全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（4）：637–643 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2010–11–22；修回日期：2011–03–15
基金项目：国家自然科学基金项目（30971977）；北京市自然科学基金项目（6082005）；北京市自然科学基金和北京市教委联合资助重
点项目（KZ200910020001）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：sfmn@tom.com）
草莓果实发育过程中糖代谢相关基因的表达分
析
柴叶茂，贾海锋，李春丽，秦 岭，沈元月*
（农业应用新技术北京市重点实验室，北京农学院植物科学技术学院，北京 102206）
摘 要：为了分析草莓（Fragaria × ananassa Duch.）果实发育过程中可溶性糖积累与相关基因表达
量的关系，以‘杜克拉’草莓 7 个发育时期的果实为试材，利用实时荧光定量 RT-PCR 的方法，分析果实
发育中蔗糖转运蛋白及糖代谢关键酶（酸性转化酶、蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶）4 个基因的表达量以
及可溶性糖含量的变化趋势。结果表明，蔗糖、葡萄糖和果糖含量随着果实发育都呈逐渐增加的趋势，
尤其蔗糖积累与果实成熟的关系较密切。随着果实发育，蔗糖磷酸合成酶基因表达量呈逐渐增加的趋势，
尤其在果实发育的后期增加较快；蔗糖合成酶和酸性转化酶基因表达量除了白熟期和转色期外，呈逐渐
降低的趋势；蔗糖转运蛋白基因表达量呈先升后降，降后又升的变化趋势，尤其在白熟期前急剧增加。
结合可溶性糖和基因变化趋势分析表明，蔗糖转运蛋白和蔗糖磷酸合成酶在草莓果实发育过程中发挥着
重要的作用。
关键词：草莓；果实；发育；可溶性糖；蔗糖转运蛋白；荧光定量 PCR
中图分类号：S 663.1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）04-0637-07

Transcriptional Analysis of Sugar Metabolism-related Genes During
Strawberry Fruit Development
CHAI Ye-mao，JIA Hai-feng，LI Chun-li，QIN Ling，and SHEN Yuan-yue*
（Beijing Key Laboratory for Agricultural Application and New Technique，College of Plant Science and Technology，
Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China）
Abstract：To analyze the relationship of sugar accumulation with sugar-related gene expression
during strawberry fruit development，receptacle of‘Fugilia’strawberry（Fragaria × ananassa Duch.）
was used and real-time RT-PCR primers were designed to analyze both changes of the mRNA expression
of four sugar accumulation-related genes and soluble sugar contents，respectively. The main results showed
that sucrose，glucose and fructose contents increased continually during fruit development，in particular
sucrose accumulation was closely related to fruit ripening. The mRNA expression level of sucrose
phosphate synthase（SPS）gene increased gradually during fruit development，and a rapid increase occurred
in later developmental stages；The mRNA expression level of sucrose synthase（SS）and acid invertase
（AI）decreased continually in addition to white or turning stages；The mRNA expression level of sucrose

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transporter（SUT1）displayed increased firstly，and then declined，finally increased again，in particular
increased rapidly before white period. Combinational analysis of the changes of soluble sugars content and
gene expression demonstrated that sucrose carrier and sucrose phosphate synthase play an important role
in regulation of strawberry fruit ripening.
Key words：strawberry；fruit；development；soluble sugars；sucrose transporter；real-time RT-PCR

糖是果实生长发育的物质基础，与果实发育密切相关。果实中糖的种类及比例也直接关系到果
实的甜度及风味（陶红 等，2010）。在草莓果实中，糖积累主要以蔗糖、葡萄糖和果糖 3 种可溶性
糖的形式存在（Forney & Breenp，1985）。蔗糖是“源—库”间叶片光合同化物的主要运输形式，
因此蔗糖的运输和代谢在果实发育中起着关键的作用（Yamaki，1995）。果实内蔗糖的运输主要依
靠蔗糖转运蛋白（sucrose transporter，SUT）（Sauer，2007），而蔗糖代谢的相关酶主要为转化酶
（invertase，Ivr）、蔗糖合成酶（sucrose synthase，SS）和蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate，SPS）
（Hubbard et al.，1991）。果实中转化酶主要包括酸性转化酶（acid invertase，AI）和中性转化酶（neutral
invertase，NI）。由于酸性转化酶与果实发育关系密切（Pan et al.，2006），因此，作者重点研究转
化酶中酸性转化酶的作用。
尽管通过生物化学方法证实了酸性转化酶、蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶和蔗糖转运蛋白与草
莓果实的发育有关（Ofosu-Anim et al.，1996；陈俊伟 等，2007），但目前草莓果实糖积累的分子机
制还不清楚。为此，本研究中利用分子生物学方法，在通过对草莓果实中酸性转化酶、蔗糖合成酶、
蔗糖磷酸合成酶和蔗糖转运蛋白基因的序列分析的基础上，设计实时荧光定量 PCR 引物，研究上
述 4 个基因和可溶性糖在草莓果实发育过程中的变化规律，为揭示草莓果实中可溶性糖积累的分子
机制和果实品质的调控奠定研究基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试材为‘杜克拉’草莓（Fragaria × ananassa Duch.‘Fugilia’），于 2009 年取自北京农学院试
验基地。采集花后 7 ~ 28 d 的果实，参照文献（Fait et al.，2008）将果实划分为 7 个时期：小绿（幼
果期，花后 7 d）、大绿（大果期，花后 14 d）、浅绿（绿熟期，花后 18 d）、纯白（白熟期，花后 21
d）、始红（始熟期，花后 23 d）、片红（转色期，花后 25 d）、全红（成熟期，花后 28 d）。每个时
期样品设置 3 个重复。摘取鲜样后立即用刀片将果肉与种子分离，收集果肉液氮冷冻，贮存于–80 ℃
超低温冰箱中待用。
1.2 可溶性糖含量测定
从–80 ℃超低温冰箱中取样品 25 g，在液氮中研磨成粉末，准确称量 0.5 g，加入 10 mL 80%
乙醇于 80 ℃水浴 3 min，10 000 × g 离心 10 min，收集上清于 100 mL 三角烧瓶中，残渣用 10 mL 80%
乙醇于 80 ℃水浴 20 min，10 000 × g 离心 10 min，重复 2 次，合并上清，剩余残渣用 80%乙醇 1 mL
洗涤过滤，滤液移入 10 mL 试管中加 2 滴 5% α–萘酚，混匀后，沿管壁缓缓加入浓硫酸，分层处如
无紫色环出现，说明样品中的糖被完全提出。合并后的上清在沸水中蒸干，用 20 mL 超纯水洗 2 次，
定容到 50 mL，取 2 mL 过 LC-18 固相萃取柱，弃去最初的 1 mL，收集后面的 1 mL 过 0.45 μm 滤膜，
上机检测。
4 期 柴叶茂等：草莓果实发育过程中糖代谢相关基因的表达分析 639

色谱条件为：美国安捷伦公司高效液相色谱仪 Agilent Technologies 1200 Series，6.5 × 300 mm
Sugar-PakTM-1 柱（Waters 公司），化学工作站版本为 B.02.01-SR2，流动相为超纯水，流速 0.4
mL · min-1，柱温 60 ℃，示差折光检测器，检测器温度 50 ℃，进样量 20 μL。所用标样蔗糖购自 Sigma
公司。测定结果回收率分别为葡萄糖 90.61%，果糖 86.30%，蔗糖 97.61%。
1.3 总 RNA 的提取及 cDNA 第一链的合成
用 EASYspin 植物 RNA 快速提取试剂盒（北京博迈德科技发展有限公司）提取草莓果实中的总
RNA。以提取的总 RNA 为模板，利用 Clontech SMARTTM Library 试剂盒（购自 Clontech）合成 cDNA
第一链用于扩增 SUT 基因片段。
1.4 基因片段的克隆
从 GenBank 的核酸（nr）数据库中检索到草莓中的 AI、SPS、SS 等基因的部分序列，其登
录号分别为：AB275667.1、AB267869.1 和 AB275666.1。再根据 GenBank 中的已知的其他物种的序
列，设计了 SUT1 基因的兼并引物：SUT1 上游 5′-TT（C/G）GGGTGGG（C/A）CC（T/G）CCAGCT
GTC-3′，下游 5′-AG（C/T）AAACA（A/G）ATCGAT（A/T）TGAAGAAGC-3′。
PCR 反应条件为 94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，35
个循环；72 ℃最后延伸 10 min。PCR 产物经回收、纯化，与 PMD19-T Vector（购自宝生物工程公
司）连接，转化 DH5α（购自天根公司）感受态细胞，蓝白斑筛选后测序（上海生工生物工程技术
服务有限公司）。
1.5 实时荧光定量 PCR 分析
对 7 个时期样品分别提取总 RNA，并加入 DNaseⅠ酶祛除 DNA 污染，体系为 2 μL DNA 酶，
45 μL 总 RNA 和 5 μL DNaseⅠ酶 buffer。37 ℃放置 12 ~ 15 min，然后用 RNA 清洁试剂盒纯化 RNA
（购自北京博迈德科技发展有限公司），并使用 MMLV First cDNA Synthesis Kit（购自上海生物工
程技术服务有限公司）合成第一链 cDNA，利用软件 Primer 5 设计了荧光引物。
引物 SPS（AB267869.1）上游：5′-GAATGTCCCTATGTTATTTACTGG-3′；下游：5′-TCCTGTCTG
GTGCTGGTTAT-3′。SS（AB275666.1）上游：5′-TTATCCCTCGCATTCTTATT-3′；下游：5′-CAATTCC
CTTCTCGGTTCTA-3′。AI（AB275667.1）上游：5′-CCGATACCGAGTCCGATGA-3′，下游：5′-TTCAA
CAACTGCTCCTGCTT-3′。SUT1 上游：5′-CTACAGCGACCGTAACACC-3′，下游：5′-ACAACAAATA
CAGCCACAGC-3′；ACTIN（AB116565.1）上游：5′-TGGGTTTGCTGGAGATGAT-3′，下游：5′-CAGTT
AGGAGAACTGGG TGC-3′；
以 ACTIN 为内参基因，按照 SYBR Premix Ex TaqTM 试剂盒（购自宝生物工程有限公司）操作
指导，采用实时荧光定量 PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）的方法，检测基因的相对表
达量。
对反转录所得的 cDNA 分别进行 5 个梯度稀释（1、10-1、10-2、10-3、10-4），实施荧光定量反
应，然后绘制相对标准曲线。相关基因和内标 ACTIN 基因 RT-qPCR 扩增的总反应体系为 20 μL，包
括：10 μL SYBR premix Ex Taq 混合液，2 μL cDNA，0.4 μL 上游引物（10 μmol · L-1），0.4 μL 下
游引物（10 μmol · L-1），7.2 μL 无核酸污染的灭菌水。反应程序为：94 ℃预变性 2 min，94 ℃变
性 20 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，40 个循环，每次循环第 3 步进行荧光采集。最后从 60 ℃
升温至 95 ℃，每隔 30 s 上升 0.5 ℃，总共 71 个循环。检测其荧光值，绘制熔点曲线。标准品 cDNA
和待测样品均设置 3 次重复。
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2 结果与分析
2.1 草莓果实中可溶性糖含量变化
从图 1 可以看出，草莓果实中蔗糖、葡萄糖和果糖含量总体上呈增加的趋势。葡萄糖和果糖呈
现了相似的变化趋势，而蔗糖的增加趋势先慢后快，从小绿果（花后 7 d）至浅绿果（花后 18 d），
同葡萄糖和果糖相比，蔗糖积累最慢；浅绿至纯白（花后 18 ~ 21 d），蔗糖迅速增加；纯白至始红
（花后 21 ~ 23 d），三者呈现了相似的变化趋势；始红至全红（花后 23 ~ 28 d），蔗糖再次迅速增加，
并且积累最快，最终含量是果糖和葡萄糖的 1.25 倍。
图 1 草莓果实发育过程中可溶性糖变化
Fig. 1 The change of soluble sugar content during strawberry fruit development

2.2 草莓果实中蔗糖转运蛋白基因的克隆
通过对 NCBI 核酸数据库靶基因序列搜索，发现草莓中存在可直接用于实时荧光定量 PCR 分析
的 SPS、SS、AI 基因的部分序列，而无 SUT1 基因序列的相关信息。为了设计该基因实时荧光定量
特异 PCR 引物，设计兼并引物，从草莓果肉 cDNA 库中克隆 SUT1 基因部分片段。图 2 和图 3 分别
为通过RT-PCR技术克隆得到的 SUT1 573 bp的条带及其核苷酸序列（命名为FaSUT1）。基于FaSUT1
基因 NCBI BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）同源性序列分析表明，FaSUT1 与 Betula
pendula（AF168771.1）、Juglans regia（AY504969.1）、Vitis vinifera（XM002267804.1）和 Nicotiana
tabacum（FM164639.1）的同源基因相似性分别为 73%、72%、71%和 69%，相似性较高。该序列推
测蛋白含有一个蔗糖转运蛋白超家族保守序列（图 4），表明已成功克隆到了 SUT1 基因片段，可以
用于设计荧光引物做 RT-PCR。










图 2 FaSUT1 基因扩增片段
Fig. 2 The amplified fragment of FaSUT1 gene
M：DL 2000 marker.
4 期 柴叶茂等：草莓果实发育过程中糖代谢相关基因的表达分析 641


图 3 FaSUT1 基因部分 cDNA 序列及其推导的氨基酸序列
Fig. 3 A fragment of cDNA sequence of FaSUT1 gene and its deduced amino acid sequence



图 4 FaSUT1 氨基酸保守序列
GPH-sucrose（superfamily）代表蔗糖-质子共运输蛋白（超家族），该类蛋白含有 12 个跨膜区域。
Fig. 4 The deduced conserved amino acid sequence of FaSUT1
GPH（Glycoside-Pentoside-Hexuronide）-sucrose（superfamily）represents sucrose-proton co-transportation transporters（superfamily）
with 12 trans-member regions.

2.3 草莓果实发育过程中蔗糖代谢相关酶及载体基因表达量变化趋势
根据上述克隆的 FaSUT1 基因片段和其他基因已知的部分核酸序列，设计实时荧光定量特异
PCR 引物，对果实发育过程中各基因表达量进行分析。从图 5 可以看出，SPS 表达量随着果实发育
呈逐渐增加的趋势，但也明显分为 3 个不同的变化阶段：从小绿至浅绿表达量缓慢增加；纯白至始
红表达量增加明显加快；片红至全红表达量迅速增加；SS 基因表达量随着果实发育，除了纯白果外
都呈逐渐降低的趋势；AI 基因表达量随着果实发育，除了片红果外呈逐渐降低的趋势，尤其果实后
期发育降幅较大；SUT1 基因表达量随着果实发育基本上呈先升后降、降中有升的变化趋势，尤其
浅绿至白果表达量迅速增加并达到高峰，随后伴随着色呈现降—升—降变化趋势，全红时降至最低
点。
总之，从小绿至全红草莓整个果实发育过程中，AI 和 SS 基因表达量呈先高后低逐渐降低的变
化趋势，只是降中升高时期不同；SPS 基因呈先低后高的持续增加变化趋势；SUT1 基因表达量呈先
升后降复杂的变化趋势（图 5）。
642 园 艺 学 报 38 卷

图 5 草莓果实发育过程中蔗糖代谢相关酶及载体基因表达量变化趋势
Fig. 5 The changing trend of sucrose metabolism-related enzymes and its transporter during strawberry fruit development
3 讨论
糖的运输和分配是果实发育的物质基础，是决定作物产量和品质的重要因素。前人证实果实发
育期间糖积累的强度与糖代谢相关酶的活性密切相关（Vizzolo et al.，2003）。陈俊伟等（2007）以
设施栽培花后 1 ~ 8 周枥乙女草莓果实为试材，通过生物化学方法分别检测了糖代谢关键酶蛋白的
活性，发现草莓果实的总糖含量随果实发育持续积累，但蔗糖的快速积累对果实后期糖的积累贡献
最大；在果实发育前期草莓酸性转化酶活性随果实发育而下降，但在果实发育后期，酸性转化酶活
性活力随果实成熟而急剧上升；在果实蔗糖快速积累期蔗糖磷酸合成酶反而降到较低水平；在整个
果实发育过程中，蔗糖合成酶合成方向和降解方向酶的活性呈逐渐下降相似的变化趋势。作者认为，
蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶对草莓果实后期蔗糖的快速积累贡献较少（陈俊伟 等，2007）。
本研究中发现：（1）杜克拉草莓果实从小绿至浅绿的前期发育过程中，果实中糖积累主要以葡
萄糖和果糖为主，蔗糖含量相对较低，这与果实中酸性转化酶基因高水平表达相吻合。这是因为在
酸性转化酶活性较高的条件下，蔗糖积累较少（Darnell et al.，1994），该基因转录水平结果与陈俊
伟等酶活检测结果基本一致；（2）果实从浅绿至始红期发育过程中，3 种可溶性糖先是快速增加，
而后又迅速降低，在白熟期形成了第一次高峰。相关基因表达水平分析表明，果实变浅绿后蔗糖磷
酸合成酶和蔗糖合成酶基因转录水平略微升高，酸性转化酶基因转录水平显著降低，蔗糖转运蛋白
基因转录水平急剧升高至白熟期达高峰，这些基因的转录变化有助于蔗糖快速积累；（3）果实从始
红至全红着色期，蔗糖合成酶基因表达水平持续降低，蔗糖转运蛋白和酸性转化酶基因表达都有一
次升高过程，蔗糖磷酸合成酶基因表达水平急剧升高，这些基因的转录变化不仅促进了蔗糖的快速
积累，而且有助于己糖的积累。这是因为，要实现果实发育后期蔗糖和己糖同时快速增加，首先蔗
糖积累强度要大（通过 SPS 和 SUT1 库高表达实现），部分蔗糖在酸性转化酶基因高转录水平作用下
可同时提高己糖积累量。同前人相关酶蛋白活性检测结果（陈俊伟 等，2007）比较分析发现，果实
发育后期蔗糖合成酶基因转录水平与其酶活水平的变化完全吻合；酸性转化酶基因转录水平与其酶
活水平的变化基本一致；蔗糖磷酸合成酶基因转录水平与其酶活水平的变化呈相反的趋势。出现这
4 期 柴叶茂等：草莓果实发育过程中糖代谢相关基因的表达分析 643

种情况，可能与草莓品种有关，也可能与蔗糖磷酸合成酶基因存在翻译后加工有关。
总之，杜克拉草莓果实从花后到浆果成熟只需要 1 个月左右的时间，从果实褪绿到成熟时间更
短，一般只需两周左右。在如此短的时间内，草莓果实大小不但要增加 1 倍左右，而且要完成一系
列生理变化过程，其中最明显的变化是褪绿和着色。由于伴随果实褪绿和着色，蔗糖含量呈现了两
次急剧上升：第一次升高主要归因于蔗糖转运蛋白基因高水平表达；第二次升高除了蔗糖转运蛋白
外，主要归因于蔗糖磷酸合成酶基因高水平表达。前人研究表明，植物中的蔗糖在细胞间的运输有
两种途径：通过胞间连丝进行的共质体途径和通过细胞间隙进行运输的质外体途径，质外体途径中
需要通过载体将糖装载入细胞（Oparka & Prior 1988；Oparka，1990）。Zhang 等（2006）研究发现，
在葡萄果实发育中，前期当可溶性糖的积累水平很低时，果实内韧皮部卸载采取共质体途径；当果
实发育进入成熟期，可溶性糖含量迅猛升高时，韧皮部卸载路径适应性地转换为质外体载体介导路
径。值得关注的是，蔗糖磷酸合成酶基因高水平表达发生在着色前，因此该基因对调控草莓果实成
熟启动具有重要的意义。通过细胞生物学和分子生物学进一步揭示蔗糖转运蛋白在草莓果实发育中
的功能将是后续研究的重要内容。

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