全 文 ：园 艺 学 报 , 一
中国葡萄属野生种抗旱基因的分子标记及遗传分析
杨亚州 , 王跃进
’ , 张剑侠 , 张朝红
西北农林科技大学园艺学院 , 农业部西北园艺植物种质资源与遗传改 良重点开放实验室 , 陕西省农业分子生物学重
点实验室 , 陕西杨凌
摘 要 以葡萄属种间杂交组合燕山葡萄 河岸葡萄的 , 代群体为试材 , 采用 法构建抗旱植株
混合样 , 从 个随机引物中初步筛选出 个可以扩增出多态性 的随机引物 , 用于对供试材料扩
增分析 , 获得了与中国葡萄属野生种抗旱基因连锁的 标记 一 、 一
、 一 、
、 一 、 一 和 一 。 并将 个 标记在中国葡萄属野生种
、
欧洲葡萄
、
美洲种
的冬葡萄和沙地葡萄等 个株系或品种中做了进一步分析 。 对与目标性状连锁较紧密的 标记
进行了克隆测序 , 转化成专一性的 标记 一 。 经 叩 软件分析表明 , 标记
一 、 一 、 一巧 与目标基因位点处于同一个连锁群上 , 其中以 一 与目标基因位
点距离较近 , 为 。
关键词 葡萄属 中国野生种 抗旱性
中图分类号 文献标识码 文章编号 一 一 刃
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一 一 ,
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植株体内的水分状况是葡萄产量和品质形成的决定因素之一 , 干旱缺水会造成浆果产量减少 , 品
质下降。 实践表明 , 培育和选用抗旱性较强的品种 , 是充分利用旱区土地和资源 , 减少干旱损失的一
收稿 日期 一 一 修回 日期 一 一
基金项 目 国家 ‘ 十五 ’ 科技攻关计划项 目 巧 科技支撑计划项 目 教育部跨世纪优秀人
才培养计划项 目
通讯作者 一 翎
园 艺 学 报 卷
条经济有效的途径 。 传统的杂交育种在导人 目的基因时 , 一些不利的基因也会随之引人 , 因此就需要
一种准确有效的识别方法对其进行鉴定 。 利用与目标性状紧密连锁的分子标记有针对性的对特定基因
进行辅助选择 , 可有效解决这一问题 , 并可显著提高目的基因的选择效率 贾继增 , 方宣钧
等 , 。 在大田作物抗旱性遗传育种上 , 利用分子标记技术已经开展了大量的研究工作
, 高宁 等 , , 刘鸿艳 等 , , 。
我国是葡萄属植物原产地之一 , 蕴藏着丰富的抗性资源 , 但对中国野生葡萄资源抗旱性遗传方面
的研究很少 。 本研究利用抗旱性较强的中国葡萄属野生种燕山葡萄与抗寒抗病的美洲种河岸葡萄的种
间杂交一代群体 , 对中国葡萄属野生种燕山葡萄抗旱基因进行了分子标记和遗传分析研究 , 以期获得
葡萄抗旱育种早期筛选鉴定的分子标记 , 为探索中国葡萄属野生种抗旱基因的遗传趋势 , 以及进一步
图位克隆中国葡萄属野生种抗旱基因提供依据。
材料与方法
材料为中国野生葡萄 个种的 个株系 , 欧洲葡萄品种 个 , 欧美杂种 个 , 美洲葡萄 个种
的 个株系 表 , 以及燕山 一 、 河岸葡萄的种间杂种 代 株。 抗旱材料冬葡萄 、 沙地葡萄的
两个株系 和 作为对照 , 其他材料抗旱性鉴定参照王跃进等 的方法 。
葡萄基因组 提取采用 法 , 王跃进 等 , 。
反应体系及程序参照王跃进等 的方法 。
根据燕山 一 河岸葡萄杂交一代个体的抗旱性鉴定结果 王跃进 等 , , 选择抗旱性强和
抗旱性弱的 , 单株各 株构建抗旱植株 混合样和不抗旱植株 混合样 , 利用 法筛选特
异标记 , 。
用 软件进行抗旱基因标记的连锁遗传分析 , 一 。
从燕山 一 的扩增产物中切胶回收目的 片段 , 用 的 一 试剂盒进行
连接反应 , 然后转化大肠杆菌 , 提取质粒经 酶切鉴定后 , 将阳性克隆送上海生工公司测
序。
根据燕山 一 的 标记 一 的测序结果合成了一对特异引物 ,
咫 竹 , 用于 标记分析 。 程序为 ℃ ℃ , ℃ ,
℃ , 个循环 ℃ 而 ℃保存或直接电泳检测。
结果与分析
中国葡萄属野生种抗旱基因 标记的获得及其遗传分析
以亲本燕山 一
、 河岸葡萄以及 抗旱个体 混合样和不抗旱个体 混合样为模板筛选特
异标记 , 从 个 碱基随机引物中筛选到 个特异引物。 用这些引物对供试材料进行扩增 , 获得
的 个 标记分别为 一 、 一 、 一 、 一 、 一 、 一 和
一 。
把筛选到的特异引物在燕山 一 河岸葡萄杂交 代中的 株抗旱材料和 株不抗旱材料中扩
增分析 , 统计结果表明 个标记与目标性状存在连锁关系 表 。 其中以 标记
一
与抗
旱性田间鉴定结果 的符合程度较高 , 在 株抗旱材料 中有 株存在 一 标记 片段 , 占
, 在 株不抗旱材料中也有 株存在该标记片段 , 占 , 说明双亲杂交后染色体之间存
在交换 , 也说明 一 与抗旱基因位点有连锁 , 但连锁不是十分紧密。 本研究中获得的 标
记 一 与目标基因位点之间的交换率为 。
期 杨亚州等 中国葡萄属野生种抗旱基因的分子标记及遗传分析
表 标记在燕山 一 河岸葡萄 中的分离表现
幼 】 一 罗 认 台 吻 血
标记 不抗旱植株中存在标记的数量 重组率 标记分离比 理论值
脚
ó,‘ù砚ùù、以芍工曰
⋯
气内产ùō了了ù、曰一éú心」‘山
⋯
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抗旱植株中存在标记的数量
吻
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抗旱基因 标记在葡萄属植物中的表现
把获得的 个 标记的引物在中国葡萄属野生种
、 欧洲葡萄及美洲种葡萄共 份材料中进
一步扩增分析 表 表明 , 标记 一 存在于中国葡萄属野生种燕山 一
、 泰山 一 , 欧
洲葡萄雷司令 、 红地球以及冬葡萄等抗旱材料中 , 除欧美杂种巨峰外 , 其余 份不抗旱材料均不存
在该标记 图 , 左 。 因为葡萄抗旱性是由多基因控制的数量性状 , 本试验获得的 标记
是与抗旱基因之一连锁的标记 , 虽然巨峰葡萄也拥有这一标记 , 但可能缺乏其它的相关抗旱基
因 , 因此综合表现为不抗旱 。 标记 一 存在于燕山 一 、 雷司令 、 冬葡萄及沙地葡萄的两
个株系 和 中 , 份不抗旱材料均不存在该标记 图 , 右 。 标记 一巧
和 一 为燕山葡萄所特有的 标记 。 其余 个标记 一
、 一 和 一 存
在于燕山 一 中。 此外 , 一 存在于冬葡萄和泰山 一 一 存在于安林 一 和南郑 一
一 存在于泰山 一 、 安林 一 么 甘肃 一 和渭南 一 中。
表 标记在葡萄属植物中的扩增结果
朋 公 侧沈
品种
燕山葡萄 、。
萎奠葡萄 汕 配
株系 品种 表现型
《 〕 巧 只只 洲」
山葡萄
秋葡萄
占
翻, 了记￡“
刺葡萄 碗
复叶葡萄 哪“ 人
毛葡萄 认 心
华东葡萄 “ 故〕 疵以以
欧洲葡萄 沉 必
欧美杂种
河岸葡萄
冬葡萄
沙地葡萄
“ 诉 、
切 门
燕山 一 一
泰山 一 一
安林 一
泰山 一 一
江西 一 卿
一
平利 一
塘尾
甘肃 一 一
南郑 一
渭南 一 一
广西 一 罗 一
雷司令
红地球
巨峰 脚 。
十
之止‘
注 表示抗旱 , 表示不抗旱 十 表示存在 ,
花
一 表示缺失 。
园 艺 学 报 卷
综上所述 , 与目标基因相连锁的 标记 一 和 一 在这些材料的分析中也表现出
与植株抗旱性有一定的连锁关系 。 这进一步说明抗旱性是由多基因控制的。
图 标记 一 左 和 一 右 在葡萄属植物中的分离表现
燕山 一 河岸葡萄 泰山 一 安林 一 泰山 一 江西 一 平利 一 塘尾
甘肃 一 南郑 一 广西 一 渭南 一 巨峰 雷司令 巧 红地球
冬葡萄
取 肪 · 一 点忿
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中国葡萄属野生种抗旱基因 标记的获得
将燕山 一 中的 标记
一
克隆测序 , 结果表明该标记全长 , 登录
号为 。 用根据该序列设计的一对特异引物对燕山 一 河岸葡萄及其 , 代扩增分析 , 获得
的扩增产物约为 图 , 所以本试验获得的 标记为 一 。 在燕山 一 河岸葡萄
代 株材料中 , 标记
一 的表现与 标记 一 完全一致 , 能扩增出 一
的个体均可扩增出 一 , 不能扩增出 一 的个体均未扩增出 一 。 然而其它的供试材料
中仅有燕山 一 和泰山 一 能扩增出 标记 一 。 因为我们在红地球 、 雷司令和冬葡萄及 巨峰
中获得的 一 是用 碱基的随机引物获得的 标记 , 所以 , 根据燕山 一 中 标记
一 测序结果设计的特异引物对燕山 一 等扩增分析获得的 一 是中国野生葡萄燕山 一 和
泰山 一 特有的 标记 。 本试验获得的 标记及 标记仅是为研究葡萄抗旱基因提供了
分析的初步依据和支点 , 下一步还需要通过构建完整的遗传连锁图谱 , 以明确葡萄抗旱基因之
间的关系与距离 , 为获得更紧密的分子标记以及图谱克隆基因提供更直接的依据 。
燕山 一 河岸葡萄 一 燕山 一 河岸葡萄杂交 」代个体
肪 一 扮 八油
一 矶 切 一 仁 卿 己 矶 叩
获得的 标记与抗旱基因位点的连锁关系
经 扩检验
, 个 标记在燕山 一 河岸葡萄杂交 , 代群体中均符合 的分离规律
等 提出的 “ 双假测交 ” 构想 , 符合 或 孟德尔分离比率的 人
表 。
标记可用
据依
期 杨亚州等 中国葡萄属野生种抗旱基因的分子标记及遗传分析
于连锁图谱构建。 利用 软件对获得的 标记进行连锁作图分析 , 结果显示 , 个 标
记被分成两个连锁群 , 一 的 、 巧 与 一 处于连锁群 , 一
、 一 以 〕、
一 和 一 处于连锁群 。 目标基因位
于连锁群 上 , 以 标记 一 与目标
基因位点距离较近 , 为 。
由图 可以看出 , 已获得的试验结果中 连
锁群上的 标记 一 与抗旱基因位点
还有较远的距离 , 其它 标记距离抗旱基因
位点更远 。 由于葡萄属植物的抗旱性是多基因控
制的数量性状 , 连锁群上是否还存在其它抗旱
基因位点 , 需要下一步在获得抗旱基因大量标记
的基础上进行精细基因作图 , 并以此为基础构建
更为完整的遗传图谱做进一步分析验证 。
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图 中国葡萄属野生种抗旱基因的 标记连锁图
如
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讨论
前人通过测定一些与抗旱相关的生理指标研究葡萄属植物的抗旱性 , 已经筛选出沙地葡萄
、 冬葡
萄等抗旱性较强的葡萄种质资源 , , 并以此为亲本培育出了许多抗旱砧木
品种 , , 陈继峰 , 。 因为各个国家的气候类型不
同以及研究者所用方法上的差异 , 可能造成不同国家和地区的研究者对葡萄砧木品种抗旱性的划分有
所不同 , 。 然而 , 已报道的抗旱育种材料主要集中在沙地葡萄 、 冬葡萄等少数几
个美洲种上 , 而对我国原产的葡萄属野生种的研究和利用极少 。
长期以来 , 在葡萄遗传育种中对于抗旱性等由多基因控制的数量性状的研究难度较大。
等 指出 , 分子标记技术的发展为这些难以测量的复杂性状的遗传研究提供了一条重要的选
择途径 , 通过对抗旱相关性状基因的分子标记 , 就可 以把复杂的数量性状分解成简单的质量性状来研
究 。 本研究就是在对中国葡萄属野生种及其种间杂种抗旱性研究的基础上 , 采用 标记技术结合
分析 , 对中国葡萄属野生种的抗旱基因进行标记研究 , 获得了与中国葡萄属野生种抗旱基因相连
锁的 标记 。 采用 法筛选标记增加了选择的针对性 , 能够简便快速的找出与目标性状基因
相关性较高的标记 , 但这样可能使一些与效应较小的基因连锁的标记被漏掉 。 试验中我们从 条随
机引物中仅筛选出 条可 以扩增出特异性 片段 的引物 , 获得了与 目标性状相关的 标记
一 、 一 、 一 、 一 、 一 、 一 和 一 , 筛选效率为
。 等 采用该方法在筛选与苹果抗斑点病基因连锁的分子标记时也发现筛选效率
很低 , 仅为 。 本试验中每个连锁群上的标记数量很少 , 而且获得的标记与 目标基 因距离较大。
因此我们进一步的研究是获得大量的与目标性状基因连锁距离更近的 分子标记 , 构建完整的遗
传图谱 , 以明确抗旱基因之间的连锁关系及其在基因组中的分布。
将 标记 一 和 一 在中国葡萄属野生种和欧洲葡萄栽培品种上的验证表明 , 该
标记也存在于其他抗旱性较强的葡萄属植物中。 依据燕山葡萄中获得的 标记 一 的测序
结果设计了一对特异引物 , 对燕山 一 河岸葡萄及其杂种后代和供试的其他葡萄属植物进行扩增 ,
获得了中国野生葡萄燕山 一 和泰山 一 特有的 标记 一 。 试验表明该 标记 一
也存在于燕山 一 杂交后代的抗旱个体中。 然而 , 由于葡萄属植物种间遗传变异较大 , 葡萄抗旱基因
属于多基因控制的数量性状的特征 , 获得的 标记 一 和 一 与葡萄抗旱基因存在一
定的连锁 , 但与抗旱基因位点还有较远的距离 。 因此为进一步研究中国葡萄属野生种抗旱基因的遗传
园 艺 学 报 卷
特性 , 大量的抗旱基因标记有待获得 。 由此将可构建更加饱和的连锁图谱和更为详尽的物理图谱以对
目标基因位点进行更精确的定位。 因此 , 我们下一步的研究是利用大量的 分子标记对葡萄属植物
抗旱基因进行定位与作图分析 , 为中国葡萄属植物抗旱基因及其遗传机制研究提供更为直接的依据。
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陈继峰 葡萄砧木品种的研究现状与展望 果树科学 , 一
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方宣钧 , 吴为人 , 唐纪良 作物 标记辅助育种 北京 科学出版社 一
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高 宁 , 景蕊莲 , 陈耀锋 张传福 作物抗旱相关分子标记及辅助选择的研究进展 植物遗传资源学报 , 一
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贾继增 分子标记种质资源鉴定和分子标记育种 中国农业科学 , 一
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刘鸿艳 , 邹桂花 , 刘国兰 , 胡颂平 , 李明寿 , 余新桥 , 梅捍卫 , 罗利军 水分梯度下水稻 、 和 的相关及其
的定位研究 科学通报
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王跃进 , 肠 , 卢 江 , 葡萄无核基因的 遗传标记 西北农业大学学报 , 一
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王跃进 , 杨亚州 , 张剑侠 , 潘学军 , 万怡震 仪岭 中国葡萄属野生种及其种间 代抗旱性鉴定初探 园艺学报 , 一