全 文 ：园 艺 学 报 ， （ ）： – 2011 38 7 1341 1348 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–04–07；修回日期：2011–06–08
基金项目：国家苹果产业技术体系项目（nycytx-08-01-03）；陕西省‘13115’科技创新工程项目（2010ZDKG-69）
‘秦冠’苹果MdWRKY基因亚细胞定位及原核
表达
高 华1,2，樊红科1，党志国1，王 飞1，王雷存1,2，刘振中1,2，赵政阳1,2,*
（1西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌 712100；2陕西省苹果工程技术研究中心，陕西杨凌 712100）
摘 要：以‘秦冠’苹果为试材，采用 RT-PCR 方法获得了一个 WRKY 基因，全长 1 224 bp，推断
其编码 331 个氨基酸，命名为 MdWRKY。亚细胞定位分析 MdWRKY 蛋白分布在细胞核内，属于核蛋白。
实时定量分析结果显示，MdWRKY 基因受苹果斑点落叶病菌的诱导，表明其可能参与植物与病原菌的互
作。随后进行原核表达分析，SDS/PAGE 电泳结果表明表达蛋白与其蛋白大小一致。
关键词：苹果；转录因子；克隆；亚细胞定位；表达
中图分类号：S 661.1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）07-1341-08

Studies on Subcellular Localization and Expression in E.coli of MdWRKY
from‘Qinguan’Apple
GAO Hua1,2，FAN Hong-ke1，DANG Zhi-guo1，WANG Fei1，WANG Lei-cun1,2，LIU Zhen-zhong1,2，
and ZHAO Zheng-yang1,2,*
（1College of Horticulture，Northwest A & F University，Yangling，Shaanxi 712100，China；2Apple E & T Research Centre
of Shaanxi Province，Yangling，Shaanxi 712100，China）
Abstract：A WRKY gene，designated as MdWRKY，was isolated from‘Qinguan’apple leaves using
reverse transcription PCR approaches. MdWRKY was 1 224 bp and encoded a 331 amino-acid protein.
Analysis of subcellular localization indicated that MdWRKY protein was targeted to the nucleus.
Quantitative RT-PCR analysis showed that MdWRKY transcription was induced by Alternaria alternata f
sp. mali indicating that MdWRKY gene may be involved in the interaction between plant and pathogen.
Then expression in E. coli was conducted，SDS/PAGE result demonstrated that expression proteins
consistent with the size of expected protein，which provided a foundation for further purifying and function
study of MdWRKY.
Key words：apple；transcription factors；clone；subcellular localization；expression

植物为适应外界环境，形成一系列的信号转导途径以抵御各种生物和非生物胁迫（Lagace &
Matton.，2004；Sujeeth et al.，2010）。很多研究表明，在抗病防御反应途径中转录因子基因扮演了
重要角色（Chen & Chen，2002；Zhang，2003；Ulker & Somssich.，2004；Zhou et al.，2008；Seo et al.，


* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zhaozy@nwsuaf.edu.cn）
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2010）。WRKY转录因子是一个大家族，广泛参与植物对生物和非生物胁迫的应答反应、器官发育
和衰老等一系列生理活动，尤其在抗病和抗逆反应中起重要作用（Ulker & Somssich，2004）。WRKY
蛋白含有 1 个或 2 个WRKY结构域，该保守域为 60 个氨基酸残基，含有保守的WRKYGQK序列，
并且有一个类似C2H2型锌指结构。根据WRKY域的数量及其锌指结构的特征，将WRKY蛋白质家族
分为 3 个亚家族（组），第Ⅱ组根据WRKY域聚集的不同分枝分为Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd 、Ⅱe等 5
个亚组（Eulgem et al.，2000）。Ⅱd亚家族成员AtWRKY7、AtWRKY11 和AtWRKY17 在抗病防御反
应中其负向调控作用（Joumot-Catalino et al.，2006；Kim et al.，2006；Zheng et al.，2007）。
本研究中从抗病的‘秦冠’苹果中克隆到与抗病相关的一个 WRKY 基因，暂命名为 MdWRKY
（GenBank 登录号为 HM859901），并对其进行初步的生物信息学、病原诱导表达和原核表达分析，
以其为进一步探讨其在苹果抗病过程中的作用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
试验在西北农林科技大学白水苹果试验站进行。供试材料为 4 年生‘秦冠’苹果树，选生长势
一致的 6 株树，每株选 3 ~ 5 个一年生枝条（每株共 20 片幼叶）。接种苹果斑点落叶病（A. alternata
f. sp. mali）菌种。2009 年 5 月底，将浓度为 1 × 104 Cfu · mL-1的病原菌孢子液喷施苹果幼叶正面，
而后用透明塑料袋套严保湿，于接种后 0、1、2、3、4、5、6、7 d采收叶片，置液氮中保存备用。
1.2 RNA的提取及MdWRKY1 基因的克隆与序列分析
接种后 0、1、2、3、4、5、6、7 d的苹果叶片按照Gasic（2004）的方法提取RNA。cDNA的合
成采用Promega公司的反转录试剂盒， 1 μg DNA酶处理的总RNA 70 ℃变性 5 min，加
PrimeScriptTMRtase反转录，42 ℃保温 60 min。根据苹果转录因子数据库中登录的WRKY基因设计引
物，上游引物：5′-ACCAACAACTACAGTGCATTA-3′；下游引物：5′-TTTTTGTGAACTAGTAGACC
C-3′。以 8 次取样的苹果叶片 cDNA 混合物为模板，进行 PCR 扩增。反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃
30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，29 个循环；72 ℃ 10 min。PCR 产物回收及质粒提取参照天根生化科
技有限公司试剂盒说明书进行，检测确定阳性克隆送上海生工生物技术有限公司测序。
利用 NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST/）的 BLAST 在线工具对 GenBank 的非冗余
蛋白数据库序列进行比对分析；利用 InterProScan（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/InterproScan/）预测
结构域和功能位点；利用 CLUSTALW2 软件（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/ clustalw2/index. html）进
行进化树分析；利用 DNAMAN 软件进行氨基酸同源性比对。
1.3 亚细胞定位
根据目的基因 MdWRKY 序列及核定位载体 pBI221-GFP，设计引物，上游引物：gggta taga（Kpn
Ⅰ）a tggcc gttga tttcat g；下游引物：ggggg tacc（XbaⅠ）a gaaga ttcta gaata a，扩增 MdWRKY 基因。
扩增产物用 KpnⅠ和 XbaⅠ进行双酶切，克隆到核定位载体 pBI221-GFP 中，构建瞬时表达载体
pBI221-GFP-MdWRKY。经过测序鉴定的 pBI221-GFP-MdWRKY 质粒载体和空载体 pBI221-GFP 利
用 PDS-1000/He 基因枪在压力 1 100 psi 轰击洋葱表皮细胞，轰击后的洋葱表皮细胞 22 ℃暗培养 18
h 后在荧光显微镜下观察 GFP 的表达情况。
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1.4 定量RT-PCR分析
根据 MdWRKY 序列设计半定量 PCR 引物，上游引物：5′-CGACGGCTATGGACATGGACTG-3′；
下游引物：5′-CTTGGCTCTGGTTTTGGGTTTG-3′，苹果 Actin 作为内参基因，上游引物：5′-CATCCA
GGCTGTTCTTTCCCTCT-3′；下游引物：5′-GCCACGCTCAGTCAAAATTTTCA-3′。应用 IQ5 进行
实时定量 PCR 分析参考 Sambrook 等（1989）的方法。
1.5 MdWRKY基因原核表达载体的构建及鉴定
根据克隆的MdWRKY序列以及原核表达载体pGEX-4T-1 多克隆酶切位点序列设计引物，其上游
引物中引入BamHⅠ酶切位点，下游引物中引入SalⅠ酶切位点，上游引物：5′-GGGGGATCCAACA
TCTGCGTCATGCCA-3′；下游引物：5′-GGGCCATGGGGCCTGTTGTTCTTCTCC-3′，以 8 次取样的
叶片cDNA混合物为模板进行PCR扩增，获得的pGEM-MdWRKY重组质粒进行PCR、酶切鉴定及
DNA测序分析（Hames & Rickwood，1990）。
1.6 重组MdWRKY基因在大肠杆菌中的表达
从平板上分别挑取阳性克隆表达菌单菌落和一个含pGEX-4T-1 空载体的表达菌单菌落，分别接
入含有 100 μg · mL-1Amp的 20 mL LB液体培养基中。37 ℃，180 r · min-1过夜振荡培养。次日从培养
菌液中各取 0.2 mL加入 20 mL LB液体培养基中，37 ℃，180 r · min-1振荡培养 3 h。随后加入异丙基
硫代–β–D半乳糖苷（IPTG）诱导剂（终浓度分别为 0.1、0.2、0.4，0.6 mmol · L-1）进行诱导表达。
同时以未加IPTG诱导的为负对照。37 ℃，200 r · min-1振荡培养，诱导一定时间（1、2、3、4、5、6
h）后收集菌体。室温 12 000 r · min-1离心 1 min，弃上清，100 μL 1 × SDS凝胶加样缓冲液[50
mmol · L-1，Tris-HCl（pH 6.8），2% SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油，1%DTT]重悬，100 ℃水浴 5 min，
室温 12 000 r · min-1离心 1 min。取 20 μL样品上样，进行SDS-PAGE（浓缩胶浓度 5%和分离胶浓度
12%）电泳，电压 80 V，电泳 12 ~ 14 h。凝胶用考马斯亮蓝R-250 染色并脱色至背景清晰。
2 结果与分析
2.1 MdWRKY基因全长cDNA的克隆及分析
以苹果抗病品种‘秦冠’叶片cDNA为模板进行RT-PCR，获得 1 条 1 224 bp的序列（图 1）。该
序列包含 1 个 993 bp的开放阅读框，编码 331 个氨基酸，分子量为 35.96 kD，等电点为 9.688，生物
信息学分析如图 1 所示。MdWRKY基因包含 1 个WRKY保守区域，1 个C2-HC 锌指结构域
（C-X7-C-X23-H-X1-C）和 1 个核定位信号（KKRK）。此外还包含 1 个钙结合域GHARFRR，1 个植
物特定的锌指簇。
蛋白同源性分析，MdWRKY 蛋白与拟南芥 WRKY 类转录因子具有很高的同源性，与
AtWRKY17 和 AtWRKY11 氨基酸序列同源性达到 39.50%和 40.61%，这表明该蛋白属于 WRKY 家
族（图 2）。根据 WRKY 保守域和锌指结构域的个数，WRKY 蛋白分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ 3 个亚族。基于
额外的短保守性区域，Ⅱ族又细分为 5 个亚族（Ⅱa ~Ⅱe）。
与来自拟南芥的 20 个 WRKY 蛋白进行进化树分析（图 3），MdWRKY 属于Ⅱd 亚族，包含 WRKY
亚家族Ⅱd 专有的结构域——钙结合域和锌指簇结构域。钙结合域能够产生作为二级信使的钙离子
（Bouche et al.，2005）。锌指簇区域序列的突变可以导致 AtWRKY11 结合 W 盒能力减弱（Babu et al.，
2006）。因此，可以推测 MdWRKY 在抗病调控中的作用是通过钙结合域结合作为二级信使的钙离子

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参与抗病的早期应答，具体结论需要进一步验证。

图 1 MdWRKY 基因序列分析
WRKY 保守域用斜体表示，核定位信号用下划线标出，GHARFRR 保守域用双下划线标出，钙结合保守区
域用点线标出，锌指结构的半胱氨酸和组氨酸用方框标出。
Fig. 1 Sequence analysis of MdWRKY gene
The WRKY motif is italic. The putative nuclear localization signal（KKRK）is underlined. The GHARFRR domain is double underlined. The
conserved calmodulin-binding domain is dashed lines. The three cysteines and the histidine of zinc-finger motif are boxed.


图 2 MdWRKY保守性区域和其他的WRKY蛋白的同源性分析
MdWRKY保守性区域用灰色标出。
Fig. 2 MdWRKY conserved domain sequence alignment of other WRKY proteins
MdWRKY conserved domain is in grey.
7 期 高 华等：‘秦冠’苹果 MdWRKY 基因亚细胞定位及原核表达 1345


图 3 MdWRKY 和其他拟南芥 WRKY 蛋白序列的进化树分析
Fig. 3 Phylogenetic relationships of the amino acids among MdWRKY and other Arabidopsis WRKY proteins

2.2 MdWRKY亚细胞定位
序列分析发现，MdWRKY 基因序列包含一个假定的核定位信号，为了确定 MdWRKY 蛋白在植
物细胞内的分布，利用基因枪将瞬时表达载体 pBI221-GFP-MdWRKY 和空载体 pBI221-GFP 导入到
洋葱表皮细胞，结果如图 4 所示。MdWRKY-GFP 融合蛋白分布在洋葱表皮细胞的细胞核内，而对
照 GFP 蛋白则分布在整个细胞内，说明 MdWRKY 蛋白属于核蛋白。


图 4 MdWRKY 亚细胞定位
Fig. 4 Subcellular localization of MdWRKY


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2.3 MdWRKY基因在病原菌诱导下的表达分析
WRKY 基因大部分参与植物病原菌的应答反应，其中一些 WRKY 基因的表达被病原菌诱导上
升调控，与其病原菌抗性相关（Rushton et al.，1996；Eulgem et al.，1999； Kim et al.，2000；Yoda
et al.，2002；Takemoto et al.，2003；Vandenabeele et al.，2003；Guo et al.，2004）。拟南芥中，大部
分 WRKY 成员的表达受 SA 或病原菌诱导（Dong et al.，2003；Kalde et al.，2003）。为研究 MdWRKY
基因是否参与抗病反应，采用实时定量的方法研究了‘秦冠’苹果受病原菌侵染过程中 MdWRKY
基因的表达模式。‘秦冠’苹果叶片未接种病原菌时，MdWRKY 基因表达量比较低；接种苹果斑点
落叶病病菌后，MdWRKY 表达量显著升高，第 2 天达到最高值，而后下降，到第 5 ~ 7 天基本回复
到接种前状态（图 5）。此结果表明 MdWRKY 基因参与了斑点落叶病侵染过程中的抗病防御反应。


图 5 苹果斑点落叶病病菌诱导下 MdWRKY 基因的表达模式
MdActin 作为 qRT-PCR 的内参基因。
Fig. 5 Expression profile of MdWRKY was induced by A. alternate f. sp. mali in Malus domestic Borkh‘Qinguan’apple
MdActin was used as an internal control for qRT-PCR.

2.4 MdWRKY基因的原核表达分析
蛋白质是基因功能的执行者，获得基因表达产物是研究基因功能的主要途径。本研究通过 PCR
方法构建 pGEX-MdWRKY 重组表达载体（图 6）。重组质粒转化大肠杆菌 BL21 感受态细胞，加入


图 6 原核表达载体
Fig. 6 Construction of pGEX-MdWRKY

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不同浓度的 IPTG，在 37 ℃条件下进行不同时间诱导，获得大肠杆菌总蛋白进行 SDS-PAGE 分析。
以蛋白质分子量标准、转空表达载体的表达菌全蛋白以及未添加诱导剂 IPTG 培养的重组菌全蛋白
电泳作对照，发现转 pGEX-MdWRKY 的 E. coli BL21 重组菌经 IPTG 诱导后在约 61.9 kD 左右的位
置有一条特异表达带，与推算的 GST-MdWRKY 融合蛋白大小相符，说明 MdWRKY 基因在表达菌
E.coli BL21 中得到表达。
经过不同诱导剂浓度诱导培养后全菌蛋白电泳对照显示，目的融合蛋白在不同诱导剂浓度下表
达量变化没有显著差异（图 7）。表明 IPTG 浓度对融合表达载体 pGEX-MdWRKY 表达水平影响不
大。



图 7 pGEX-MdWRKY 原核表达产物 SDS/PAGE 分析
1：蛋白分子量标准；2：空载体未加IPTG诱导；3：空载体加 0.1 mmol · L-1 IPTG诱导；4：融合表达工程菌未加IPTG诱导；
5 ~ 8：融合表达工程菌加 0.1，0.2，0.4，0.6 mmol · L-1 IPTG诱导。
Fig. 7 SDS/PAGE analysis of pGEX-MdWRKY expressed product
1：Protein molecular weight standard；2：Proteins of engineering bacteria strains（PEBS）harbouring pGEX-4T-1 uninduced；
3：PEBS harbouring pGEX-4T-1 induced by 0.1 mmol · L-1 IPTG；4：PEBS harbouring pGEX-MdWRKY uninduced；
5–8：PEBS induced by 0.1，0.2，0.4，0.6 mmol · L-1 IPTG.

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