全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (2) : 285 - 288
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 08 - 01; 修回日期 : 2007 - 11 - 16
基金项目 : 国家 ‘863’计划项目 (2006AA1001082421229) ; 山东省农业良种工程项目 (200223013) ; 山东省农业科学院自主创
新基金项目 (2006YCX016)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: rschan@ cau1edu1cn)
秋水仙素诱导樱桃矮化砧木 ‘吉塞拉 6号 ’获得
六倍体再生植株
刘庆忠 1, 2 , 马怀宇 2 , 魏海蓉 2 , 艾呈祥 2 , 张力思 2 , 赵　彦 3 , 罗伯特 ·戴维
斯 3 , 韩振海 13
(1 中国农业大学园艺植物研究所 , 北京 100094; 2 山东省果树研究所 , 山东省果树生物技术育种重点实验室 , 山东泰
安 271000; 3 美国农业部植物分子病理学实验室 , 美国 马里兰州 贝茨威尔 20705)
摘 　要 : 以三倍体樱桃矮化砧木 ‘吉塞拉 6号 ’ ( P runus ceransus ×P. canescens) 的离体叶片为外植体 ,
采用秋水仙素诱导处理再生出六倍体植株。将外植体首先在加有秋水仙素 ( 50 mg·L - 1 )、生长素 ( IBA
015 mg·L - 1 ) 和细胞分裂素 (BA 510 mg·L - 1 ) 的改良 W PM液体培养基中培养 5 d, 再转移到不含秋水
仙素 (其它成分相同 ) 的固体培养基上继续培养 56 d, 再生出形态变异明显的新梢。采用流式细胞仪鉴定
染色体倍性 , 确定其为六倍体新梢。六倍体植株与三倍体的 ‘吉塞拉 6号 ’植株形态学上有明显差异。六
倍体的试管苗已在大田移栽成活 , 并已成功高接在甜樱桃大树上。
关键词 : 樱桃 ; 矮化 ; 砧木 ; 秋水仙素 ; 多倍体 ; 六倍体 ; 再生植株
中图分类号 : S 66512　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0220285204
Regenera tion of Hexaplo id Plan ts of Cherry D warf Rootstock ‘G isela 6’
from in V itro L eaves Trea ted w ith Colch ic ine
L IU Q ing2zhong1, 2 , MA Huai2yu2 , W E I Hai2rong2 , A I Cheng2xiang2 , ZHANG L i2si2 , ZHAO Yan3 , Robert
E. Davis3 , and HAN Zhen2hai13
(1 Institu te of Horticulture Plants, China A gricultural U niversity, B eijing 100094, China; 2 Shandong Institu te of Pom ology, Key
L abora tory for Fruit B iotechnology B reed ing of Shandong, Taipian, Shandong 271000, Ch ina; 3USDA /ARS M olecu lar Plan t Pa2
thology Laboratory, B eltsville, MD 20705, USA )
Abstract: An in vitro shoot regeneration technique combined with colchicine app lication has been em2
p loyed to p roduce hexap loid p lants from leaf segments of the trip loid cherry rootstock ‘Gisela 6’ ( P runus
ceransus ×P. canescens). Leaf segmentswere treated firstly with colchicine (0 - 200 mg·L - 1 ) in the liquid
modified W PM medium supp lemented with auxin ( IBA 015 mg·L - 1 ) and cytokinin (BA 510 mg·L - 1 ) for
five days and then transferred on the same regeneration solid medium with no colchicine for 56 days. In this
case, putative hexap loid shoots were only regenerated from the leaf exp lants in the treatment of 50 mg·L - 1
colchicine after 8 weeks on the regeneration medium. Flow cytometry was used for p loidy determ ination. The
hexap loid p lants were distinguishable from the trip loid on morphological characters. A ll p lantswere successful2
ly transp lanted into field and topworked on the sweet cherry trees to evaluate its agronom ic traits.
Key words: cherry; dwarf; rootstock; colchicine; polyp loid; hexap loid; regeneration
吉塞拉 ( Gisela) 是酸樱桃 ( P runus ceransus, 2n = 4x = 32) 和灰毛叶樱桃 ( P. canescens, 2n =
2x = 16) 杂交育成的三倍体种质 ( 2n = 3x = 24 ) (W ebster & Looney, 1996 )。用 ‘吉塞拉 6号 ’
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园 　　艺 　　学 　　报 35卷
( P runus cerasus ×P. canescens) 做砧木嫁接的甜樱桃 , 其树体仅相当于 ‘马扎德 ’砧木的 70% , 而且
结果早 , 果实大 , 丰产性强 , 抗细菌性溃疡病 ( Pseudom onas syringae)、洋李矮缩病毒病 ( PDV ) 和
樱桃环斑坏死病毒病 ( PNRSV ) , 抗寒性强 , 固地性好 , 对土壤适应范围广 (刘庆忠 等 , 2001a)。
由于其自身为三倍体种质 , 高度不育 , 采用常规杂交技术难以进一步改良。作者采用染色体组加倍技
术创造 ‘吉塞拉 6号 ’的同源六倍体新种质 , 以提高其可育性。
1　材料与方法
将 ‘吉塞拉 6号 ’的离体新梢保存在增殖培养基上 , 每 4周取 1 cm新梢作为外植体 , 将其接种
在增殖培养基 (MS无机盐添加 100 mg·L - 1肌醇、015 mg·L - 1盐酸硫胺素、015 mg·L - 1 6 - 苄基
嘌呤、30 g·L - 1蔗糖和 6 g·L - 1琼脂 , pH 516) 上进行扩繁。培养室温度 25 ℃, 光照强度 2 000 lx,
光周期为 16 h光照和 8 h暗处理。
外植体在增殖培养基上生长 3～4周后 , 取 1～2 cm新梢转移到 1 /2 MS添加 IBA 013 mg·L - 1的
生根培养基上进行生根培养。黑暗处理 10 d后 , 再转移到光下培养 4周。
从诱导生根培养基上取生长 3周的小植株顶部展叶 2～3片 , 去掉叶柄和叶尖端 1 /3, 在中脉处
横切两刀 , 切口向上接种于附加不同浓度 (0～200 mg·L - 1 ) 秋水仙素的不定芽再生培养基中。再
生培养基成分为改良的 W PM液体培养基 (刘庆忠 等 , 2001a)。
叶片外植体先在含秋水仙素的液体再生培养基中培养 5 d后取出 , 用无菌水冲洗两次 , 然后转到
不含秋水仙素 (其它成分相同 ) 的固体再生培养基上继续进行不定芽诱导。外植体接种后先黑暗处
理 10 d, 然后在光下培养 (条件同上 ) , 每 2周更换 1次培养基 , 8周后统计再生不定芽数和愈伤组
织数 , 计算再生率。
将再生的不定芽转移到新梢增殖培养基上进行继代培养。在此期间根据目测将有形态变异的新梢
单独取出进行增殖。如此反复筛选增殖 1年后 , 选取新梢顶端叶片外植体进行不定芽诱导再生 , 以求
所获得的变异体达到最大程度的纯合。
取 10 mg离体新梢叶片加 015 mL的 Partec HR2A溶液 (分离细胞核的柠檬酸缓冲液 ) 研磨。将
样品通过 30μmol·L - 1 Partec Celltrics TM微孔膜过滤到测试管中 , 加 015 mL Partec HR2B溶液 (DA2
P I溶液 ) 于样品中 , 将样品上样于 Partec倍体分析仪 (德国 , Münister) , 测定样品单个细胞核的
DNA总量。测定结果由仪器直接绘出 DNA曲线图 (刘庆忠 等 , 2001b, Meng & Chad, 2002 )。
将经倍体分析仪测定为六倍体的材料置于新梢增殖培养基上进行扩大繁殖 , 在 1 /2MS附加 013
mg·L - 1 IBA的培养基上生根 , 于温室条件下炼苗 4周 , 最后移栽于大田。
2　结果与分析
211　六倍体材料的获得
从表 1可看出 , ‘吉塞拉 6号 ’试管苗的离
体叶片外植体置于附加不同浓度秋水仙素的培养
基上 , 均能诱导出愈伤组织。随着秋水仙素浓度
的提高 , 愈伤组织和不定芽的再生率降低 , 当浓
度分别为 50和 100 mg·L - 1时 , 再生率分别为
65%和 40%。仅在附加秋水仙素浓度 50 mg·L - 1
的培养基上获得了六倍体新梢 , 有 10%的外植体
形成了六倍体新梢。高浓度的秋水仙素 ( 100～
表 1　秋水仙素对樱桃矮化砧木 ‘吉塞拉 6号’
六倍体新梢形成的诱导
Table 1　Effect of colch ic ine on shoot regenera tion and
hexaplo id forma tion of cherry dwarf rootstock‘G isela 6’
秋水仙素 / (mg·L - 1 )
Colchicine
愈伤组织
Calli
不定芽 /%
Shoot
六倍体新梢 /%
Hexap loid shoot
　0 100 8510 0
50 100 6510 10
100 70 4010 0
200 20 0 0
　　注 : 每个处理至少接种 30个外植体。
Note: The number of inoculated leaf exp lant was at least 30.
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　2期 刘庆忠等 : 秋水仙素诱导樱桃矮化砧木 ‘吉塞拉 6号 ’获得六倍体再生植株 　
200 mg·L - 1 ) 处理抑制外植体愈伤组织的诱导和不定芽再生 , 最终导致死亡。
从秋水仙素诱导形成的不定芽丛中选出形态变异大的新梢 , 在增殖培养基上扩大繁殖 , 然后取其
顶部叶片进一步诱导不定芽和纯化变异体 , 用于进行倍性鉴定和诱导生根形成纯合的六倍体植株。
212　倍性鉴定
将对照和测试样品的细胞悬浮液分别在倍体分析仪上测试初始结果 , 然后将两个样品混合再次在
倍体分析仪上测试分析 , 其结果见图 1。图 1显示的前两个峰是所测定的三倍体对照 (峰 1) 和六倍
体材料 (峰 2) 细胞核内 DNA相对荧光分布。变异材料 DNA相对荧光峰中值 (162145) 大于对照
(81161) 近一倍 , 这也就证明了所测定的变异材料比对照细胞核 DNA含量和染色体数高出一倍 , 说
明来自峰 2的材料即为六倍体。峰 3相对荧光中值 (322108) 是峰 2 (162145) 的近两倍 , 峰的高度
矮面积小 , 细胞积累少 , 为来自六倍体材料中处于有丝分裂的间期和前期状态的细胞 , 这些细胞
DNA含量加倍。峰 3出现是倍体分析仪一种常见干扰现象 (图 1)。
图 1　 Partec倍体分析仪测出的三倍体与六倍体樱桃矮化砧木 ‘吉塞拉 6号’的细胞 D NA含量分布图
F ig. 1　The cell D NA d istr ibution h istogram of puta tive hexaplo id and tr iplo id cherry dwarf
rootstock‘G isela 6’ana lyzed by Partec plo idy ana lyzer
本试验中秋水仙素存在于叶片不定芽原基形成的全过程中 , 这最大程度地减少或去除了嵌合体形
成的可能性 , 这是因为叶片外植体不定梢多为单细胞起源 (L itz & Gray, 1992)。要完全确定材料是
否为纯合体 , 需等 2～3年开花之后 , 观察配子体组织的减数分裂 , 通过比较花粉粒的大小来确定 L2
层的倍性水平。
213　营养生长性状比较
六倍体的 ‘吉塞拉 6号 ’与三倍体相比 , 离体新梢的生根率、生根数量和根长度均表现出很大
的不同 (表 2, 图 2) , 六倍体试管苗根系粗而短 , 发根数少 ; 六倍体试管苗新梢节间也短而粗。六
倍体试管苗移栽于苗盘 , 表现出植株矮 , 茎粗壮 , 叶片浓绿 , 叶缘锯齿深 , 叶片圆、叶片长宽比显著
小于对照 (表 3) , 在田间也表现健壮 , 节间短 , 叶片圆而厚 , 叶柄短而粗 (图 3)。
表 2　六倍体与三倍体的樱桃矮化砧木 ‘吉塞拉 6号’离体新梢根系的诱导
Table 2　Com par ison of root induction and root grow ing length between tr iplo id and hexaplo id cherry dwarf rootstock‘G isela 6’
品系
Strain
接种新梢数
Number of inoculation
生根新梢数
Number of rooting
生根率 /%
Rate of rooting
根数 /株
Root number/p lant
根长 / cm
Root length
六倍体 Hexap loid 50 30 60 1183 210
三倍体 Trip loid 50 44 88 2145 511
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表 3　六倍体樱桃矮化砧木 ‘吉塞拉 6号’自根试管苗在苗盘内生长 6周的形态表现
Table 3　Phenotyp ic character istics of hexaplo id cherry dwarf rootstock‘G isela 6’grown in the seedling plan t tray for 6 weeks
株系
L ines
高度 / cm
Height
粗度 /mm
Stem diameter
叶片长宽比
Leaf length /breadth ratio
三倍体对照 Trip loid wild type 6175a 1151a 1197a
GH21 4151b 2120b 1176b
GH22 4124b 2111b 1170b
GH23 3176b 1193b 1173b
　　注 : LSD法检验 , 不同字母表示三倍体与六倍体之间差异显著 ( P≤0105)。
Note: D ifferent letters indicate significance between trip loid and hexap loid at P≤0105 by LSD test.
图 2　六倍体 (左 ) 和三倍体 (右 ) 樱桃矮化砧木
‘吉塞拉 6号’试管苗形态特征
F ig. 2　M orpholog ica l character of in vitro plan ts of
hexaplo id ( left) and tr iplo id ( r ight)
cherry dwarf rootstock‘G isela 6’
图 3　六倍体 (左 ) 和三倍体 (右 ) 樱桃矮化砧木 ‘吉塞拉 6号’
自根试管苗在田间生长 2个月的形态特征
F ig. 3　Appearance of the hexaplo id and tr iplo id sweet
dwarf rootstock‘G isela 6’grown
in f ield for 2 m on ths
References
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