全 文 ：园 艺 学 报 2007，34(6)：1520—1524
Acta Horticulturae Siniea
45S rDNA-FISH鉴定银杏雌雄性别
张 扬，朱胜男，金晓芬，洪义欢，陈建民
(扬州大学生物科学与技术学院，江苏扬州 225009)
摘 要：植物中核糖体基因主要位于染色体次缢痕的核仁组织区 (NOR)，NOR的数量与随体染色体
数相对应。以核糖体基因45S rDNA为探针，对明确的雌株和雄株银杏中期 、间期细胞进行荧光原位杂交
(FISH)。结果显示：雌株有 4个杂交点，雄株有 3个杂交点，表明雌性银杏具有4条带随体的染色体 ，而
雄性银杏具有3条带随体的染色体。进一步证明银杏的雌雄性别决定与随体染色体数有关。
关键词：银杏；核糖体基因；性别决定；荧光原位杂交
中图分类号：S 664．3；Q 343 文献标识码 ：A 文章编号：0513-353X (2007)06．1520-05
Identifcation of Male and Female Ginkgo Plants by 45 S rDNA-FISH
ZHANG Yang，ZHU Sheng—nan，JIN Xiao-fen，HONG Yi—huan，and CHEN Jian—min
(College ofBioscience and Biotechnology，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009，China)
Abstract：The ribosomal genes(45 S rDNA)encoding ribosomal RNA synthesis were located in nuclear
organizer region(NOR)in plants．The number of NOR should be corresponding to the number of chromo-
somes with satellite．The 45S rDNA was probed to the metaphase chromosomes and interphase nucleus from
male and female ginkgo plants using fluorescent in situ hybridization(FISH)．The metaphase chromosomes
and interphase nucleus of female plants displayed four hybridization signals while male plants displayed three
signals，indicating that the female plants had four chromosomes with satellite while the male plants had three
chromosomes with satellite only．The sex determination of ginkgo plants was related likely with the number of
chromosomes with satellite．
Key words：Ginkgo biloba L．；Ribosomal gene；Sex determ ination；Fluorescent in situ hybridization
银杏 (Ginkgo biloba L．)实生树定植后需 20～25年才能开花结果分出雌雄，因此，银杏雌雄性
别的早期鉴别不仅具有理论意义，且有实用价值。银杏雌雄鉴定中形态学方法和理化方法均受到银杏
生长地点和生长阶段的限制而使结果不准确 (尹立辉 等，2003)。基因组间 DNA的序列差异性对性
别鉴定也没有一个明确的结果 (王晓梅 等，2001，2002)。通过染色体核型进行雌雄鉴别至今仍悬
而未决。银杏雌株和雄株的染色体数均为 2n=24，第 1对大染色体的短臂及第 8对染色体的长臂有
随体，没有表明有性染色体的存在 (Tanaka&Sinoto，1952)。而大染色体存在的二型性现象表明与性
染色体可能有关 (Newcomer，1954)。Lee(1954)及 Polock(1957)认为雌株4条染色体具有随体，
雄株只有3条染色体具有随体。在雄株中的 1对最短的亚端部着丝粒染色体可能为性染色体。而
Chen等 (1993)的研究也表明：银杏雌株和雄株均有 4条随体染色体，但雌株的随体染色体形态有
差异，雄性的随体染色体没有差异，认为银杏的性别决定染色体机制属 WZ型，即雄株为2条 zz染
色体，雌株为 1条 w染色体和 1条 z染色体，并认为银杏性染色体与核仁组织区 (nuclear organizer
收稿日期：2007—05—15；修回日期：2007—08—27
基金项目：扬州大学高层次人才启动基金项 目 (2005)；扬州大学学生科技创新计划项 目 (2006)
通讯作者 Author for co~espondence(E—mail：jmchen@yzu．edu．cn)
致谢：诚挚感谢扬州大学农学院顾世梁教授对本文数据分析和作图所给予的帮助。
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6期 张 扬等：45S rDNA—FISH鉴定银杏雌雄性别
region，NOR)同处一条染色体上。
通常染色体的次缢痕是核糖体基因所在位置，和随体相对应，通过荧光原位杂交 (fluorescent in
situ hybridization，FISH)可进行核糖体基因的染色体定位 (Schwarzacher，2003)，即使形态不清楚的
中期染色体以及间期核也能显示该基因的位置，使随体染色体及其数量确定更直接和可靠。本研究中
以核糖体基因为探针，对雌株和雄株的中期、间期细胞进行 FISH来确定核糖体基因的位点数，从而
明确银杏雌雄性别决定与随体染色体的关系。
l 材料与方法
1．1 植物材料
研究材料采自扬州市区不同地点的每年正常开花结果、性别已知的银杏树，4株雄株中3株实
生，1株嫁接，而4株雌株中3株嫁接 (品种为佛指)，1株实生，以全球卫星定位系统 (global posi．
tioning system)进行样本树的定位，相隔距离在2 000 m左右。树龄在百年以上的有3株。
1．2 染色体制片
银杏叶芽的染色体制片根据大麦根尖的制片方法进行适当修改 (Chen et a1．，2003)。3月底采集
样本树叶芽，用 0．1％秋水仙素和0．002 mol·L 8一羟基喹啉混合液 (1：1)于室温下预处理 8 h，
卡诺固定液保存。制片时银杏叶芽水洗两次，1 mol·L HC1室温下酸解 10 min，水洗2次后37~C下
酶解 (40 g·L 纤维素酶与40 g·L 果胶酶3：1混合液)50 min，酶解后以离心法水洗3次，固定
液洗3次，最后加固定液混匀为悬浮液，火焰干燥法制片。在相差显微镜下挑选染色体收缩正常、分
散好的中期细胞制片，以75％、85％、100％的酒精各洗涤5 min，晾干备用或 一70~C保存。
1．3 荧光原位杂交
探针为包含编码 18S、5．8S、28S的 DNA和非转录序列的克隆 pTa71，简称 45S rDNA，由扬州
大学农学院提供。探针以DIG一11一dUTP经缺口平移进行标记，具体方法按试剂盒 (Roche，1745816)
说明进行。探针的杂交和检测方法根据 Chen等 (2003)的方法加以适当修改。杂交前每张制片加
200 IxL 70％甲酰胺／2×SSC，覆盖玻片后置于80℃进行染色体变性3 min。变性后将制片迅速依次浸
入 一20~C的70％、95％、100％酒精中各5 min，最后取出空气干燥。每张制片加 50 经沸水变性的
杂交液，其中含25 50％甲酰胺，10 IxL 50％硫酸葡聚糖，10 标记的探针 DNA，0．5 变性的
鲑鱼精 DNA(20 g·IxL )和5 20×SSC，37~C杂交约 18～20 h。杂交后的载玻片经 2×SSC室
温 10 min、2×SSC 37~C 5 min 2次，4×SSC／O．2％ Tween-20室温 10 min洗涤后，每张制片加 50
4×SSC／0．2％ Tween-20／BSA (bovine serum albumin)液，其中含 4 g· L 的 Anti—DIG—Fluoresces
(Roche，1207741)，37℃温育30～40 min，2×SSC 37t2洗 10 min，2×SSC室温洗涤后晾干 (不干
燥)，加 H．1000(Vector)，封片，内含 DAPI(4，6-diamidino-2一phenylindole)和 PI(propidium io—
dide)。封片后在荧光显微镜 (Olympus，BX51)下对同一细胞利用不同的滤光片进行观察摄像，IM—
AGE PRO PLUS 5．0软件处理分析所获图片。
2 结果与分析
2．1 中期细胞中核糖体基因的染色体定位
银杏中期染色体经 FISH后显示两对染色体的端部具有杂交点 (图1，A、B)，来自雌株的为一
对大染色体 (箭所示)和一对小染色体 (箭头所示)具有杂交点，而雄株的则显现一对大染色体和
一 条小染色体具有杂交点。由此可见，银杏的雌雄性别与随体染色体的数量有关。银杏染色体核型研
究表明雌株存在2对染色体具有随体，分别为第1对大染色体的短臂及 1对亚端部染色体的长臂 (高
进红 等，2005)。45S rDNA主要定位于染色体次缢痕的核仁组织区 (NOR)，染色体的结构特征表
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6期 张 扬等：45S rDNA—FISH鉴定银杏雌雄性别
中期和间期细胞的荧光原位杂交结果可进行银杏的早期性别鉴定，但间期要比中期方便。试验中很难
保证每张制片中期染色体可见，但间期细胞完全可见，只要提高制片上间期细胞的密度，通过一棵树
一 张制片就可进行准确的性别鉴定。
银杏雌株和雄株间期细胞核显示的杂交点和预期并非完全一致，出现该结果可能有两方面的原
因：一是细胞核中并非所有的45S rDNA位点都能杂交成功，导致杂交点少于预期数；二是45S rDNA
除了在 NOR区域外，在染色体其他位置也存在一些次要位置，油菜 (Maluszynska＆Heslop．Harison，
1993)、大麦 (Pedersen&Linde—Laursen，1994；Taketa et a1．，2001)、杨树 (Prado et a1．，1996)和
野豌豆 (Raina et a1．，2001)的45S rDNA物理定位就出现这种情况，加上杂交后的洗涤条件未能去
掉交叉杂交，从而导致杂交点超过预期数。
籁
兽
器
髅
露
杂交点数Number ofhybridization signal
图2 雌雄株间期细胞核中45S rDNA的荧光原位杂交结果
Fig． 2 The result of 45S JDNA at interphase nucleus in male and
female ginkgo plants by FISH
2．3 随体染色体与性染色体
Lee(1954)认为银杏的性别决定有性染色体的参与，雌株为XX，雄株为 XY。性染色体和随体
染色体有关。而 Chen等 (1993)根据大的随体染色体形态研究认为，该对染色体为性染色体，银杏
的性别决定属 WZ型，雄株为zz，雌株为 WZ型。Newcomer(1954)认为一对大染色体在不同植株
中表现二型性，约一半为中部着丝粒染色体，另一半为亚中部着丝粒染色体，该二型性的染色体可能
与性染色体有关。高进红等 (2005)的研究表明，具有随体的第 l0对染色体为性染色体。最大随体
染色体在不同的研究中非常一致，而较小随体染色体的序号在不同的研究中却不一致，Tanaka和sj—
noto(1952)认为是第 8号染色体，这与染色体的收缩程度及核型分析测量的误差有很大的关系，因
此依据随体来判断性染色体的证据并不充分。
本研究结果还不能给出随体染色体就是性染色体的有力证据，有必要同时确定一些与性别决定有
关的 DNA片段和核糖体基因的染色体定位，从而确定银杏的性染色体，这对于丰富植物的性别决定
理论具有重要意义。
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l524 园 艺 学 报 34卷
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