ;
箭头所指为目的产物。
F ig. 1 Electrophoreses of both PCR am plif ica tion products for m iddle segm en t, 3′2end sequence, 5′2end sequence,
com plete sequence ver if ica tion of D aANS1 full2length cD NA sequence from D ioscorea a la ta L.
and the fusion prote in s expressed by pET2Z ix iaoAN S1 in E1coli BL21
M: 100 bp DNA ladder marker; 1: PCR amp lification p roduct; M1: Standard markers of p roteins
with different molecular weights. CK: The control without IPTG;
12 h: The IPTG2induced time of the pET2ZixiaoANS1 exp ression. The
p roducts underlined with arrows were expected.
212　 D aAN S1全长 cD NA序列及其编码氨基酸序列的特征分析
D aANS1全长 cDNA序列 1 387 bp (图 2) 可形成 1 077 bp的最大 ORF, 5′端和 3′端的非翻译区分
别有 9 bp和 301 bp; 该序列 5′端第一个起始密码子 ATG位于第 10～12 bp, 和周围碱基构成 ATAAT2
GG序列 ; 该序列 3′端含有 28个 poly (A + ) 尾 , 此前第 1 268～1 273 bp处有 AATAAA的典型加尾信
号。
D aAN S 1 最大 OR F可编码 358个氨基酸 , 其分子量和等电点分别为 4014 kD 和 5126 , 且
有 2个保守功能域 (图 2 ) , 一个 PcbC功能域 (第 51～340处 ) , 具异青霉素 N 合成酶和双
加氧的作用 ; 另一个是 2 - 酮戊二酸 - Fe2 + - 双加氧酶家族的保守结构域 (第 217～313处 ) ,
行使双加氧作用 , 其中有与 Fe2 + 结合所需的组氨酸 ( H is) 5 个 (第 238、 243、 249、 276、
294处 ) 和天冬氨酸 (A sp ) 3个 (第 240、 260、 279处 ) , 及与 2 - 酮戊二酸特异结合的精
氨酸 (A rg) 2个 (第 295、 304处 ) 。
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图 2　D aANS1 三段 cD NA核苷酸所拼接的全长序列及其推定的氨基酸序列
加下划线的碱基为全长验证引物设计的序列 ; 方框内的氨基酸序列是异青霉素 N合成酶和双加氧
作用的保守区域 , 其中方框内阴影部分是 2 - 酮戊二酸 - Fe2 + -双加氧酶
家族的保守结构域。
F ig. 2　 Full2length nucleotide sequence com b ined w ith three parts of D aANS1 cD NA
and its deduced am ino ac id sequence
Nucleotide sequences emphasized by underlines were the p rimers designed for the verification of
full2length cDNA; am ino acid sequence in box was the conserved domain of Isopenicillin N synthase and
dioxygenases, the shaded part of which was the conserved structural domain of the 22oxoglutarate2 and
Fe ( II) 2dependent oxygenase superfam ily.
213　D aAN S1全长 cD NA序列及其编码氨基酸序列的同源性及分子进化分析
在基因全长 cDNA序列、编码区 cDNA序列及编码氨基酸序列水平上 , D aAN S1 与所选被子植物
(图 3) ANS基因的同源性分别为 5415% ～7613%、6110% ～7817%、6410% ～8012% , 均比与裸子
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　9期 周生茂等 : 山药 ANS基因的克隆和分子特性及其与花青素积累的关系 　
植物银杏的同源性高 (4014%、4810%和 5114% ) ; 在被子植物 AN S基因中 , D aANS1 和单子叶植物
鸢尾科的唐菖蒲 (AB284174和 AB362370) 或蓝蝴蝶 (AB185902) 的 AN S基因有最低同源性 , 和双
子叶植物旋花科的圆叶牵牛 ( EU032614和 EU032612) 或甘薯 (AB02378611) 的 ANS基因有最高同
源性。这些物种 AN S基因所编码的氨基酸序列构建系统发生进化树 (图 3) 显示 , 田薯首先和双子
叶旋花科植物甘薯属的甘薯、圆叶牵牛和牵牛属的大花牵牛聚为一小类 , 再和单子叶唇形科鞘蕊花属
植物彩叶草聚于一亚类 , 最后才和其他物种归为一大类 ; 根据 AN S基因能够将旋花科的甘薯属 (甘
薯和圆叶牵牛 ) 与牵牛属大花牵牛 , 十字花科的芸薹属 (芥菜和芜菁 ) 与拟南芥属拟南芥 , 以及大
豆属中不同的大豆种 ( EU33454811、AY38282811、AY38283011、AY38282911 ) 等区分开来 , 但是
不能将裸子植物银杏和所有被子植物区分开来 , 同样也不能与单子叶植物的田薯、蓝蝴蝶、唐菖蒲、
彩叶草和双子叶植物区分开来 ; 对于科等级的植物 , 虽然大部分能区分开来 , 但是单子叶鸢尾科植物
的蓝蝴蝶和唐菖蒲分别和其他科植物聚在一类后 , 再归为一类。
图 3　田薯 ‘紫小’与其他植物的 ANS同源基因所编码氨基酸序列经 C lusta lW 和 TreeV iew软件构建的系统树
箭头所指为 D aANS1; 黑体标记表示单子叶植物 ;
下划线标记表示裸子植物 ; 其余是双子叶植物。
F ig. 3 　Phylogenetic tree of the deduced am ino ac id sequences of m ultiple ANS genes from
D. a la ta L. ‘Z ix iao’and other h igher plan ts by C lusta lW and TreeV iew
The bold arrowhead showed D aANS1. The bold and black symbols underlined monocots,
the underline emphasized symbol rep resented gymnosperm,
and the others were dicots.
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214　D aAN S1表达与花青素积累的关系
RT2PCR (图 4, A) 和 Northern杂交 (图 4, B) 分析 D aANS1表达的结果显示 , D aAN S1在田薯
地下块茎发育各期均有表达 , 表达丰度自初前期增至盛前期 , 达最强 ; 此后 , 从盛中期一直降低到最
低的后中期 ; 最后 , 在收获时又有所增强。花青素合成酶的活性变化规律 (图 5) 与 D aANS1 表达模
式具协同性。尽管地下块茎花青素含量变化 (图 5) 与 D aANS1表达及其酶活性的变化规律也有同步
性 , 但是 , 单株地下块茎积累花青素总量的变化模式明显不同 , 整个生育过程一直增加 , 而且盛中期
前增加较慢 , 由初前期缓慢增至盛中期 , 此后迅速增至收获时达最大。
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3　讨论
本研究成功地从田薯地下块茎中分离到 D aAN S1全长 cDNA序列 , 因为该序列不但 3′末端含有 28
个 poly (A + ) 尾及其加尾的典型信号 AATAAA , 为真核生物基因全长 cDNA序列 3′末端典型特征 ,
而且也有 5′末端典型特征 , 即序列 5′端第一个起始密码子 ATG处于 ATAATGG序列中 , 与真核生物
基因全长 cDNA序列 5′端第一个起始密码子 ATG通常位于保守的 AXXATGG序列中的情况相一致
( Kozak, 1984) ; 同时 , 全长 cDNA序列的 PCR验证和原核表达的结果也证实该序列是一个完整基
因。在线分析既证实了该序列是植物 ANS基因的一员 , 也发现其所推导的氨基酸序列含有 PcbC功能
域和 2 -酮戊二酸 - Fe2 + -双加氧酶家族的保守结构域 , 是双加氧酶催化活性中心特征 , 而且在该中
心含有与 Fe2 +结合所需的保守 H is、A sp, 及与 2 -酮戊二酸特异结合的 A rg, 为植物双加氧酶家族基
因保守的典型特征 , 这些特征与其他植物 ANS及双加氧酶家族的 F3H和黄酮醇合成酶的催化活性中
心特征一致 (Rosati et al. , 1999) , 但是 , D aAN S1编码这些保守氨基酸数目与其他植物 AN S基因的
不同 , 蒺藜苜蓿含 2个 H is、1个 A sp和 1个 A rg ( Pang et al. , 2007) , 而田薯 D aAN S1的比蒺藜苜蓿
ANS同源基因相应地多 3、2、1个。
D aANS1与所选其他物种 AN S基因相比 , 无论在全长 cDNA序列上还是编码区序列及其编码氨基
酸序列上 , 和被子植物的同源性要高于与裸子植物银杏的同源性。同时 , 通过它们的氨基酸序列构建
系统发生树发现 , 虽然田薯是具有一定双子叶特性的单子叶植物 (Rubatzky & Yamagucbi, 1997) , 但
是田薯 D aANS1和双子叶旋花科甘薯属植物的 AN S基因具有最高的同源性而首先成为一类 , 然后和单
子叶唇形科鞘蕊花属植物彩叶草的 AN S基因聚为一大亚类 , 说明 AN S基因进化更趋向于双子叶植物
ANS基因。此外 , AN S基因所编码氨基酸不能将被子植物和裸子植物、单双子叶植物及科间植物完全
区分开来 , 而在属和种的分类级别上可将植物完全区分 , 这可能是专一代谢途径的酶基因较公共代谢
途径的进化速率快 (Lu & Rausher, 2003) 的结果。
田薯地下块茎各时期的 D aAN S1表达丰度、ANS酶活性与花青素含量在变化模式上有协同性 , 说
明 ANS可能是田薯地下块茎花青素合成的关键点 , 花青素含量因 ANS酶活性而变化 ; ANS酶活性则
受到 D aAN S1表达丰度的强弱所左右 ; D aAN S1主要在转录水平上感应各种信号而受到调控 , 这和类
黄酮途径中酶结构基因主要在转录水平上受到调控 (Davies & Schwinn, 2003) 的结论相一致。但是 ,
D aAN S1表达丰度、ANS酶活性和花青素总量变化不同 , 这可能是块茎成熟前不断膨大 , 花青素也不
断积累 , 降解相对少或没降解之故。
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