全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (5) : 1083～1086
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 11 - 16; 修回日期 : 2006 - 07 - 28
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (30060053, 30360066) ; 兵团科委项目 (NKB02SDXNK01SW ) ; 国家科技攻关计划引导
项目 (2003BA546C)
利用内标为基础的 RT2PCR技术检测葡萄茎痘伴
随病毒
牛建新 1, 2 　李西平 1 　赵　英 1 　张　强 1 　马兵钢 1, 2
(1 石河子大学农学院园艺系 , 新疆石河子 832003; 2 新疆兵团绿洲生态农业重点实验室 , 新疆石河子 832003)
摘 　要 : 选取经 RT2PCR检测确认带葡萄茎痘伴随病毒的 ‘全球红 ’葡萄品种。以葡萄叶片、韧皮部
作为试材 , 采用 SDS法提取高质量总 RNA作为模板 , 以 GRSPaV的特异互补引物引导 , 反转录合成 cDNA,
通过 PCR扩增 , 获得 830 bp的预期目的片段。以线粒体 nad5基因为内标 , 建立了 GRSPaV与 nad5共扩增
体系 , 将扩增的 GRSPaV特异性片段及 nad5目的片段分别克隆测序 , 与 NCB I中所提交的核酸序列进行比
对 , GRSPaV与序列号 AF057136的同源性达 96% ; nad5与序列号 D37958的同源性达 96167%。
关键词 : 葡萄茎痘伴随病毒 ; RT2PCR; nad5; 检测
中图分类号 : S 66311; S 436　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0521083204
Using RT2PCR A ssay to D etect G rapevine rupestris stem pitting assoc ia ted
virus Ba sed on In terna l Con trol
N iu J ianxin1, 2 , L i Xip ing1 , Zhao Ying1 , Zhang Q iang1 , and Ma B inggang1, 2
(1D epartm ent of Horticu lture, A gricultural College, Shihezi U niversity, Sh ihezi, X in jiang 832003, China; 2 Key L aboratory of
O asis Ecology A griculture of X injiang B ing tuan, Shihezi, X injiang 832003, China)
Abstract: This study p refer to establish a rap id, sensitive, accrual and p ractical detection system for
Grapevine rupestris stem pitting associa ted virus ( GRSPaV ) based on internal control. These grapevine varieties
such as‘Red Golbe’ that were detected to carry GRSPaV by RT2PCR were selected as testing material. U2
sing SDS method to extract high quality total RNA from grape leaves and phloem, which was temp late to syn2
thesize the cDNA by the guide of GRSPaV special antisense p rimer. After that, through PCR amp lification,
the 830 bp special fragmentwas gained. The co2amp lification system of GRSPaV and p lant m itochondrial nad5
as internal control was established. The use of internal control m inim izes the risk of obtaining false negative
RT2PCR results and avoids the need to elim inate contam inating DNA in extracts. The GRSPaV special frag2
ment and nad5 aim fragment were cloned and sequenced respectively. The sequenced results aligned with nu2
cleotide array in NCB I. The aligned results showed that GRSPaV has 96% sim ilarity with array code
AF057136 and nad5 has 96167% sim ilarity with array code D37958.
Key words: Grapevine rupestris stem pitting associa ted virus ( GRSPaV) ; RT2PCR; nad5; Detection
1　目的、材料与方法
葡萄茎痘伴随病毒 (Grapevine rupestris stem pitting associa ted virus, GRSPaV ) 是危害葡萄的主要病
毒病之一。目前国外已有 PCR检测 GRSPaV的报道〔1～3 〕, 但在葡萄上尚未见利用 nad5为内标的 RT2
PCR检测技术的报道。
试验材料为石河子大学农学院实验站和玛纳斯园艺场种植的经 RT2PCR检测确认带葡萄茎痘病毒
的 ‘全球红 ’等葡萄品种。以葡萄叶片和韧皮部作为试材 , 以韧皮部为材料时 , 取枝条 , 轻刮去除
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园 　　艺 　　学 　　报 33卷
表皮 , 剥落韧皮部。以无病毒实生苗为对照。核糖核酸酶抑制剂 (RNasin, 40 U·μL - 1 )、逆转录酶
AMV (10 U·μL - 1 , 5 ×buffer)、Taq DNA聚合酶 (5 U·μL - 1 , 10 ×buffer) 和 PCR Marker购于华
美工程公司 ; dNTPs ( each 10 mmol)、pBR322 DNA /A luⅠ Markers、水饱和酚、DEPC、 IPTG、聚乙
烯吡咯烷酮、X2Gal、限制性内切酶 PstⅠ、 T4 DNA 连接酶、Gel Extraction Kit UN IQ210、克隆载体
pUCm2T vector购自上海生工生物工程公司 ; DNA MarkersⅡ、Ⅵ购于北京天为时代生物科技有限公
司 ; 其余常规试剂均为国产分析纯。根据 NCB I中已发表的 GRSPasV序列 AF026278及 AF057136, 参
照文献 〔1〕设计合成引物 P1、P2 ; 根据序列 D37958, 参照文献 〔4〕合成引物 P3、P4 (表 1) , 由
上海生工生物工程公司合成。浓度为 20 pmol·L - 1 , 扩增片段大小 830 bp。大肠杆菌 DH5α为石河子
大学生物工程学院惠赠保存。
表 1　RT2PCR扩增特异引物
Table 1　D NA prim ers for RT2PCR am plif ica tion
引物对 Primer pairs 序列 (5pi→3pi) Sequence (5pi→3pi) 引物位置 Position of p rimer 目的片段 Target fragment( bp)
P1 ( sense) CAAGC ATGCT CTTGG CAAC 　653 - 670 830
P2 ( antisense) CCCTC TGGCG ATTGA ATTG 1 464 - 1 482
P3 ( sense) GATGC TTCTT GGGGC TTCTT GTT 　968 - 986, 1 835 - 1 838 181
P4 ( antisense) CTCCA GTCAC CAACA TTGGC ATAA 1 973 - 1 995
总 RNA的提取参考文献 〔5〕, 用 UV2755B型分光光度计测 260 nm和 280 nm的吸光值 , 确定
RNA的纯度和浓度。用 1 ×TAE, 110%琼脂糖凝胶电泳 , EB染色 , 8 V·cm - 1电泳 20 m in后 , 于紫
外检测仪上观察并照相记录。GRSPaV RT2PCR在美国的 B IO2RAD型 PCR仪上进行。反转录反应体系
包括模板 1μL , 反义引物 P2 ( 20 pmol·L - 1 ) 1μL, 反转录酶 5 ×buffer 5μL , RNasin ( 40 U·
μL - 1 ) 1μL, 反转录酶 AMV 25 U, dNTPs (10 mmol·L - 1 ) 215μL, 用 DEPC处理的 ddH2O补足体
积 25μL, 42℃水浴 60 m in, 92℃ 4 m in, - 20℃贮存备用。反转录结束后取 215μL进行 PCR反应 ,
反应体系中含 Taq酶 buffer (无 Mg2 + ) 2μL, MgCl2 115 mmol·L - 1 , dNTPs 012 mmol·L - 1 , P1 110
pmol·L - 1 , P2 110 pmol·L - 1 , Taq DNA聚合酶 215 U , 用 ddH2 O补足反应体积至 20μL进行扩增。
反应条件为 : 95℃预热 3 m in; 95℃ 45 s, 58℃ 45 s, 72℃ 60 s, 35个循环 ; 最后 72℃延伸 7 m in。
GRSPaV与内标 nad5共扩增体系的建立和优化 : 使用 1个高等植物线粒体中的 NADH脱氢酶亚
基 5基因 ( nad5) 做为反转录体系的内标系统。nad5基因中有 1个 848 bp的内含子。设计扩增 nad5
基因的上游引物跨过内含子 , 下游引物位于 3pi端外显子内。在反转录时 , 灭菌冰浴的 Eppenderf管中
依次加入模板 1μL , 015μg·μL - 1的 oligo dT (18) 1μL, 其它组成及反应条件与上述 GRSPaV反转
录相同。反转录结束后取 215μL进行 PCR反应 , 反应体系中除含 P3 015 pmol·L - 1 , P4 015 pmol·
L - 1外 , 其它组成及反应条件与 GRSPaV PCR反应相同。在上述反应体系的基础上 , 保持 GRSPaV引
物浓度不变 , 对内标引物浓度设置 8个处理 , 以协调二者的共扩增。
PCR产物的电泳分析 : 1 ×TAE电泳缓冲液 , 1%琼脂糖凝胶 ( EB 015μg·mL - 1 ) , 上样量 5
μL, 120 V稳压电泳至谱带完全分开 , 紫外灯观察电泳结果并照相记录。
目的片段的克隆测序 : 用 110%琼脂糖凝胶电泳将目的片段与其它非特异扩增片段尽可能分开
后 , 长波紫外灯下切取目的条带 , 用 UN IQ210 Gel Extraction Kit ( Sangon产品 ) 回收 DNA片段。操作
均按产品的使用说明进行。克隆载体采用上海生工公司的 pUCm 2T Vector System, 长 2 773 bp, 具有
Amp抗性 , 可用于蓝白斑筛选。参照 pUCm2T载体克隆试剂盒操作说明 , 用上述纯化后的目的片段和
pUCm2T克隆载体连接 , 然后转化大肠杆菌感受态细胞。经蓝白斑筛选 , 挑取白色菌落培养提取质
粒 , 通过酶切和 PCR鉴定阳性克隆。测序工作委托上海生工公司进行 , 所用测序仪器为 AB I PR ISM
377296, 测序试剂为 B igDye term inator v 210。测序采用的引物为 T7、M13通用测序引物。GRSPaV目
的片段采用双向测序 , 由两个测序反应完成 ; 内标 nad5采用单向测序。
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　5期 牛建新等 : 利用内标为基础的 RT2PCR技术检测葡萄茎痘伴随病毒 　
2　结果与分析
211　GRSPaV RT2PCR扩增结果
经过试验 , 建立了 GRSPaV RT2PCR 检测体
系 , 利用特异引物或 oligo dT进行 RT2PCR反应 ,
均可获得预期 (图 1) 的目的片段 830 bp。
212　内标 nad5基因与 GRSPaV共扩增体系的
建立
21211　内标 nad5扩增体系的建立 　不论是病样
还是健康样 , 只有在反转录酶存在的情况下才可
扩增 181 bp的目的片段 , 没有反转录的样品则不
会扩增 (图 2)。
图 1　GRSPaV总 RNA RT2PCR产物
M: 标准分子量 ; 1: RT2PCR产物 ; 2: 阴性对照。
F ig. 1　The RT2PCR products of GRSPaV in tota l RNA
M: Marker; 1: RT2PCR p roduct; 2: Negative control.
图 2　总 RNA的内标参照 RT2PCR分析
M: 分子量标准 ; 1: 健康样品 ; 2: 染病样品 ;
3: 对照 (没有反转录酶的样品 )。
F ig. 2　Agarose gel ana lysis of RT2PCR a ssays on the
in terna l con trol nad5 using tota l RNA extract
M: pBR322DNA /A luⅠ marker; 1: Health samp le; 2: Infected
disease samp le; 3: Control ( non2reverse transcrip tase samp le) . 图 3　nad5与 GRSPaV单独扩增电泳图M: 分子量标准 ; 1, 2: nad5的扩增 ; 4～6: GRSPaV的扩增 ; 3, 7: 对照 (无反转录酶 )。F ig. 3　Am plif ica tion electrophoretogram of nad5 andGRSPaV respectivelyM: pBR322DNA /A luⅠ marker; 1, 2: Amp lification of nad5;4 - 6: Amp lification of GRSPaV; 3, 7: Control( non2reverse transcrip tase samp le) .
21212　内标 nad5 与 GRSPaV 共扩增体系的建立与优化 　分别用病样和健康样携带 nad5 扩增
GRSPaV, 只有经过反转录的病样才能同时获得 nad5和 GRSPaV两条带 , 并与对应的单独扩增产物相
一致 (图 3, 图 4)。表明 nad5和 GRSPaV共同扩增的有效性。
图 4　nad5与 GRSPaV共扩增电泳图
M: 分子量标准 ; 1, 2: 阴性对照 ; 3～5: 染病样品。
F ig. 4　Co2am plif ica tion electrophoretogram of
nad5 and GRSPaV
M: pBR322DNA /A luⅠ marker; 1, 2: Negative control;
3 - 5: Infected samp le.
图 5　GRSPaV与 nad5共扩增体系的不同内标引
物浓度凝胶电泳图
M: 分子量标准 ; 1～8: 内标引物浓度 012、013、014、
015、016、017、018和 019 mmol·L - 1。
F ig. 5　Electrophoretogram of d ifferen t in terna l con trol
nad5 pr im er concen tra tion in GRSPaV and nad5
co2am plif ica tion system
M: pBR322DNA /A luⅠ marker; 1 - 8: nad5 p rimer concentration
012, 013, 014, 015, 016, 017, 018 and 019 mmol·L - 1.
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　　在已建立的内标 nad5与 GRSPaV共扩增体系的基础上 , 除改变引物浓度外 , 其它各反应成分浓
度不变 , GRSPaV引物浓度为 110 mmol·L - 1 , 内标引物浓度设置为 8个处理 (图 5)。结果表明 , 内
标与 GRSPaV之间存在竞争 , 而内标具有很强的竞争力。较为适宜的引物浓度组合为 GRSPaV引物
110 mmol·L - 1 , 内标引物 013 mmol·L - 1。
213　目的片段的克隆测序
测序对比分析结果表明 , GRSPaV与序列号 AF057136的同源性达 96% ; nad5与序列号 D37958
的同源性达 96167%。
nad5根据 D37958克隆。D37958分离自日本的苹果树 , 全长 3 318 bp, 包括一个编码 NADH脱
氢酶亚基 5的两个外显子 230 bp (758～987)、1 216 bp (1 836～3 051) , 两个外显子被 1个 848 bp
(988～1 835) 的内含子所分开。
本研究使用的上游引物长 23 bp, 其中 19 bp位于 exon a的 3pi末端 (968～986 bp ) , 其余 4 bp位
于 exon b的 5pi末端 (1 835～1 838 bp)。所克隆的片段跨越 intron区 , 由 exon a和 exon b相结合 , 目
的克隆片段长 181 bp。测序结果表明 , 来自葡萄的实际克隆片段长 181 bp, 与 D37958序列同源性达
96167%。
应用多重 PCR可进一步降低检测的成本及所需样品量。为了确保阴性对照的可靠及可行性 , 引
入内标可解决此问题。
曾有多种内标被报道 , 但是没有一种可区分 RNA与 DNA模板 , 因此在 RT2PCR前必须完全消除
DNA。一种可行的方法就是设计目的基因 , 由于内含子的存在而扩增不同大小目的片段的引物 , 但附
加的模板将会与病毒模板竞争 , 同时也增加了电泳辨别凝胶上带的复杂性。而 nad5的扩增是通过设
计一条引物跨越内含子 , 只有在目的基因剪切了内含子后 , 才可进行有效的退火和扩增 , 同时结合位
于邻近外显子的另一条引物 , 在严格扩增条件下 , 即使有基因组 DNA存在的情况下也可有效扩增
mRNA。nad5是高等植物线粒体中一种还原型 NADH辅酶 , 以此基因作为内标 , 可避免外加模板与
病毒模板的竞争 , 减少假阴性出现 , 省去必须消除模板中 DNA的污染 , 使检测的程序简化 , 费用降
低。
参考文献 :
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