全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (6) : 1193～1198
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 06 - 21; 修回日期 : 2006 - 08 - 21
基金项目 : 国家 ‘973’项目 (2006CB100203)3 通讯作者 Authors for correspondence ( E2mail: sfli@ ippcaas1cn; wanghq@ cau1edu1cn)
杏和李树啤酒花矮化类病毒的检测与序列分析
杨元爱 1, 2 　李世访 23 　成卓敏 2 　王红清 13
(1 中国农业大学农学与生物技术学院果树系 , 北京 100094; 2 中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家
重点实验室 , 北京 100094)
摘 　要 : 从无明显症状表现的 24个杏样品 , 37个李样品的 1年生枝条表皮中抽提低分子 RNA进行
D IG2cDNA斑点杂交、RT2PCR、正反向聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Return2PAGE) 和生物学检测。结果表明 : 杏
有 3个样品 , 李有 6个样品带有啤酒花矮化类病毒 (Hop stun t viroid, HSVd)。从这 9个样品中选 a5、 a17、
p6、p16进行克隆和测序分析。所得序列与 GenBank中已报道的 HSVd序列同源性达 9910% ～9917% , 且
序列变异与地域、寄主等无明显相关性 , 说明 HSVd的序列是比较保守的。
关键词 : 啤酒花矮化类病毒 ; 检测 ; 杏 ; 李
中图分类号 : S 66212; 66213　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0621193206
D etection and Sequence Ana lysis of H op stun t viro id in Apr icot and Plum
Yang Yuanai1, 2 , L i Shifang23 , Cheng Zhuom in2 , and W ang Hongqing13
(1D epartm ent of Fru it Science, College of A gronom y and B iotechnology, China A gricu ltura l U niversity, B eijing 100094, China;
2 S ta te Key Labora tory of B iology of P lant D iseases and Insect Pests, Institu te of P lant Protection, Chinese A cadem y of A gricultural
Sciences, B eijing 100094, Ch ina)
Abstract: Low molecular mass RNA s extracted from bark of one year old branch of 24 ap ricot samp les,
37 p lum samp les were used for D IG2cDNA Dot2blot hybridization, RT2PCR, Return2PAGE and biological in2
dexing. There were no clear symp tom swhen these samp leswere collected. The result showed that 3 of 24 ap ri2
cot samp les, 6 of 37 p lum samp les were infected with Hop stun t viroid (HSVd). a5, a17, p6, p16 selected
from the 9 samp les were used for cloning and sequencing analysis. HSVd sequence variants obtained were
compared with HSVd reported in GenBank and showed 9910% - 9917% identity. There was no clear relativity
among sequence variants, region and host. These results suggest that sequence of HSVd is relatively con2
served.
Key words: Hop stun t viroid; Detection; Ap ricot; Plum
啤酒花矮化类病毒 (Hop stun t viroid, HSVd) 属于马铃薯纺锤形块茎类病毒科 , 1970年首次从日
本啤酒花上分离得到〔1〕, 寄主范围非常广泛 , 包括啤酒花、黄瓜、葡萄、柑橘、梨、桃、李、杏和
扁桃等〔2～4〕。该类病毒在某些寄主 , 如葡萄〔2, 5〕和杏〔3〕上呈潜伏侵染 , 而对某些寄主却会造成严重病
害 , 如啤酒花矮化〔2〕、李和桃果实斑驳〔6〕、柑橘矮化〔7, 8〕等。HSVd根据其序列特点被分成 5个类型 ,
即李类型、啤酒花类型、柑橘类型、李 —柑橘类型、李 —啤酒花 —柑橘类型 , 其中前三者为主要类
型 , 后二者是近几年才发现的 , 为次要类型〔2, 9〕。
HSVd在杏树上发生比较普遍 , 地中海地区平均带毒率为 34%〔10, 11〕, 西班牙东南部高达
81%〔10, 11〕, 土耳其西部 6616%〔12〕, 叙利亚 62%〔13〕, 黎巴嫩 28%〔14〕, 塞浦路斯 10% , 摩洛哥 10% ,
希腊 5%〔15〕。HSVd在杏树上虽呈潜伏侵染 , 但却可能成为另一种栽培植物的潜在危险 , 且有时和杏
树上的其它病毒混合侵染 , 加重病害的发生。从杏树上分离得到的序列大部分属于啤酒花类型或李—
柑橘类型〔16〕。
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园 　　艺 　　学 　　报 33卷
HSVd在李树上的发生首次在日本报道〔6〕, 症状主要表现为果实不着色或果皮上有绿色斑点 , 被
称为 “Dapp le fruit”, 此外 , 有些品种还表现有果肉不变红 , 成熟期延迟等症状。李树上 HSVd的带
毒率相对较低 , 阿尔巴尼亚 617% , 埃及 313% , 土耳其 1413%〔12〕。
中国该类病毒在杏、李上的发生情况尚未见报道。本试验旨在了解我国杏和李上 HSVd的发生情
况 , 并建立一些较完善的检测方法。此外 , 通过对该类病毒的序列分析 , 了解其序列变异与地域、寄
主等的相互关系。
1　材料与方法
111　材料
以黄瓜 (Cucum is sa tivus L. ‘Suyo’) 以及杏、李树的 1年生枝条为试材。Suyo黄瓜的种子由日
本弘前大学佐野辉男教授馈赠。枝条分别从内蒙古、黑龙江、河北等地采样 , 杏有 24个样品 , 李有
37个样品 (表 1)。表中属于同一品种的样品来自不同的果园或同一果园的不同植株。
表 1　杏和李供试材料的名称及采样地
Table 1　Sam pling places and var iety nam es of apr icot and plum in th is study
杏 Ap ricot
采样地
Location
采样数
Number of
samp les
编号
No.
品种
Variety
李 Plum
采样地
Location
采样数
Number of
samp les
编号
No.
品种
Variety
湖北 Hubei 1 a1 麦黄杏 Maihuangxing 内蒙古 InnerMongolia 14 p1 - p14 大紫李 Dazili
河北 Hebei 5 a2 菜籽黄 Caizihuang 湖北 Hubei 1 p15 未知 Unknown
a3, a4 金太阳 Sun Gold 河北 Hebei 5 p16 蓝宝石 Lanbaoshi
a5 凯特 Katy p17 甜李子 Tianlizi
a24 山杏 Shanxing p18 酸李子 Suanlizi
山东 Shandong 4 a6 意大利 2号 Italy 2 p19 未知 Unknown
a7 未知 Unknown p20 红宝石 Ruby
a8 开拓杏 Kaituoxing 山东 Shandong 2 p21, p22 黄李子 Huanglizi
a9 未知 Unknown 黑龙江 Heilongjiang 2 p23 牡丹江 1号 Mudanjiang 1
陕西 Shaanxi 11 a10 干挂梅杏 Ganguameixing p24 牡丹江 3号 Mudanjiang 3
a11 梅杏 Meixing 陕西 Shaanxi 12 p25 日本早红 Japan Zaohong
a12 短枝杏 Duanzhixing p26 奥李 14 Australia 14
a13 梅杏 Meixing p27 笨梅 Benmei
a14 曹杏 Caoxing p28 巴怒怒 Banunu
a15 鸡蛋杏 J idanxing p29 红宝石 Ruby
a16 突生杏 Tushengxing p30 秋姬 Q iuji
a17 梅杏 Meixing p31 奥李 14 Australia 14
a18 曹杏 Caoxing p32 安哥诺李 Angeleno
a19 李杏 L ixing p33 绿梅 Lümei
a20 未知 Unknown p34 金皇后 Queen Gold
黑龙江 3 a21 真杏 Zhenxing p35, p36 笨李 Benli
Heilongjiang a22 山杏 Shanxing 广西 Guangxi 1 p37 未知 Unknown
a23 2号杏 Xing 2
　　大肠杆菌 ( Escherichia coli ) DH5α, 2 ×Taq
PCR MasterM ix酶购自天根生化科技 (北京 ) 有限
公司 ; 载体 pGEMµ 2T, M2MLV反转录酶购自 Pro2
mega公司 ; RNasin购自宝生物工程 (大连 ) 有限
公司 ; D IG DNA Labeling and Detection Kit, D IG
Easy Hyb购自 Roche公司。参考 GenBank中 HSVd
的核苷酸序列 Y09349设计了 3条引物 (表 2)。引
物由上海生工生物工程技术有限公司合成。
表 2　RT2PCR检测 HSVd的引物序列
Table 2　Pr im ers sequence of HSVd for RT2PCR
引物
Primer
极性
Polarity
序列
Sequence
位置
Position
RT2R1 - 5pi2GCTGGATTCTGAGAAGAGTT23pi 106 - 87
PCR2R2 - 5pi2AACCCGGGGCTCCTTTCTCA23pi 84 - 67
PCR2F3 + 5pi2AACCCGGGGCAACTCTTCTC23pi 79 - 96
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　6期 杨元爱等 : 杏和李啤酒花矮化类病毒的检测与序列分析 　
112　方法
11211　低分子 RNA的提取 　参考 L i等的方法〔17〕。 - 20℃保存备用。
11212 　D IG2cDNA斑点杂交 　以含有 HSVd全长序列的重组质粒 pGEMµ 2T2HSVd为模板 , 在 50μL
的 PCR反应体系中含有 2 ×Taq PCR MasterM ix 25μL, D IG2112dUTP 2μL, 引物对 R2和 F3各 1μL
(20μmol/L) , 模板 3μL, 加 ddH2 O至 50μL。PCR反应程序为 94℃预变性 5 m in; 94℃变性 30 s,
53℃退火 30 s, 72℃延伸 30 s, 30个循环 ; 最后 72℃延伸 7 m in。得到的 PCR产物为所制备的探针。
然后将探针纯化 , 方法是用 215倍体积乙醇 , 1 /10体积 pH 512, 3 mol/L NaAC沉淀核酸 , 经 70%乙
醇洗涤、干燥后溶于 10μL ddH2 O 中 , - 20℃保存备用。
取 RNA提取液 017μL, 加 3倍体积的变性液 (甲酰胺 500μL, 甲醛 162μL, 10 ×MOPS 100
μL) , 65℃ 15 m in, 冰上 2 m in, 加等体积 20 ×SSC, 混匀 , 点膜 , 晾干后置 80℃烘箱中处理 2 h, 然
后进行杂交。42℃预杂交 3 h, 50℃杂交 16 h, 弃杂交液 , 用 2 ×SSC、011% SDS和 015 ×SSC、011%
SDS洗膜 , 各两次 , 每次 15 m in。1%封闭液封闭 30 m in, 加入 Anti2D IG2AP抗体 37℃反应 1 h, 然后
用洗涤缓冲液冲洗两次 , 每次 15 m in, 检测液平衡 5 m in, 最后将膜在显色液 (NBT/BC IP) 中避光显
色 3 h或直至出现明显结果为止。
11213　正反向聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Return2PAGE) 　参考 L i等的方法〔17〕, 采用 5%的丙烯酰胺凝
胶制板 , 电泳结束后取出凝胶进行银染色。
11214　生物学检测 　当黄瓜两片子叶完全展开时 , 取 RNA 提取液 5μL, 加 500μL 接种缓冲液
(100 mmol/L Tris2HCL, 10 mmol/L EDTA , pH 715)。先在叶片上倒一层金刚砂 , 然后用棉棒蘸取接
种液在叶片上来回涂 4～5次 , 约 10 m in后用水将叶片上的金刚砂冲掉。每个样品接种 4株 , 以不接
种的黄瓜为负对照。温室温度保持在 30℃以上 , 每隔两天调查 1次 , 记录发病情况。
11215　RT2PCR　在 20μL的 RT反应体系中 , 含有模板 3μL, M 2MLV 5 ×buffer 4μL, 215 mmol /L
dNTPs 4μL, RNasin 2 U /μL, R1引物 1μL (20μmol/L) , M 2MLV反转录酶 10 U /μL, 加 ddH2 O至
20μL, 混匀。室温放置 10 m in, 42℃ 1 h, 冰上冷却 2 m in, - 20℃保存备用。
在 50μL的 PCR反应体系中 , 含有 2 ×Taq PCR MasterM ix 25μL, 引物对 R2和 F3各 1μL (20
μmol/L) , 模板 3μL, 加 ddH2 O至 50μL, 混匀。PCR反应程序为 94℃预变性 5 m in; 94℃变性 30 s,
53℃退火 30 s, 72℃延伸 30 s, 30个循环 ; 最后 72℃延伸 7 m in。
11216　PCR产物的克隆及其序列分析 　将 PCR产物经低熔点琼脂糖凝胶电泳 , 于紫外灯下切割特异
性条带 , 装入 115 mL离心管中 , 加入 600μL ddH2 O , 70℃加热 10 m in, 胶融化后加入 600μL含有
1% CTAB的水饱和正丁醇 , 离心取上层 , 经 215 mol/L NH4 Ac、正丁醇抽提 , 最后经无水乙醇沉淀。
将回收后的 PCR产物与 pGEMµ 2T连接 , 连接产物转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞 , 提取质粒 , 酶切
鉴定 , 筛选重组质粒。序列测定由宝生物工程 (大连 ) 有限公司完成。
采用 DNAMAN Version 51212软件将所得分离物序列与 GenBank中已报道 HSVd序列进行比较。
2　结果与分析
211　D IG2cD NA斑点杂交
将 24个杏样品和 37个李样品的 RNA经变性处理后点于带正电荷的尼龙膜 (Hybond2N + Amer2
sham B iosciences) 上 , 点样量约为 50 mg鲜样质量 , 然后利用 D IG标记的 HSVd cDNA探针进行斑点
杂交。结果表明 : 杏有 3个样品 , 李有 6个样品带有 HSVd (图 1)。
212　正反向聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( Return2PAGE)
为了检测该类病毒的环状 RNA分子 , 从斑点杂交检测呈阳性的 9个样品中 , 每个省份选取 1个 ,
即 a5、a17、p6、p16进行 Return2PAGE检测 , 以无 HSVd的样品为负对照 , 以苹果上发生的苹果锈
果类病毒 (ASSVd)和锦紫苏上发生的锦紫苏类病毒 ( CBVd 21 )为对照 , 进行 5 %的聚丙烯酰胺凝
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图 1　利用 D IG标记的 HSVd cD NA探针斑点杂交检测杏、李中发生的 HSVd
所圈样品为选择进行 Return2PAGE、生物学检测和克隆测序分析。
F ig. 1　Ana lysis by dot2blot hybr id iza tion w ith a D IG2labelled cD NA probe spec if ic for HSVd in apr icot and plum
Circled samp les are those selected for Return2PAGE detection, biological indexing, cloning and sequencing analysis.
胶电泳 (图 2)。结果显示 : a17、p6、p16呈阳
性 , a5呈阴性 , 且无 HSVd的样品均呈阴性。
213　生物学检测
选取 a5、a17、p6、p16进行生物学接种 , 接
种 4周后指示植物开始陆续发病 , 6周后大多数
已发病 , 表现为新叶向后仰卷、皱缩、茎间缩短、
植株矮化 , 花瓣皱缩等症状 (图 3)。
214　RT2PCR
为了进一步研究该类病毒的序列变异情况 ,
利用所设计的引物 , 以斑点杂交检测呈阳性的样
图 2　利用 Return2PAGE检测杏、李中发生的 HSVd环状 RNA分子
1: a5; 2: a17; 3: 杏无 HSVd对照 ; 4: ASSVd对照 ; 5: CBVd
对照 ; 6: 李无 HSVd对照 ; 7: p6 ; 8: p16。
F ig. 2　D etection of HSVd c ircular RNA structure in apr icot
and plum by Return2PAGE
1: a5; 2: a17; 3: Apricot without HSVd control; 4: ASSVd standard;
5: CBVd standard; 6: Plum without HSVd control; 7: p6; 8: p16.
图 3　‘Suyo’黄瓜接种 6周后发病症状
F ig. 3　Severe sym ptom s on‘Suyo’cucum ber six weeks post inocula tion
品为模板进行 RT2PCR, 以无 HSVd的样品和水为
负对照 , 所得 PCR产物经 115%的琼脂糖凝胶电
泳分析 , 结果斑点杂交呈阳性的样品均出现一条
约 300 bp的特异条带 (图 4)。
215　序列测定及比较分析
选取 a5、a17、p6、p16进行克隆测序分析 ,
每个样品挑取 5个克隆进行测序 , 共 20个克隆。
测序结果 : 20条序列中有相同序列 , 共获得 13
条不同的序列。将这 13条序列与 GenBank中已报
道序列进行比较分析 (表 3) , 结果表明 : 序列同
图 4　杏、李中发生的 HSVd的 RT2PCR检测
1～3: a5, a13, a17; 4: 杏无 HSVd对照 ; 5: 水对照 ; M: DL 2 000;
6: 水对照 ; 7: 李无 HSVd对照 ; 8～13: p2, p6, p14, p16, p18, p19。
F ig. 4　D etection of HSVd by RT2PCR in apr icot and plum
1 - 3: a5, a13, a17; 4: Apricot without HSVd control; 5: Water control;
M: DL 2 000; 6: W ater control; 7: Plum without HSVd
control; 8 - 13: p2, p6, p14, p16, p18, p19.
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　6期 杨元爱等 : 杏和李啤酒花矮化类病毒的检测与序列分析 　
源性达 9910% ～9917% , 且序列变异与地域、寄主等无明显相关性。
表 3　所得 HSVd序列与 GenBank已报道 HSVd序列的分析比较
Table 3　Ana lysis of HSVd sequence var ian ts obta ined w ith HSVd reported in GenBank
树种
Stone fruit
省份
Province
品种
Variety
克隆号
Code of clone
克隆数
No. of clones
大小
Size ( nt)
最接近的序列
Closest HSVd variant
碱基变化 Nucleotide different
with closest sequence3
杏 Ap ricot 河北 Hebei 凯特 Katy a511 1 297 Y09345 G107 →A, A200 →G
a512 6 297 Y09345 G107 →A
a515 2 298 Y09345
-
102 →T, G107 →A
陕西 Shaanxi 梅杏 Meixing a1712 1 297 Y09345 T260 →C
a1713 2 297 AY425171 G107 →A
a1715 1 297 Y09345 C102 →G, G107 →A, C259 →T
李 Plum 内蒙古 大紫李 Dazili p611 1 297 AY425171 G111 →T
InnerMongolia p612 1 297 AY425171 G107 →A, G114 →A
p613 1 298 Y09345
-
97 →C, G107 →A
p615 1 297 AY425171 G49 →A, G107 →A, T238 →C
河北 Hebei 蓝宝石 Lanbaoshi p1611 1 298 Y09345
-
46 →A, G107 →A, T135 →C
p1612 1 297 Y09345 A110 →G
p1615 1 297 Y09345 T18 →C, G107 →A, A160 →G
　　3 107代表碱基位置 ; G代表 GenBank中 Y09345 107位的碱基 ; A代表所测序列 107位的碱基。3 107 stand for position of nucleotide; G stands for nucleotide of Y09345 in 107; A stands for nucleotide of sequence variants in 107.
3　讨论
本研究表明 HSVd在我国杏、李树上也有发生。作者于 2005年 9月从北京昌平区果树研究所采
取杏、李叶片各 6个品种 , 经检测各有 1个品种 (杏 ‘银白 ’, 李 ‘大石早生 ’) 带有该类病毒〔18〕,
杏 ‘银白 ’采样时叶片呈现有不规则分布的黄色斑点 , 叶边缘皱缩等症状。但该症状是否与 HSVd的
侵染有关还有待进一步研究。本文所述含有 HSVd全长序列的重组质粒 pGEMµ 2T2HSVd就是由此得
到的。此外 , 本研究所用样品为冬天采一年生枝条 , 采样时其树皮无明显症状表现。
类病毒 Return2PAGE检测虽灵敏度较低 , 但能检测类病毒的环状 RNA分子 , 且不需要知道其核
酸序列信息。斑点杂交灵敏度较高 , 忠实性高 , 操作简单 , 一次可对大量样品进行检测。RT2PCR,
虽灵敏度很高 , 但存在交叉污染导致的假阳性及假阴性等问题 , 实际应用中有时受到限制。生物学检
测比较灵敏 , 但需要一定空间和保温设备 , 试验周期较长 , 不适合对大批量样品进行检测。因此 , 在
具体的研究中 , 需根据具体情况将各种方法结合使用 , 对结果进行综合分析。本研究还发现 , a5经
Return2PAGE检测结果呈阴性 (图 2) , 但是从杂交信号来看 , 其含量应与 a17相近 (图 1) , 也可能
是样品 (枝条皮 ) 经反复冻融 , 组织被褐化而影响类病毒的提取。在第 2次提取时 , a5有较严重的
褐化现象。但褐化是否影响类病毒的提取以及影响的程度 , 还需在今后的试验中进行细致的观察和研
究。
测序结果表明 , HSVd序列变异较小 , 特别是中央保守区几乎没有变化 , 且不同地域 , 不同树种
之间有相同序列。这些说明 HSVd的序列变异与地域、寄主等无明显相关性。已有报道也显示 HSVd
序列相当保守 , 特别是中央保守区几乎没有变化。
从目前的检测结果分析 , 我国北京、河北、陕西、内蒙古等地的杏、李树上均感染有该类病毒。
但由于目前所采样品数量较少 , 采样地也较单一 , 因此对其详细的分布情况还需要通过今后扩大调查
区域范围 , 增加样品检测数量来进行进一步的分析。
参考文献 :
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