全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (6) : 1237～1240
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 04 - 11; 修回日期 : 2006 - 06 - 21
基金项目 : 云南省农业生物技术重点实验室开放基金资助项目 (2001B23)3 通讯作者 Authors for correspondence ( E2mail: shwkj@mail1neau1edu1cn)
滇黑两省黄瓜花叶病毒南瓜分离物外壳蛋白基因序
列分析
杨国慧 2 　张仲凯 1 　崔崇士 23
(1云南省农业生物技术重点实验室 , 云南昆明 650223; 2东北农业大学园艺学院 , 黑龙江哈尔滨 150030)
摘 　要 : 利用免疫捕捉多聚酶链式反应 ( Immuno2Cap ture PCR, IC2PCR) 方法从南瓜的两个黄瓜花叶
病毒 (Cucum ber m osa ic virus, CMV) 云南分离物 (CMV2YN ) 和黑龙江分离物 (CMV2HLJ) 中扩增获得约
700 bp的外壳蛋白 (Coat p rotein, CP) 基因片段 , 并克隆到 pGEM 2T载体中。核苷酸序列测定表明 , CMV2
HLJ和 CMV2YN两个分离物 CP基因长为 657 bp, 编码 219个氨基酸 , 两个分离物的核苷酸和氨基酸同源性
分别达到 9618%和 9714%。和国外 CMV亚组 Ⅰ 6个分离物核苷酸序列同源性在 90%以上 , 氨基酸同源性
在 97%以上 , 和亚组 Ⅱ 6个分离物的同源性分别为 6614%和 7314%。和国内亚组 Ⅰ 10个分离物的核苷酸
同源性都在 8915%以上 , 氨基酸同源性在 93%以上 , 而和亚组 Ⅱ两个分离物的同源性分别为 6813%和
7315%。序列分析结果表明 CMV2HLJ和 CMV2YN两个分离物属于 CMV亚组 Ⅰ。
关键词 : 南瓜 ; CMV; IC2PCR; CP基因
中图分类号 : S 64211; S 4361421　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0621237204
Sequence Ana lysis of C P Genes of CM V from Pum pk in in Y unan and
He ilongjiang Prov inces
Yang Guohui2 , Zhang Zhongkai1 , and Cui Chongshi23
(1 Yunnan Key Lab of A gricultural B iotechnology, Kunm ing, Yunnan 650223, Ch ina; 2 Horticultural College, N ortheast A gricul2
tura l U niversity, Harbin, Heilongjiang 150030, Ch ina)
Abstract: The CP genes were amp lified by IC2PCR from CMV2HLJ and CMV2YN isolated from pumpkin
in Heilongjiang and Yunan Provinces and cloned to pGEM 2T vector. Analysis of nucleotide sequence showed
that the length of CP genes of CMV2HLJ and CMV2YN was 657 bp, encoding 219 am ino acid. The homology
of nucleotide and am ino acid sequences of CP gene between these two isolates was 9618% and 9714% respec2
tively. The homology of nucleotide and am ino acid sequences of CP gene of these two isolates was higher than
90% and 97% respectively compared with six external isolates of CMV subgroupⅠ, and 6614% and 7314%
respectively compared with another six external isolates of CMV subgroup Ⅱ, and higher than 8915% and
93% respectively compared with ten Chinese isolates of CMV subgroupⅠ, and 6813% and 7315% respec2
tively compared with two Chinese isolates of CMV subgroup Ⅱ. A ll these data showed that CMV2HLJ and
CMV2YN belonged to CMV subgroupⅠ.
Key words: Pumpkin; CMV; IC2PCR; CP gene
黄瓜花叶病毒 (Cucum ber m osa ic virus, CMV ) 是雀麦花叶病毒科 (B romoviridae) 黄瓜花叶病毒
属 (Cucum ovirus) 的典型成员。病毒粒子为等轴对称的 20面体 , 直径约 29 nm, 其寄主范围广 , 能
侵染 1 000多种植物〔1〕, 所有葫芦科植物均可被侵染 , 为葫芦科作物在世界范围内常易发生的 5种病
毒病之一〔2〕。几十年来 , 我国先后从 38科的 120多种植物上分离到 CMV, 在葫芦科作物上研究报道
较多的是西瓜、甜瓜〔3, 4〕, 采用的研究方法主要是生物学方法和血清学方法。
黑龙江省和云南省是我国南瓜 (Cucurbita m oscha ta L inn. ) 生产大省 , 近年来随着栽培面积的不
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断扩大 , 病毒病害日益加重 , 为此 , 开展了对两省南瓜病毒病的研究。本研究是采用免疫捕捉多聚酶
链式反应 ( Immuno2Cap ture PCR, IC2PCR) 方法 , 对从南瓜上获得的 CMV分离物的 CP基因进行克隆
和序列分析 , 以便从分子水平上进一步确定所属株系 , 为南瓜主要病毒病的防控提供依据。
1　材料与方法
111　材料
云南省南瓜病样于 2002年 3月采自于云南省思茅港市 , 病样为果实 , 表现症状为果实粗糙 ; 黑
龙江省南瓜病样于 2002年 7月采自于东北农业大学香坊试验农场 , 病样为叶片 , 表现症状为花叶、
叶片畸形。经电镜和 EL ISA检测均为 CMV , 分别命名为黄瓜花叶病毒云南分离物 (CMV2YN ) 和黄
瓜花叶病毒黑龙江分离物 (CMV2HLJ)。
112　方法
11211　病样的 IC2PCR检测 　CMV的外壳蛋白基因引物参照徐平东等〔5〕的报道设计合成 L1: 5pi2ATG2
GACAAATCTGAATCAACC23pi, L2: 5pi2TAAGCTGGATGGACAACCCGT23pi。
在 PCR管中加入按 1∶3 000比例稀释的 CMV兔多抗血清 , 37℃包被 3 h, PBST缓冲液 (pH 714)
洗涤 3次。病叶以 1∶10的比例稀释后加入 , 37℃包被 3 h, PBST洗涤 3次 , M illi2Q H2O (超纯水 )
洗涤 1次 , 进行反转录和 PCR反应 , 反转录和 PCR反应体系及反应条件参照文献 〔6〕的方法 , 以
健康植株为阴性对照 , CMV多抗血清由云南省农业科学院生物技术所植物病理中心自制。
11212　外壳蛋白基因的克隆 　利用上海华舜生物工程有限公司的胶回收试剂盒回收目的片段 , 克隆
到 pGEM 2T载体 ( Promega公司 ) 中 , 转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞 , 利用蓝白斑法筛选阳性克隆
并利用 PCR和酶切方法进行鉴定。质粒提取采用 Q iagen公司的 Q iagen Plasm id M inip rep Kit试剂盒 ,
酶切所用酶为 Promega公司的 B stz1。
11213　测序及序列分析 　序列测定由上海生工生物工程技术服务有限公司完成 , 测序时选取 2～3个
阳性克隆 , 双向测序 , 测序引物为 T7 /SP6, 获得的序列利用 DNASIS软件进行分析。
2　结果与分析
211　CM V的 IC2PCR检测结果
利用 IC2PCR方法 , 从 CMV的两个南瓜分离物中均扩增出约 700 bp的目标条带 , 而阴性对照在
此位置没有条带 (图 1)。
212　重组质粒的鉴定
从每个分离物的转化平板上挑取 5个白色菌落进行 PCR检测 , 结果表明所挑取的菌落中部分含
有插入片段 , 挑取经 PCR检测含有插入片段的菌落在 37℃摇床中培养过夜 , 提取质粒 , 利用 B stz1
酶进行酶切 , 两个分离物在约 800 bp切下目标片段 (图 2)。
图 1　CM V的 IC2PCR扩增
M: DNA marker; CK: 阴性对照 ; 1: CMV2HLJ; 2: CMV2YN。
Fig. 1　IC2PCR amplif ication of CP genes of CMV2HLJ and CMV2YN
M: Marker DL 2 000; CK: Healthy pumpkin; 1: CMV2HLJ isolated
from Heilongjiang; 2: CMV2YN isolated from Yunan. 图 2　CM V重组质粒的酶切鉴定M: Marker DL 2 000; 1: CMV2HLJ; 2: CMV2YN。F ig. 2　D etection of CM V recom b inan t productsd igested w ith restr iction enzym e
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　6期 杨国慧等 : 滇黑两省黄瓜花叶病毒南瓜分离物外壳蛋白基因序列分析 　
213　插入片段的序列分析
序列分析表明 , CMV 黑龙江分离物 ( CMV2
HLJ) 和 CMV 云南分离物 ( CMV2YN ) CP基因
长为 657 bp, 编码 219个氨基酸 ( GenBank登录
号为 DQ459481, DQ459482) , 两个分离物的核苷
酸和氨基酸同源性分别为 9618%和 9714% , 和国
外 CMV 亚组 Ⅰ 6 个分离物 ( CMV2AB I、CMV2
BA、CMV2C、 CMV2FNY、 CMV2NY、 CMV2TFN )
的核苷酸序列同源性都在 90%以上 , 氨基酸同源
性在 97%以上。和 CMV 亚组 Ⅱ 6 个分离物
( CMV2KI、 CMV2M2、 CMV2Q、 CMV2SN、 CMV2
TRK、CMV2WL ) 的 同 源 性 分 别 为 6614% 和
7314%。和国内 CMV 亚组 Ⅰ分离物 ( CMV2BD、
CMV2M、 CMV2PE、 CMV2PF、 CMV2SD、 CMV2
YNT、 CMV2ZJ1、 CMV2ZJ2、 CMV2ZJ3、 CMV2
ZJ4) 相比 , CMV2HLJ无论是核苷酸还是氨基酸
序列都和山东分离物 (CMV2SD ) 的同源性最高 ,
为 98% , CMV2YN 和山东分离物 ( CMV2SD ) 的
核苷酸和氨基酸序列同源性分别达到 9618%和
99% , 和海南分离物 ( CMV2PF) 氨基酸的同源
性也达到 99% , 而和两个 CMV 亚组 Ⅱ分离物
(CMV2XB、CMV2YNB ) 的同源性分别为 6813%
和 7315% (表 1)。
3　讨论
表 1　CM V黑龙江、云南分离物和国内外 CM V分离物的
核苷酸、氨基酸序列的同源性
Table 1　Hom ology of nucleotide and am ino ac id sequences
of CP genes of CM V2Y N and CM V2HL J com pared w ith
externa l and Ch inese isola tes
CMV亚组
CMV
Sabgroup
分离物
Isolates
同源性 Homology( % )
CMV2HLJ CMV2YN 登录号GenBankaccession
CMV2YN 9618 (9714)
国外Ⅰ CMV2AB I 9718 (9717) 9618 (9714) L36525
OverseasⅠ CMV2BA 9012 (9714) 9012 (9813) U43888
CMV2C 9216 (9714) 9216 (9618) D42079
CMV2FNY 9012 (9714) 9012 (9813) D10538
CMV2NY 9012 (9714) 9012 (9813) U22821
CMV2TFN 9112 (9714) 9112 (9910) Y16926
国外Ⅱ CMV2KI 6614 (7314) 6614 (7314) Z12818
OverseasⅡ CMV2M2 6614 (7314) 6614 (7314) AB006813
CMV2Q 6614 (7314) 6614 (7314) J02059
CMV2SN 6614 (7314) 6614 (7314) U22822
CMV2TRK 6614 (7314) 6614 (7314) L15336
CMV2WL 6614 (7314) 6614 (7314) D00463
国内Ⅰ CMV2BD 9413 (9311) 9413 (9311) X65017
Domestic ⅠCMV2M 9118 (9513) 9118 (9513) AF268599
CMV2PE 9213 (9716) 9213 (9716) AF268597
CMV2PF 9316 (9810) 9316 (9910) AF368192
CMV2SD 9810 (9810) 9618 (9910) AB008777
CMV2YNT 9213 (9716) 9213 (9716) AJ239098
CMV2ZJ1 8916 (9610) 8916 (9610) AF33968
CMV2ZJ2 8916 (9610) 8916 (9610) AY138992
CMV2ZJ4 9118 (9716) 9118 (9716) AJ006998
国内Ⅱ CMV2XB 6813 (7315) 6813 (7315) AF268598
Domestic ⅡCMV2YNB 6813 (7315) 6813 (7315) AJ242585
　　注 : 括号外为核苷酸序列 , 括号内为氨基酸序列。
Note: The numbers outside brackets are homology of the nucleo2
tide sequences and the numbers inside brackets are homology of the
am ino acid sequences.
　　研究者根据寄主反应、血清学关系、病毒外壳蛋白肽链图谱分析核酸杂交、RT2PCR产物酶解分
析及核苷酸序列分析 , 将现有的 CMV株系或分离物区分为 2个亚组。从已测定部分序列的 50多个
CMV株系的 CP基因同源率看 , 同一亚组不同分离物的同源率均在 90%以上 , 而不同亚组间分离物
的同源率则仅在 70% ～80%〔1, 7～9〕。本研究表明 , 无论是 CMV黑龙江分离物还是云南分离物和国内
外 14个 CMV亚组Ⅰ分离物 CP基因核苷酸的同源性都达到 90%以上 (和国内的两个分离物 CMV2
ZJ1、CMV2ZJ2同源性在 90%以下 , 但达到了 8916% ) , 而和亚组 Ⅱ分离物的 CP基因核苷酸同源性
在 69%以下 , 说明这两个分离物都属于 CMV亚组Ⅰ。
CMV可通过 60多种蚜虫进行传播 , 但研究者也发现了一些不能被蚜虫传播的分离物。王海河
等〔10〕对失去蚜传特性的 CMV2M株系的 RNA3进行了全序列分析 , 分析结果表明 M株系 CP第 215位
的 G改变为 R, 他认为这很可能是 M株系失去蚜传能力的根本原因 , 并且推测不同株系的独特性质
是由某个特异的核苷酸或氨基酸决定的。本研究中对 CMV云南、黑龙江两个分离物的外壳蛋白序列
分析表明在第 215位都为 G, 说明这两个 CMV分离物的 CP基因都具有蚜传结构特征。
采用抗病品种是防治病毒病的有效措施 , 但目前传统杂交育种存在缺乏理想的抗源材料、育种周
期长等问题。抗病毒基因工程是培育抗病品种的一种理想方法 , 而导入 CMV CP基因是目前介导
CMV抗性较为成功的一种方法 , 但总的说来采用单一基因策略获得的工程植株多数情况下表现的是
阶段抗病性及延迟发病〔11〕。主要的葫芦科作物在生长中容易受到几种病毒的混合侵染 , 为了扩大转
基因植株的抗病范围 , 国外研究者将两种或多种病毒的 CP基因转化到葫芦科作物上〔12, 13〕。本研究通
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过在黑龙江、云南两省采集南瓜病样 , 已确定云南省南瓜的主要病毒病原为番木瓜环斑病毒西瓜株系
( Papa ra ring spot virus W , PRSV2W )、CMV, 黑龙江省南瓜的主要病毒病原为 CMV、西瓜花叶病毒 2
号 (W aterm elon m osa ic virus 2, WMV22) , 并已分别克隆了其 CP基因。今后可在此基础上 , 针对两省
主要的南瓜病毒病分别构建含有 PRSV2W和 CMV , CMV和 WMV22的 CP基因的表达载体并转化到南
瓜中 , 从而提高转基因植株的抗病性。
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