全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (11) : 1635 - 1640
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 05 - 16; 修回日期 : 2008 - 10 - 23
基金项目 : 国家科技支撑计划项目 ( 2006BAD01A721206) ; 国家 ‘863’计划项目 ( 2006AA100108) ; 国家自然科学基金项目
(30671415) ; 河南省重大科技攻关项目 (072101110400)。3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: wangxw@mail1caas1net1cn)
芸薹种作物抽薹相关基因 B r FLC1的 CAPS标记
原玉香 1, 2 , 孙日飞 1 , 张晓伟 2, 3 , 武 　剑 1 , 徐东辉 1 , 张 　慧 1 , 和江明 4 ,
张延国 1 , 王晓武 13
(1 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081; 2 河南省农业科学院园艺研究所 , 郑州 450002; 3 华中农业大学园
艺林学学院 , 武汉 430070; 4 云南省农业科学院园艺作物研究所 , 昆明 650205)
摘 　要 : 以 16份芸薹种作物 DH系为试材 , 通过人工春化处理对其抽薹性状进行了鉴定 , 明确了材料
间抽薹早晚存在显著差异 ; 根据 B rFLC1基因序列设计引物进行 PCR扩增发现 , 所有 16份材料均获得 980
bp的片段。多序列比对与抽薹性的关联分析发现 , 材料的抽薹早晚与扩增片段的碱基变异相关联 , 并发现
关联位点的碱基变异为限制性内切酶 M vaⅠ的识别位点 ; 利用该酶对 PCR产物酶切可以将材料明显区分开
来 , 从而建立了 B rFLC1基因的 CAPS标记 (命名为 G2M vaⅠ)。利用此标记对 96份芸薹种作物 DH材料的
验证表明 , 该基因的分子标记结果与抽薹时间表型显著相关 , 用该标记可以进行分子标记辅助选择。
关键词 : 芸薹种作物 ; 抽薹 ; B rFLC1基因 ; CAPS标记
中图分类号 : S 634　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 1121635206
A CAPS M arker L inked to Bolting Rela ted Gene B r FLC1 in B rassica rapa
YUAN Yu2xiang1, 2 , SUN R i2fei1 , ZHANG Xiao2wei2, 3 , WU J ian1 , XU Dong2hui1 , ZHANG Hui1 ,
HE J iang2m ing4 , ZHANG Yan2guo1 , and WANG Xiao2wu13
(1 Institu te of V egetables and Flow ers, Ch inese A cadem y of A gricultural Sciences, B eijing 100081, China; 2 Institu te of Horticul2
ture, Henan A cadem y of A gricultural Sciences, Zhengzhou 450002, China; 3 College of Horticulture and Forestry, Huazhong A gri2
cu ltura l U niversity, W uhan 430070, Ch ina; 4 Institu te of Horticu lture, Yunnan A cadem y of A gricu ltural Sciences, Kunm ing
650205, Ch ina)
Abstract: Bolting time of 16 B rassica rapa accessions was investigated under artificial vernalization treat2
ment. The results showed that there was a wide range variation of bolting time among these accessions. Polymer2
ase chain reaction ( PCR) with a p rimer pair based on the B rFLC1 gene sequence generated a 980 bp fragment
from all accessions. A base variation located at P3 was significantly associated with bolting time, and the base
variation at this position is the recognition site of restriction enzyme M vaⅠ. Therefore, a cleaved amp lified poly2
morphic sequences (CAPS) marker designated as G2M vaⅠwas developed for this locus by digesting the amp li2
fied fragment with M vaⅠ. The marker was verified in 96 B. rapa DH lines, disp laying a significant association
between the bolting phenotypes and the genotypes of G2M vaⅠ. These results indicated that G2M vaⅠcan be easily
used for marker2assisted selection (MAS) in late bolting or bolting2resistance breeding.
Key words: B rassica rapa L. syn. cam pestris L. ; bolting; B rFLC1 gene; CAPS marker
“先期抽薹 ”问题一直困扰着北方春季和高寒冷凉地区的大白菜生产。因此 , 开发与抽薹相关的
特异分子标记对于培育耐抽薹的大白菜新品种具有重要意义。
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园 　　艺 　　学 　　报 35卷
　　FLOW ER IN G LOCUS C ( FLC) 是拟南芥的开花抑制因子 , 编码一种新的 MADS—盒蛋白 , 以一
种类似变阻器的剂量方式抑制开花 (M ichael & Amasino, 1999; Sheldon et al. , 1999)。FLC是春化途
径中的关键基因 , 同时也被自主途径中的有关基因调控 , 是开花相关基因中的枢纽基因 ( Sheldon et
al. , 1999, 2000 )。目前在芸薹属作物不同种中分别克隆到 FLC的同源基因 ( Tadege et al. , 2001;
Schranz et al. , 2002; L i et al. , 2005; L in et al. , 2005) , 一些同源基因对开花的延迟功能也已报道
( Kim et al. , 2007; Tadege et al. , 2001)。抽薹时间在芸薹种作物 (B rassica rapa L. syn. cam pestris
L. ) 中存在广泛的自然变异 , 研究表明白菜中有 4个 B rFLC同源基因 , 多个同源基因的重复所产生
的多倍性是造成抽薹时间表型变异的原因 ( Schranz et al. , 2002)。然而 , 这些变异是否与 B rFLC基
因的序列变异相关 , 尚不清楚 , 与这些基因紧密连锁或共分离的分子标记也未见报道。
本研究中以抽薹时间不同的 16份芸薹种作物为试材 , 根据 B rFLC1基因序列设计特异扩增引物 ,
寻找与抽薹相关的序列变异 , 并开发与抽薹连锁的 CAPS标记 , 同时对标记的通用性在 96份大白菜
和白菜 DH系中进行验证 , 以期为芸薹种作物晚抽薹育种的分子标记辅助选择提供依据。
1　材料与方法
111　试验材料及其低温处理
选 16份有代表性的芸薹种作物 DH系用于测序 , 包括大白菜、白菜、乌塌菜、菜薹、紫菜薹和
Rap id2cycling (表 1)。其中 Rap id2cycling由威斯康星大学 O sborn博士提供 , 为 Schranz等 (2002) 克
隆 B rFLCs基因所用的 DH系 IMB。标记的验证利用 96份来源于不同杂交种或组合的白菜 DH材料 ,
包括 74份大白菜和 22份白菜 (表 2)。
将吸涨的种子平铺于底部垫有双层滤纸的培养皿中 , 放入 25 ℃的培养箱中催芽 , 待 2 /3的种子
露白后将培养皿转至 4 ℃暗培养箱进行人工春化处理。
112　植株生长条件及抽薹时间调查
2006年 8月 —2007年 2月在中国农业科学院 (北京 ) 进行 16份芸薹种作物材料的抽薹性鉴定。
种子春化处理 20 d后播种于温室的营养钵中 , 每份材料 5个单株 , 按常规进行栽培管理。2007年
2—5月在河南省农业科学院 (郑州 ) 进行 96份 DH材料的抽薹性鉴定。将春化处理 25 d后的种子点
播于营养钵中 , 置于生长室中 (昼 25 ℃ /夜 20 ℃, 光 16 h /暗 8 h) 培养 , 每份材料 5个单株 , 按常
规进行栽培管理。以春白菜品种 ‘春秋 54’和 ‘健春 ’的 DH系 ( Y177212) 为晚抽薹材料的对照。
对照材料与 DH系材料的播前处理及管理同步进行。从播种到肉眼可见花蕾所需的天数可以反映芸薹
种作物抽薹时间的早晚 , 所以调查从第一份材料花蕾初现时开始 , 逐日观察统计其现蕾日期 , 每份
DH材料调查 5株 , 取平均值。2006年北京试验和 2007年春郑州试验分别调查至播种后 120 d和 60
d, 在调查结束时尚未出现花蕾的植株分别记为 125 d和 65 d (O sborn et al. , 1997)。
113　特异扩增引物设计、PCR扩增及 M vaⅠ酶切反应
根据已发表的 B rFLC1基因的 DNA序列 ( GenBank accession number: AY115678 ) , 利用 Primer
p rem ier 510软件设计特异扩增的 PCR引物。上游引物为 FLC1F4: 5′2CTT GAG GAA TCA AAT GTC
GAT AA 23′和 FLC1F2T: 5′2AGG TCG CAA GCC TAT CTC23′, 下游引物为 FLC1R1: 5′2CCA TAT TAT
CAG CTT CGG CTC G 23′。对扩增得到的 PCR产物纯化后进行测序 , 测序在 AB I 3730XL DNA Analy2
zer ( Perkin2Elmer, USA) 上进行。序列比对与分析采用 DNAman软件 (Ver1 51212)。
DNA提取采用 CTAB微量法 (W ang et al. , 2005)。 PCR反应体系 : 50 ng DNA, 10 ×PCR反应
缓冲液 2μL, 215 mmol·L - 1 dNTP 112μL, 上、下游引物 ( 10μmol·L - 1 ) 各 015μL, 110 U Taq
DNA 聚合酶 , 无菌的双蒸水补足 20μL。热循环程序为 : 94 ℃预变性 4 m in; 94 ℃变性 1 m in, 58 ℃
复性 1 m in, 72 ℃延伸 1 m in 30 s, 35个循环 ; 72 ℃延伸 10 m in。
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　11期 原玉香等 : 芸薹种作物抽薹相关基因 B rFLC1的 CAPS标记 　
M vaⅠ酶切反应体系 15μL, 包含 5μL PCR扩增产物 , 1 ×缓冲液 R (含 BSA ) 和 215 U限制性
内切酶 M vaⅠ (MB I Fermentas) , 无菌双蒸水补足。37 ℃保温 210 h完全酶切 , 然后加入上样缓冲液
终止反应 , 用 210%琼脂糖电泳检测。
2　结果与分析
211　测序材料的抽薹性表现
16份材料的抽薹时间有很大的差异 , 最早的在播种后 25 d现蕾 , 最晚的在播种后 120 d仍未出
现花蕾。抽薹时间 < 40 d的材料有 3份 , 分别为 L144 (Rap id2cycling)、BDC518623 (白菜 ) 和 L5821
(菜薹 ) ; 在调查结束时尚未出现花蕾 (抽薹时间 > 120 d) 的材料有 4份 , 分别为大白菜 2份 ( Y41123
和 Y53823) 和白菜 2份 (N14217和 N121)。其余 9份材料的抽薹时间在 46～120 d之间 (表 1)。
表 1　16份测序材料在 B rFLC1基因的扩增区域的碱基变异与抽薹的相关分析
Table 1　A ssoc ia tion of bolting tim e w ith ba se var ia tion s in am plif ied reg ion of B rFLC1 gene am ong 16 sequenced accession s
亚种或变种
Subspecies or
varieties
编号
Code
材料名称
Accession
name
来源
O rigin G2M vaⅠ抽薹时间 / dBolting time 碱基变异位置 Position of base variation内含子 5Intron 5
P1P2
内含子 6
Intron 6
P3 P4 P5 P6 P7
大白菜 1 Y41123 晚白 2号 W anbai 2 b 125 ±010 C A G A A C A
Chinese cabbage 2 Y15229 津绿 78 J inlü78 b 62 ±1. 8 C T G A A C G
3 R16211 日本卷翠 Japanese Juancui a 46 ±1. 7 T T A A A 2 A
4 Y177212 健春 J ianchun b 120 ±0. 2 C A G A A 2 A
5 Y195293 热抗白 45 Rekangbai 45 a 84 ±0. 2 T T A A A 2 A
6 Y392216 黄芽 14 Huangya 14 b 115 ±1. 0 C A G T 2 2 A
7 Y53823 中白 78 Zhongbai 78 b 125 ±010 C T G A A 2 A
白菜 Pak Choi 8 BDC518623 高脚匙羹白 a 37 ±0. 1 T T A A A C A
Gaojiao Chigengbai
9 N2622 黑白菜 Heibaicai b 115 ±010 C A G A A C G
10 N14217 五月慢 W uyueman b 125 ±010 C T G A A 2 A
11 N121 日本青梗 308 b 125 ±010 C T G A A 2 A
Japanese Q inggeng 308
12 N292168 台湾大头清江 a 87 ±113 T T A A A 2 A
Taiwan Datou Q ingjiang
乌塌菜 W uta2tsai 13 Glu00222 乌塌菜 W uta2tsai a 80 ±010 T T A A A 2 A
菜薹 14 L5821 四九菜心 Sijiu Caixin a 33 ±015 T T A A A 2 A
Flowering Chinese cabbage
紫菜薹 Zicaitai 15 F04139723 二早子 Erzaozi a 48 ±010 T A A A A C A
Rap id2cycling 16 L144 IMB a 25 ±010 T T A A A 2 A
　　注 : ‘b’和 ‘a’分别代表 G2M va Ⅰ标记产生的 2条带型和 1条带型 ; 数据为平均数 ±标准差。
Note: ‘b’and‘a’ rep resent two bands and one band type p roduced by G2M va Ⅰ, respectively; Data are p resented as mean ±SD.
212　B rFL C1特异片段的获得及序列比对
以 16份试材总基因组 DNA为模板 , 用本研究中设计的位于外显子 4的 FLC1F4和位于外显子 7
的 FLC1R1引物组合进行 PCR扩增 , 所有材料中均扩增得到 1条约 980 bp的条带 (图 1)。
图 1　引物 FLC1F4 /FLC1R1对 B rFL C1基因片段的特异扩增
1～16分别表示表 1中的 1～16; M代表 DNA marker Ⅲ。
F ig. 1　B rFL C1 gene2spec if ic fragm en t got am ong 16 sequenc ing B. rapa accession s ba sed on FLC1F4 / FLC1R1
Lane 1 - 6 rep resent 1 - 16 listed in Table 1; M rep resents DNA marker Ⅲ.
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对扩增得到的 PCR产物纯化后进行测序 , 确认了扩增出来的片段为 B rFLC1基因特有。16份材
料的多序列比对发现共有 7个位置存在碱基变异 , 其中内含子 5中有 2个 , 分别命名为 P1和 P2, 内
含子 6中有 5个 , 分别命名为 P3、P4、P5、P6和 P7 (表 1)。在外显子区域未发现变异。
213　序列变异与抽薹性的关联分析
碱基变异与抽薹时间的关联分析表明 : 在 7处变异位点中 , 只有 2处完全连锁的碱基变异 ( P1
和 P3) 与抽薹时间显著相关 ( r = 018, P≤0101)。以 P3位点为例 , 8份在该位点为 G的材料中有 7
份表现为相对晚抽薹 (抽薹时间在 110 d以上 ) , 只有 1份大白菜 ( Y15229) 表现为相对早抽薹 (抽
薹时间 62 d) ; 8份在该位点为 A的材料中抽薹时间均在 87 d以内 (表 1)。
214　CAPS标记的开发
进一步的酶切位点分析发现 : 位于 P3的单碱基的突变位点恰好为限制性内切酶 M vaⅠ的识别位
点 , 此外 , 在扩增区域还有该酶的另一个识别位点。为了排除另一个位点的干扰 , 在内含子 5内又设
计合成了一条正向引物 : FLC1F2T, 利用该引物与位于外显子 7的 FLC1R1进行 PCR扩增 , 得到了一
条大小为 750 bp左右的片段。此特异 PCR产物经 M vaⅠ限制性酶切电泳后 , 呈现 2种类型 (图 2) :
750 bp的一条带型 (A基因型 ) , 259 bp和 491 bp的两条带型 ( G基因型 )。这是因为当 P3位点为 G
时 , 正好为限制性内切酶 M vaⅠ的识别位点 (CCW GG) , M vaⅠ识别该位点并将其酶切 , 电泳后可以
见到两条带 ; 而当该位点有 G - A突变 (CCW GA ) 时 , M vaⅠ限制性酶切位点失去 , M vaⅠ不能识别 ,
电泳后只能见到一条带。据此可判断 B rFLC1基因在该位点的 G - A突变 , 该标记命名为 G2M vaⅠ。
图 2　引物组合 FLC1F2T /FLC1R1的 PCR产物的 M vaⅠ酶切电泳
M: DNA Marker Ⅱ; 3、5、7和 11: 碱基位点为 A;
1、2、4、6、8、9、10和 12: 碱基位点为 G。
F ig. 2　Electrophoresis of d igested PCR products am plif ied by the pr im ers of FLC1F2T and FLC1R1 by M vaⅠ enzym e
M: DNA MarkerⅡ; Base A in lane 3, 5, 7 and 11;
Base G in lane 1, 2, 4, 6, 8, 9, 10 and 12.
CAPS标记 G2M vaⅠ对 16份测序材料的酶切结果表明 , 酶切的结果与测序结果完全一致 (表 1) :
所有在 P3位点为 G的材料 , 酶切后全部为 2条带 (表 1中记为 b) , 位点为 A的材料则全部为 1条带
(表 1中记为 a)。因此 , 可以用该标记判断 B rFLC1基因的 G - A变异位点。
215　B rFL C1基因的 CAPS标记在 96份 D H材料中的验证
为了验证标记的可靠性 , 对 96份 DH材料和晚抽薹对照的抽薹时间进行鉴定 , 同时利用 CAPS标
记 G2M vaⅠ对 G - A位点进行检测。结果表明 : 96份不同来源的白菜 DH材料的抽薹时间在 19～65 d
之间 (表 2) , 标记检测结果为 G基因型和 A基因型材料分别为 45份和 51份。标记基因型和抽薹表
型的 Pearson相关分析表明 , 材料的抽薹时间早晚与 G - A位点的基因型显著相关 ( r = 01626, P <
0101)。晚抽薹的对照品种 ‘春秋 54’和 DH系 ( y177212) 的平均抽薹时间分别为 41 d和 40 d,
G2M vaⅠ标记检测基因型为 G, 据此认为在本试验条件下 , 抽薹时间 ≥40 d的材料为相对晚抽薹的材
料。这表明研究中开发的这个 CAPS标记可以广泛应用。
本研究中发现 , 经 G2M vaⅠ标记检测基因型为 G的材料晚抽薹 , 为 A的材料早抽薹 , 但是还有
个别材料不符合此规律 (表 2中星号表示 ) , 包括 3份大白菜标记检测为 G但早抽薹和 6份大白菜标
记检测为 A但晚抽薹 , 占参试材料的 914%。
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　11期 原玉香等 : 芸薹种作物抽薹相关基因 B rFLC1的 CAPS标记 　
表 2　基于 G2M vaⅠ标记的基因型与抽薹时间的关联分析
Table 2　A ssoc ia tion ana lysis of G2M vaⅠ marker genotype and bolting tim e across 96 B. rapa accession s
G2M vaⅠ 材料Accession 抽薹时间 / dBolting time G2M vaⅠ 材料Accession 抽薹时间 / dBolting time G2M vaⅠ 材料Accession 抽薹时间 / dBolting time
b Y408233 60 ±311 b Y177212 40 ±010 a Y49825 32 ±317
b Y49721 57 ±612 b Y44522 40 ±117 a Y51021 32 ±010
b Y41223 53 ±914 b Y152293 37 ±111 a Y470211 32 ±010
b Y24625 52 ±212 b Y81237A3 32 ±010 a Y134219 32 ±010
b Y41123 51 ±111 b Y23123303 32 ±010 a Y3502164 32 ±010
b YM188 50 ±019 a Y3482953 52 ±019 a Y168217 32 ±010
b Y302211 50 ±019 a Y471213 49 ±319 a Y322223 32 ±010
b Y9621 50 ±010 a Y4202733 49 ±217 a Y52124 32 ±010
b Y497226 49 ±213 a Y208233 49 ±118 a YR16211 31 ±212
b Y41021 48 ±313 a Y272293 43 ±118 a Y15327 29 ±116
b Y476244 48 ±010 a Y5062193 42 ±019 b N3023 65 ±010
b Y46924 48 ±010 a Y4072150 38 ±318 b N121 65 ±010
b Y24823 46 ±114 a Y39921 38 ±114 b N14217 65 ±010
b Y103272 46 ±111 a Y35226 37 ±316 b N1626 65 ±010
b Y20729 43 ±316 a Y530225 37 ±111 b N2622 65 ±010
b Y297224 43 ±217 a Y45323 36 ±312 b N26215 42 ±216
b YF052761 43 ±118 a Y50922 36 ±010 b N8226 42 ±011
b Y502210 42 ±313 a Y14928 36 ±010 b N4928 42 ±010
b Y54124 42 ±313 a Y54422 35 ±217 a N1723 37 ±319
b Y44325 42 ±310 a Y148272 34 ±316 a N2023 36 ±513
b Y49923 42 ±212 a Y141233 34 ±313 a N10236 36 ±313
b Y513218 42 ±010 a Y54029 34 ±019 a NW121 35 ±111
b Y531223 41 ±217 a Y195293 34 ±019 a N30213 34 ±010
b Y24927 41 ±118 a Y50021 34 ±010 a N1324 34 ±010
b Y536216 41 ±111 a Y50821 34 ±010 a NW223 33 ±111
b YCQ5421 41 ±111 a Y15926 33 ±118 a N19P227 32 ±010
b Y358210 40 ±315 a Y66283 33 ±118 a N292168 32 ±010
b Y53823 40 ±218 a Y50723 33 ±111 a N50216 32 ±010
b Y389223 40 ±213 a Y504230 33 ±111 a N421 27 ±010
b Y392216 40 ±019 a Y46323 33 ±111 a N15236 22 ±010
b YG55B121 40 ±019 a Y259216 33 ±110 a N4228 22 ±010
b Y46727 40 ±010 a Y5422 33 ±019 a N9221 19 ±010
　　注 : ‘b’和 ‘a’分别代表 G2M vaⅠ标记产生的 2条带型和 1条带型 ; 材料中首字母为 Y和 N的材料分别为大白菜和白菜 ; 数据
为平均数 ±标准差 ; 例外材料用星号标出。
Note: ‘b’and‘a’rep resent two bands and one band type, respectively; The initials of accessions denote Chinese cabbage and Pak Choi,
respectively; Data are p resented as mean ±SD; Excep tional accessions are indicated with asterisk.
3　讨论
本研究选取芸薹种 16份抽薹时间变异大的材料 , 通过对 B rFLC1基因的序列比对与分析 , 开发
了 B rFLC1基因的 CAPS标记 G2M vaⅠ, 并在 96份大白菜和白菜 DH系中进行了可靠性验证。这是国
内外首次报道的与 B rFLC1基因共分离且与晚抽薹性紧密连锁的分子标记。可据此标记区分材料的抽
薹早晚 , 预测抽薹性。
现蕾和抽薹是植物开花过程中前后衔接的 2个阶段 , 本研究中以现蕾时间代表抽薹时间 , 虽存在
一定的缺陷 , 但大白菜的抽薹和现蕾表现一定的相关性 (惠麦侠 等 , 2004) , 因此现蕾的时间差异
基本能够反映抽薹早晚的差异。需要指出的是 , 虽然本研究获得的 G2M vaⅠ标记与晚抽薹性显著相
关 , 仍有一些材料不符合此规律 , 即基因型为 G的材料相对晚抽薹 , 为 A的材料相对早抽薹 , 推测
原因 : 第一 , B rFLC基因的其它拷贝或不同拷贝之间的互作对抽薹开花也有影响。Schranz等 (2002)
研究认为多拷贝的 B rFLCs基因是芸薹种作物开花时间表型变异的基础 , B rFLC以加性效应的互作方
式调节开花时间。有研究表明 98%的 B. rapa开花时间变异是由于 B rFLC1 ( 7212% ) 和 B rFLC2
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(2514% ) 的加性效应造成的 ( Schranz et al. , 2002)。第二 , 与开花时间相关的其他基因也会影响抽
薹开花。开花是一个复杂的网络系统 , 受多个基因所调控 , 拟南芥中已鉴定了 80多个与开花相关的
位点 (Levy & Dean, 1998 ) , 一些基因如 FR I、 FRL1、 FRL2、V IP3、V IP4、EL F7、 EL F8、 EF5 或
P IE1等促进 FLC的表达 (Johanson et al. , 2000; Rouse et al. , 2002; Caicedo et al. , 2004) , 而春化
过程的一些基因如 V IN 3、VRN 1和 VRN 2 ( Sung & Amasino, 2005) 和自主性途径的一些基因如 L FY、
FCA、FLD、FV E、FPA、LD和 FL K (He & Amasino, 2005) 则抑制其表达。此外 , 环境因素也会对
抽薹开花产生影响。
本研究中开发的 CAPS标记还具有共显性的特点 , 可以早期鉴定育种材料的纯合度及杂交种的纯
度 , 也可以应用于基因的定位 , 将为耐抽薹育种中的标记辅助选择提供新的工具。
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