全 文 ：园 艺 学 报 , 一
所
黄瓜无苦味基因 的分子标记研究
池秀蓉 , 顾兴芳 ’ , 张圣平 , 王 晓武 , 王 烨
中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京
摘 要 以黄瓜纯合自交系 从 和 为双亲获得的 代为试材 , 利用分离群体
组群分析法 , 从 对 尹 选择性引物中获得了与营养器官无苦味位点连锁距离为 的 分子
标记 。 , 并成功地将其转化为操作简便
、
表现稳定的 标记 。
关键词 黄瓜 苦味 分子标记
中图分类号 文献标识码 文章编号 一 一 刁
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黄瓜 在不 良的栽培条件下果实易出现苦味 。 国内外多年的研究 ,
, , , ,
顾兴芳 等 , 表明 含有 基因控制的黄瓜植株体内无苦味素 隐性的 基因能够抑制
黄瓜果实与叶片中苦味素的产生 , 使叶片无苦味并阻止果实由逆境条件诱导出现的苦味 。 目前 , 对于
黄瓜营养器官无苦味基因 尚未见分子生物学方面的研究报道 。
本试验中利用 技术筛选与 基因紧密连锁的分子标记 , 并将其转化为 标记 , 旨在将
筛选到的与 基因紧密连锁的 评 分子标记用于育种早期对较大群体进行苦味性状的筛选
, 避免由
环境条件和感官品尝带来的选择误差 , 为无苦味黄瓜育种工作提供技术支持 。
材料与方法
材料
供试材料的亲本 和 均为中国农业科学院蔬菜花卉研究所选育的黄瓜纯合自交系 ,
其中 , 营养器官与果实都不苦 , 基因型为 仅营养器官有苦味 , 基因
型为 。
收稿 日期 一 一 修 回 日期 一 一
基金项目 国家 ‘ ’ 项 目 农业部蔬菜遗传与生理重点开放实验室资助项 目
通讯作者 一 邵 ,
· ·
园 艺 学 报 卷
年春季在大棚内种植亲本和 各 株 , 群体 株及 , 代 株左右 , 采用 口尝的方法
鉴定营养器官的苦味情况 。 苗期品尝子叶 次 , 成株期品尝真叶或卷须 一 次 , 以验证与苗期品尝
的一致性 , 若不一致增加品尝次数 。 每株每次由对苦味敏感者品尝以确保试验结果的准确性
方法分析
方法在 等 的基础上修改了部分步骤 , 其中条带的显示采用银染法
提取
采用 , 微量提取法 , 用 管盖扣取相同大小的
新鲜叶片 , 加人 林 提取缓冲液 , 研磨 至叶片粉碎 ℃水浴 冷至室温 , 加人
林 的氯仿 异戊醇 , 上 下轻轻颠倒混匀 离心 吸取上清液
林 , 放人预先加好 卜 异丙醇的 离心管中 , 轻轻上下颠倒混匀 离心
弃上清液 , 加人 乙醇清洗 沉淀 , 室温放置 一 , 口 离心 , ,
弃上清液 加入 协 内含 林 扩 , 混匀 , ℃放置 用
琼脂糖电泳检测所提 纯度和浓度 。
利用 法 , 各取 个无苦味和苦味单株 等量混合 , 构建成无苦
味池和苦味池用于 引物的多态性筛选 。
酶切连接
取 林 酬林 基因组 , 采用 口 和 进行双酶切 。 酶切连接一步进行 ,
以上 。
酶切连接产物的扩增
取 林 酶切连接产物为模板进行预扩 。 预扩增程序为 ℃预变性 ℃变性 , ℃
复性 , ℃延伸 , 扩增循环 轮 ℃延伸 。
预扩增产物 稀释
,
作为选扩增的模板 。 选用 和 。 引物组合共 对 由 个带
两个选择性碱基的 口 一 引物和 个带 个选择性碱基的 。 一 引物组成 。 选扩增程序
为 ℃预变性 第 轮扩增参数 ℃
, ℃ , ℃ 以后每轮循环温度递减
℃ , 扩增 轮 接着按下列参数扩增 轮 ℃ , ℃ , ℃ , 每轮循环时间增
加 最后 ℃延伸 。
预扩增引物为 和 。 选择性扩增引物为 , 一 共 个 , 一 。共 个 。
变性聚丙烯酞胺凝胶电泳分析
选择性扩增产物用 的聚丙烯酞胺凝胶电泳检测 , 电泳缓冲液为 , 恒功率 预电泳
一 , 选择性扩增结束后加人 协 上样缓冲液 , ℃变性 后迅速置于冰上 , 在 的变
性聚丙烯酞胺凝胶上电泳分离 , 每个样品取 一 林 上样 , 恒功率 电泳 一
银染方法
将粘有凝胶的玻璃板放人盛有固定液 冰醋酸溶液 的塑料盒 中 , 震荡器上摇动
蒸馏水洗两次 , 每次 将玻璃板移人新鲜配制的银染液 蒸馏水 硝酸银 甲醛
中 , 摇动染色 取出玻璃板 , 迅速放入蒸馏水中漂洗一下 不超过 , 然后放入新鲜配制
的预冷显影液 蒸馏水 无水碳酸钠 协 岁 硫代硫酸钠 中 , 摇动直到条带清
晰为止 将玻璃板移人固定液中 , 固定 一 在蒸馏水中漂洗约 后 , 取 出 自然晾干 。 然
后在 可见灯箱上观察记录银染结果 。
连锁性分析
利用 软件对 代分离群体单株的标记和田间数据进行连锁分析 。
期 池秀蓉等 黄瓜无苦味基因 的分子标记研究
特异标记 片段的回收克隆及 标记的转化
对连锁标记进行条带回收 。 以灭菌的解剖刀准确切下多态条带 , 放人 的离心管中 加人
林 超纯水 室温放置 ℃水浴锅里煮 以 〕 离心 取上清液 协 做
模板 , 采用和选择性扩增一样的体系和程序扩增 , 剩余产物 一 ℃保存备用 。
纯化回收产物 , 将纯化样品克隆于 一 上 , 经重组质粒的蓝 白斑筛选 , 挑取 白色重
组克隆进行培养 。 将培养好的阳性克隆菌液送北京三博远志生物技术有限公司进行测序 。 根据测序后
去除接头的全序列 , 利用 软件设计 引物 , 由北京三博生物技术有限公司合
成引物 。
以 代单株的 验证 引物的特异性 。
试验于 一 年在中国农业科学院蔬菜花卉研究所试验温室及农业部蔬菜遗传与生理重点
开放实验室完成 。
结果与分析
苦味性状的遗传规律分析
以完全不苦的纯合雌性系 为母本与仅营养器官苦的普通花性 自交系 杂交获得的 , 植株营养
器官是苦的 , 代植株中 , 营养器官苦与不苦的遗传分离比例符合 , 与 , 回交的后代果实和营养
器官均苦与均不苦的比例为 , 与 回交的后代营养器官均苦 表 , 表明营养器官无苦味基因
为独立遗传 。
表 黄瓜亲本及其 、 和 群体苦味株数分离情况
哭 佣 理 , , 幼
世代 总株数 营养器官苦 均不苦
一
期望比 显著性 孟。,
一
口卫八
一
, 」
仁 」 ,
不显著 ,
不显著
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引物的筛选
将 对引物组合首先进行双亲间筛选 , 平均每对引物组合扩增的条带为 条 , 最终有 对
在双亲间体现多态性 。
将 对组合通过对分别由 个单株混合组成的苦味和无苦味 池间的扩增 , 初步获得一个与
黄瓜营养器官无苦味 从 基因连锁的 标记 巧。。 该引物组合的碱基序列为 ‘
一 ‘ ’一 一 ‘ 。
多态性标记在 代单株中的验证及连锁距离的确定
通过对 代 个单株的验证 , 巧。标记在绝大多数无苦味单株中出现特异条带 , 在大部
分苦味单株中没有出现该标记 图 。
所有 代单株中无苦味的有 株 , 苦味的有 株 。 标记检测表明其中无苦味单株中有 株出
现该标记 , 株未出现 。 苦味单株中有 株未出现该标记 , 株出现该标记 。
利用 软件分析 , 该标记与营养器官无苦味位点的连锁距离在 。 命名该连锁
标记为 。 , 连锁较为紧密 。
园 艺 学 报 卷
无苦味亲本 苦味亲本 一 无苦味单株 一 苦味单株
屏‘户 分子量标准 箭头示无苦味单株中出现的特异带
一 一 一 一
胡 朽。
一
标记转化为 标记
对 巧 。标记进行 回收
、 纯化
、 克隆
、 测序 , 去除接头部分序列后 , 所得特异片段长度为
帅 , 其全序列为 ,
, , ,
,
,
, 门了 门 , 从
, 、
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根据 软件设计 了两 对 引物 。 引物对 为 , 序列 为 忆
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一 ‘ 气 , , 一 ‘ 。 引物对 为 , 序列 为 气
’ ’ 注’ ’ 注人
一 ’ ’一 ’ 一 ‘ 。
利用所设计合成的特异引物对 代单株的基因组 进行扩增鉴定 。 经过变性聚丙烯酞胺凝胶
电泳检测表明 , 在无苦味单株中扩增出 长的片段 , 而在苦味植株中并未见到该标记 图 ,
表明已成功地将该 廿 标记转化为 标记 。 将该标记命名为 。
无苦味亲本 苦味亲本 一 无苦味单株 一 苦味单株
解几帅 分子量标准 箭头示特异带位置
浦 盯
一 、 一 一 一
八介尸 一
期 池秀蓉等 黄瓜无苦味基因 的分子标记研究
与 基因紧密连锁的分子标记在重组 自交系中的验证
通过田间鉴定 , 在包含 个株系的重组 自交系群体中有 个株系无苦味 , ’个株系有苦味 ,
提取重组 自交系各个株系的 用于检测与 基 因紧密连锁的 标记 。
、
标记
的有效性 , 工 。标记在 个无苦味株系上有带 , 个苦味株系中无带 图 , 准确率达
, 在 个无苦味株系中有带 , 个苦味株系无带 , 准确率为 。
图 在部分重组 自交系单株中的验证
无苦味亲本 苦味亲本
、 、 、 、 、 一 、 、 巧 、 、 、
一 无苦味单株
、 、 、 、 一 、 、 一 、 、 苦味单株
刃腼尸 分子量标准 箭头 特异带位置 。
心血 一犯 】
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讨论
本试验通过对田间材料的亲本
、
,
、 及 ,分离后代的详细调查 , 观察到 与 在 代的遗
传分离比例符合 , 回交后代为 , 表明 从 基因为独立遗传 。 该结论与前人
, 的研究结果一致 。 同时利用 法结合 技术获得了与黄瓜营养器官无苦味 基
因紧密连锁的 标记 , 连锁距离为 , 并成功将其转化为 标记 。 这是国内外首次报
道的与黄瓜无苦味基因位点紧密连锁的分子标记 , 该标记能在苗期对黄瓜的植株苦味进行有效选择 ,
这对黄瓜无苦味品种的选育具有重要意义 。
需要指出的是 , 本研究获得的 特异标记在群体内及群体外材料中虽表现稳定 , 但序列不
长 , 转化后的 标记片段也较短 , 需要用变性聚丙烯酞胺凝胶电泳检测 , 不能用更为简便的琼脂
糖电泳检测 。 因此 , 获得操作更为简便的与黄瓜无苦味基因紧密连锁的 标记需要进一步研究 。
园 艺 学 报 卷
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顾兴芳
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徐彩清 黄瓜苦味遗传分析 园艺学报
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《园艺学报 》 年改为月刊
《园艺学报 》是中国园艺学会主办的学术期刊 , 创刊于 年 , 刊载有关果树
、
蔬菜
、
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