全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (5) : 637 - 642
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 12 - 20; 修回日期 : 2008 - 04 - 01
基金项目 : 北京市自然科学基金项目 (6052013)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: leng1p@2631net)
磨盘柿与甜柿杂交低结籽率的组织学研究
李　壮 1 , 扈惠灵 1, 2 , 曹永庆 1 , 任　杰 1 , 冷　平 13
(1 中国农业大学农学与生物技术学院 , 北京 100094; 2 河南科技学院 , 河南新乡 453003)
摘 　要 : 通过观察西村早生、禅寺丸和花御所 3种甜柿自交及与磨盘柿杂交的花粉管荧光和磨盘柿胚
囊发育的石蜡切片 , 分析磨盘柿受精率低的原因。结果如下 : ①磨盘柿与 3种甜柿杂交 , 发育种子比例
(发育种子数 /胚珠数 ) 明显低于甜柿自交 , 且父本花粉不同 , 磨盘柿的结籽率有较大差异 ; ②磨盘柿柱头
上附着的花粉量少 , 发芽率低 ; ③磨盘柿花柱中花粉管数量少 , 到达基部的条数少 , 甜柿柱头附着的花粉
量大、发芽率高 , 花柱中花粉管数量大 , 大部分可以到达子房 ; ④磨盘柿中存在多种异常胚囊 , 直接或间
接影响受精的顺利进行。较低的受精比率以及大量异常胚囊的存在是导致磨盘柿结籽率低的原因。
关键词 : 柿 ; 结籽率 ; 花粉管 ; 胚囊 ; 石蜡切片 ; 荧光显微技术
中图分类号 : S 66512　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0520637206
H istolog ica l Research on L ow Seeded Ra te of Hybr id iza tion Between‘M o2
pan sh i’and Sweet Persimm on
L I Zhuang1 , HU Hui2ling1, 2 , CAO Yong2qing1 , REN J ie1 , and LENG Ping13
(1 College of A gronom y and B iotechnology, China A gricu ltura l U niversity, B eijing 100094, China; 2 Henan Institu te of Science and
Technology, X inx iang, Henan 453003, Ch ina)
Abstract: In order to find out the cause of low fertilization rate ofMopanshi, the pollen germ ination and
pollen tube growth in style on persimmon cultivars N ishimurawase, Zenjimaru, Hanagosho and Mopanshi and
the embryo sac development ofMopanshi were observed by means of fluorescence m icroscopy and with paraffin
sections. The results obtained were as follows: ①The ratio of developed seeds ( the number of developed
seeds: the number of ovules) forMopanshi crossed with three non2astringent cultivarswas distinctly lower than
that of self2pollinated three non2astringent cultivars; ②The pollen grains landed on stigma of Mopanshi and
their germ ination rate were fewer than those of three non2astringent cultivars, which indicates that pollen grain
germ ination was affected by female parent and Mopanshi stigma is unsuitable, comparatively for pollen to ad2
here, hydrate and germ inate; ③Compared with three non2astringent cultivars, there were very fewer Pollen
tubes in Mopanshi style which were twisted and curled each other, and furthermore, the portion of pollen tube
ceased elongating before they arrived at ovary, while as far as non2astringent cultivars were concerned, abun2
dant pollen tubes could be observed in the ovary; ④D iverse aberrant embryo sacs were found on Mopanshi,
which directly or indirectly affected the normal p rocess of fertilization. In conclusion, poor fertilization and ab2
errant embryo sac were the main causes of low seeded rate forMopanshi persimmon.
Key words: persimmon; seeded rate; pollen tube; embryo sac; paraffin sections; fluorescence m icros2
copy
磨盘柿 (D iospyros kaki Thunb. ‘Mopanshi’) 是我国北方主栽涩柿品种 , 抗寒抗旱性强 , 熟期集
中 , 果实容易软化 , 货架期短。
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甜柿 (D. kaki) 耐储运 , 货架期长 , 但大部分品种抗寒性差。通过甜、涩柿间杂交育种 , 希望
从后代中筛选出兼具磨盘柿高抗优质和甜柿耐贮运特性的品系 , 像苹果、梨、柑橘等大众果品那样能
够有较长供应期。
但在柿杂交育种实践中发现 , 仅有雌花的磨盘柿结籽率低 , 中途败育现象严重 (钟云 等 ,
2004; 扈惠灵 等 , 2005; 李壮 等 , 2007 )。虽然中途败育可以通过胚挽救技术解决 , 获得植株
(Leng & Yamamura, 2006) , 但挽救对象主要是受精后 70 d左右发育的胚 , 而磨盘柿大部分为未受精
的不发育胚珠 , 无法通过胚挽救解决。
本试验旨在通过组织学观察 , 研究磨盘柿受精结籽率低的原因 , 以期提高磨盘柿受精发育种子比
率 , 增加杂交后代数量 , 为磨盘柿杂交育种作基础性工作。
1　材料与方法
母本为北京昌平区燕南果树种植园 10年生磨盘柿树。父本为日本完全甜柿 ‘花御所 ’、不完全
甜柿 ‘西村早生 ’和 ‘禅寺丸 ’, 父本花粉均采自中国农业大学绿园柿品种资源圃。
分别于 2006年 5月 28日和 2007年 5月 18日盛花期做大田杂交和父本自交。自交每组合 30朵左
右 , 杂交每组合 600朵左右 (部分花脱落 )。
以未授粉磨盘柿为材料 , 从现蕾到开花每 3 d采样 1次 , 开花当天和开花后 2 d、5 d各采样 1
次 , 每次 50个。
剥取子房 , FAA固定常规石蜡切片 , 铁矾苏木精、固绿二重染色 OLYMPUS BX51显微镜拍摄 ,
观察磨盘柿胚囊的发育情况。
花粉粒和花粉管按文献 ( Sogo & Tobe, 2005; 张青林和罗正荣 , 2006) 中的方法处理。分别在授
粉后 1、2、5、8、12、24、48、72 h取花柱和子房用 FAA固定 , 24 h后在花柱的基部切下花柱 , 自
来水冲洗 5 m in, 然后放入 1%NaClO溶液中室温过夜漂白。
取出花柱后冲洗 2～3次 , 每次 3 m in, 冲洗后放入 1 mol·L - 1 NaOH中 , 60 ℃水浴 2 h取出后 ,
自来水冲洗 3～5 m in, 用 015%水溶性苯胺蓝 (011 mol·L - 1 K3 PO4配制 ) 浸泡 3～12 h, 用于观察花
粉粒发芽率及花柱中花粉管的生长。
切除花柱的子房制作石蜡切片 , 脱蜡复水苯胺蓝染色 3～12 h, 连同花柱制作压片 , 用 OLYMPUS
BX51荧光显微镜观察拍摄胚囊中花粉管生长情况。
由于磨盘柿的花柱较大 , 所以先分部分拍照 , 然后用 photoshop软件调整照片对比度 , 拼接成完
整花柱。
花粉发芽选用培养基通过禅寺丸花粉筛选确定 : 蔗糖 120 g·L - 1 , 硼酸浓度 100 mg·L - 1 , 琼脂
浓度 012% , pH 510。
2　结果与分析
211　各组合受精发育种子比例
授粉后 15 d时可以明显区分受精发育的种子和未受精的胚珠 (扈惠灵 等 , 2006) , 此时采样剥
取种子 , 统计各自交和杂交组合的受精比例 (表 1)。
磨盘柿一个果实有 8个胚珠 , 即胚珠数为果实数的 8倍。表 1显示 3种甜柿自交组合发育种子比
例 (发育种子数 /胚珠数 ) 明显高于杂交组合。
杂交组合中 , 禅寺丸和西村早生为父本的结籽率大致相当 , 7%左右 , 花御所仅为 213%。甜柿
自交结籽率几乎是磨盘柿为母本的 10倍。不同的父本花粉无论是自交还是与磨盘柿杂交结籽率均有
差异 , 说明发育种子的比例也受到父本的影响。
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　5期 李 　壮等 : 磨盘柿与甜柿杂交低结籽率的组织学研究 　
表 1　自交与杂交组合发育种子比例
Table 1　D eveloped seeds ra tion on cross and self ing
组合
Combination
果实数
Fruit number
胚珠数
Ovule number
发育种子数
Developed seeds number
发育种子 /胚珠 /%
Developed seeds/ovules
西村早生 ª N ishimurawaseª 31 248 158 6317
花御所 ª Hanagoshoª 30 240 90 3715
禅寺丸 ª Zenjimaruª 20 160 110 6818
磨盘柿 ×西村早生 Mopanshi ×N ishimurawase 257 2 056 147 711
磨盘柿 ×花御所 Mopanshi ×Hanagosho 96 768 18 213
磨盘柿 ×禅寺丸 Mopanshi ×Zenjimaru 183 1 464 100 618
212　花粉发芽率与受精结籽的关系
授粉后 24 h以上调查几种组合离体和活体花粉发芽率。3种甜柿花粉柱头原位发芽率极显著高于
离体发芽率 , 说明柱头的小环境更适宜花粉的萌发生长。在离体培养基中 , 禅寺丸花粉发芽率最高。
一方面可能是因为本身的发芽能力较强 , 另一方面 , 试验的最佳培养基是通过禅寺丸花粉筛选出来
的 , 更适宜其花粉萌发。在磨盘柿柱头上 , 西村早生花粉发芽率最高 , 花御所最低 , 禅寺丸居中
(表 2)。
表 2　3种柿花粉离体与柱头原位发芽率
Table 2　Germ ina tion ra te of three type pollen in vitro and on stigma /%
品种
Variety
培养基
Culture medium
自花柱头
Stigma on self
磨盘柿柱头
Stigma on Mopanshi
禅寺丸 Zenjimaru 3313aA 4117bB 3416bB
西村早生 N ishimurawase 718bB 8114aA 8112aA
花御所 Hanagosho 514cB 1517cC 1111cC
　　注 : a、b、c代表处理间差异达 0105显著水平 , A、B、C代表处理间差异达 0101极显著水平。
Note: a, b, c indicate significant difference at 0105 level, A, B, C indicate significant difference at 0101 level.
花御所花粉发芽率无论是离体培养基上、自花柱头上还是异花柱头上 , 发芽率均最低 , 同时花御
所自交以及和磨盘柿杂交受精结籽率也是最低的。这说明花粉发芽率是影响柿受精结籽率的一个因
素。另一方面 , 西村早生和禅寺丸在离体和花柱原位的发芽率差异达极显著 , 但自交和杂交的结籽率
基本一致 , 这说明花粉发芽率不是影响受精结籽的惟一因素 , 还存在其他影响因素。
213　花粉管的生长与受精结籽率的关系
授粉后 2 h各组合花粉在柱头上萌发 , 24 h均有花粉管到达花柱基部 , 但数量有较大差异。与杂
交组合相比 , 自花柱头上粘附的花粉粒数量较多 , 到达花柱中部和基部的花粉管条数也多 (图 1)。
在自交组合中 , 禅寺丸和西村早生柱头的粘附能力强 , 附着的花粉粒多 , 花粉发芽率高 , 有大量花粉
管通过花柱中部和基部到达子房 (图 1, a、b)。花御所柱头粘附的花粉粒少 , 花粉发芽率低 , 因此
到达花柱基部和进入子房的花粉管也较少 (图 1, c)。磨盘柿柱头上 , 3个品种的花粉附着数量较
少 , 花粉管延伸曲折 , 大部分在中部停止生长。其中禅寺丸花粉在磨盘柿的柱头上附着数量最多 , 到
达花柱基部的花粉管条数也最多 (图 1, d)。而花御所最少 , 西村早生居中 (图 1, e、 f)。这与 3种
花粉与磨盘柿杂交结籽率的趋势一致 , 说明到达花柱基部的花粉管条数 , 也是影响柿受精结籽率的原
因。
花粉管进入子房到达珠孔附近后 , 一般每个胚囊只有一个花粉管进入。通过石蜡切片和苯胺蓝染
色荧光观察 , 西村早生自交授粉后 48 h花粉管已经进入胚囊 , 花粉管前端破裂释放出花粉管内的精
细胞等物质 (图 1, g)。但在以磨盘柿为母本的杂交组合中 , 由于受精比率较低 , 在检测的 100多个
胚囊中并没有发现这种现象。
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图 1　授粉后 24 h花柱 ( a～f) 和授粉后 48 h胚囊 ( g) 中的花粉管
a. 禅寺丸花柱 ; b. 西村早生花柱 ; c. 花御所花柱 ; d. 磨盘柿花柱中的禅寺丸花粉管 ;
e. 磨盘柿花柱中西村早生花粉管 ; f. 磨盘柿花柱中花御所花粉管 ;
g. 西村早生胚囊中的花粉管 , 前端破裂 , 释放出精细胞等物质。
F ig. 1　The growth of pollen tube in the style 24 h ( a - f) and in em bryo sac 48 h ( g) after pollina tion
a. Style of Zenjimaru; b. Style of N ishimurawase; c. Style of Hanagosho; d. The pollen tube of Zenjimaru in the style of Mopanshi;
e. The pollen tube of N ishimurawase in Mopanshi; f. The pollen tube of Hanagosho in the style of Mopanshi;
g. Male gametes were released to embryo sac from pollen tube tip of N ishimurawase.
214　胚囊发育情况与受精结籽率的关系
磨盘柿大孢子母细胞在开花前 15 d形成 (图 2, a) , 包被在珠心细胞之间。开花前 1～2 d到开
花当天 , 大孢子母细胞发育成成熟胚囊 (图 2, b)。胚囊成熟时取 50个子房 , 每个子房 8个胚珠 ,
共 400个胚珠 , 通过石蜡切片得到可供观察的胚囊 152个 , 其中正常胚囊 48个 , 其它的为异常胚囊 ,
雌配子体细胞退化 , 呈混浊液态 (图 2, c) ; 雌配子体细胞分布散乱缺少极性 , 无法分辨各个细胞类
型 (图 2, d) ; 珠被发育不完整 , 部分缺失 (图 2, e) ; 雌配子体细胞完全退化 , 胚囊仅有少量退化
细胞的残痕 , 基本中空 (图 2, f ) ; 卵细胞正常 , 但两个助细胞提前瓦解退化 (图 2, g)。这些异常
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　5期 李 　壮等 : 磨盘柿与甜柿杂交低结籽率的组织学研究 　
胚囊直接或间接影响磨盘柿胚囊受精的顺利进行 , 是导致磨盘柿结籽率低的另一个原因。
禅寺丸和西村早生正常胚囊的比例较高 , 很容易通过切片观察到。禅寺丸成熟胚囊 (图 2, h) ,
各细胞呈极性分布 , 卵细胞在靠近珠孔端 , 中央细胞位于胚囊中部 , 包含两个极核。
图 2　胚囊的发育
a. 开花前 15 d磨盘柿珠被中大孢子母细胞 ; b. 磨盘柿成熟胚囊 ; c. 磨盘柿雌配子体液态退化的异常胚囊 ;
d. 磨盘柿雌配子体细胞无极性的异常胚囊 ; e. 胚珠珠被破损 ; f. 磨盘柿中空的异常胚囊 , 带有退化细胞的残痕 ;
g. 磨盘柿助细胞退化的异常胚囊 ; h. 禅寺丸正常胚囊中的卵细胞和中央细胞。
F ig. 2　D evelopm en t of em bryo sac
a. Embryo sac mother cell in integument 15 days before anthesis; b. Mature embryo sac of Mopanshi; c. Mopanshi aberrant embryo sac
with female gametophyte degenerated into liquid; d. Female gametophyte cell without polarity; e. Ovules with broken integument;
f. Aberrant emp ty embryo sac of Mopanshi with only a little degenerative cell trace;
g. Mopanshi embryo sac with degenerative synergid; h. Normal embryo sac of Zenjimaru.
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3　讨论
磨盘柿结籽率低的原因 : 首先磨盘柿柱头粘附力较弱 , 附着的花粉量较少 ; 其次花粉在磨盘柿柱
头上的发芽率较低 , 磨盘柿花柱中生长的花粉管数量较少。这两个原因直接或间接导致到达子房的花
粉管数量较少 , 降低了胚囊受精的几率。
从胚囊的发育情况来看 , 当花粉管延伸到胚珠附近 , 胚囊分泌信号物质引导花粉管向胚囊生长 ,
花粉管应答这些信号物质 , 不断调整尖端生长方向 , 朝向珠孔处 , 最终从珠孔处伸入胚囊 (H igashiy2
ama et al. , 2001)。因此胚囊既是雌雄性细胞融合受精的场所 , 又是雄配子得以顺利进入胚囊的保证。
磨盘柿存在很多异常胚囊 , 这些胚囊的先天缺陷性一方面导致花粉管生长缺少引导物质而迷失方向 ,
无法把雄配子顺利送入胚囊 , 另一方面即使精细胞进入这样的胚囊也无法正常完成受精过程。这也是
导致磨盘柿受精比率低的原因。
磨盘柿部分正常胚囊以及少量到达子房的花粉管的存在 , 致使磨盘柿受精并没有完全受到抑制 ,
而是可以低频率结籽。
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