全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2004 , 31 (5) : 589～592
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2003 - 10 - 14 ; 修回日期 : 2004 - 02 - 20
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (30070529) ; 高等学校博士学科点专项基金资助项目 (20030504014)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail : luozhr @mail1hzau1edu1cn)
‘罗田甜柿’胚乳培养获得十二倍体再生植株
陈绪中　罗正荣 3
(华中农业大学园艺林学学院 , 武汉 430070)
摘　要 : 取‘罗田甜柿’自然授粉后约 70 d 的胚乳 , 采用不同细胞分裂素和生长素组合进行离体培
养。结果表明 : 以 1/ 2MS (1/ 2N ) + ZT (玉米素) 111 mg/ L + 2042D 110 mg/ L + CH (水解酪蛋白) 1000
mg/ L 诱导产生的愈伤组织易获得再生植株 ; 形态学和细胞学检测确认再生植株中存在 2n = 12x = 180 的个
体。该十二倍体植株对中国原产甜柿的遗传改良可能具有潜在的应用价值。
关键词 : 柿 ; 甜柿 ; 胚乳培养 ; 多倍体 ; 十二倍体 ; 再生植株
中图分类号 : S 66512 　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2004) 0520589204
Dodecaploid Plantlets Regenerated from Endosperm Culture of ‘Luotiantian2
shi’Persimmon
Chen Xuzhong and Luo Zhengrong 3
( College of Horticulture and Forest ry , Huaz hong A gricultural U niversity , W uhan 430070 , China)
Abstract : Endosperms of‘Luotiantianshi’persimmon ( Diospyros kaki Thunb. ) were cultured with
after different auxin and cytokinin concentration combination open pollination 70 days. Results showed that
the 1/ 2MS (1/ 2N) medium contained 2042D 110 mg/ L + ZT 111 mg/ L + CH 1000 mg/ L was better for
inducing callus to f rom regenerated plantlets , Stomatal characteristics、flow cytometric analysis and chro2
mosome counting proved dodecaploid (2n = 12x = 180) presence in those regenerated plantlets. The regen2
erated dodecaploid plants could be used as parental material in breeding program.
Key words : Persimmon ; Nonastringent persimmon ; Endosperm culture ; Polyploid ; Dodecaploid ;
Regenerated plantlet
被子植物胚乳是双受精产物 , 属三倍体组织 , 因此胚乳培养可能获得无核新种质 , 对于以营养繁殖
为主的果树而言具有重要育种价值。通过胚乳培养 , 在很多种植物上已经获得了三倍体再生植株〔1〕。但
迄今在柿的胚乳培养中均未获得预期的九倍体〔2 ,3〕。本研究对中国原产甜柿种质‘罗田甜柿’ ( Diospyros
kaki Thunb. ‘Luotiantianshi’; 2n = 6x = 90) 进行了胚乳培养 , 意外地获得了十二倍体再生植株 , 该胚乳
植株在甜柿倍性育种中可能具有重要的应用价值 , 特将试验结果报道如下。
1 　材料与方法
‘罗田甜柿’果实采自湖北省京山县虎爪山国家森林公园。在自然授粉 70 d 后摘取直径约 3 cm
大小的幼果 , 当日带回实验室并立即剥取胚乳进行离体培养。
111 　愈伤组织诱导
自来水冲洗幼果后 , 用 70 %酒精浸泡 30 s , 置 011 %HgCl2中震荡 10 min , 无菌水洗涤 3～4 次。
在无菌条件下剔除果肉 , 彻底去除心形期幼胚。将胚乳 (此时为细胞型时期 , 呈乳白色、柔软) 横切成
小块后接种于预先制备的各培养基中 (表 1) 。培养基参照庄东红等〔2〕和 Tao 等〔3〕的配方 , 均采用 1/ 2
MS (1/ 2N) 附加 CH (水解酪蛋白) 1000 mg/ L 培养基。在恒温 26 ℃黑暗条件下诱导愈伤组织。
112 　植株再生
将胚乳愈伤组织转移至分化培养基 , 在恒温 26 ℃, 光照强度 3112～3910μmol·m - 2·s - 1下培养 ,
每 6 周继代 1 次。当分化出不定芽时 , 转入培养基 MS + 2042D 110 mg/ L + ZT (玉米素) 111 mg/ L ,
当新梢伸长达 2 cm 以上时 , 转入生根培养基 , 生根方法同前文〔4〕。
113 　再生植株倍性鉴定
取成熟叶片 , 置沸腾的 5 %NaOH 溶液中煮 1～2 min , 至叶片成透明状。水浴冷却至室温后 , 撕
取下表皮置载玻片上 , 吸干水滴 , 加 1～2 滴 015 %甲苯胺蓝染色 1～2 min。用蒸馏水轻轻洗涤并晾
干 , 在光学显微镜下进行形态学观察 , 用测微尺测量气孔孔径。
参照唐仙英等〔5〕方法进行染色体计数。取再生植株乳白色根尖 110～115 cm , 用 01002 mol/ L
8 - 羟基喹啉处理 6～7 h , 01075 mol/ L KCl 处理 015 h , 甲醇∶冰醋酸 (3∶1) 固定 10～24 h , 转入 70 %
乙醇 4 ℃保存。制片时蒸馏水洗涤 2～3 次 , 用 5 mol/ L HCl 室温解离 8 min , 4 %纤维素酶 + 1 %果胶
酶 + 01075 mol/ L KCl 混合液 37 ℃解离 50～60 min , 丙酸 —水合氯醛 —苏木精染色液染色 3～4 h 后
压片镜检 , Olympus BH22 型显微镜观察和照相并进行根尖染色体计数。
采用 PA 倍性分析仪 ( Ploidy Analyser2I , Partec) 测定叶片 DNA 相对含量〔6〕。以染色体数 2n =
90 的‘罗田甜柿’组培苗为对照。数据分析采用 Partec 公司的 DPAC 软件 (Data Pool Application of
Cytometre) 。
2 　结果与分析
211 　愈伤组织产生和芽形成
胚乳在黑暗条件下培养 20 d 后 , 在表面或切口处产生无色透明的瘤状突起 (愈伤组织) , 生长速
度慢 , 组织结构较松散。将其转移至分化培养基上经 2～3 次继代培养后 , 逐渐转变成绿色 , 且结构
致密 , 生长迅速。连续继代后 , 表面开始分化出不定芽。在培养过程中发现 , 细胞分裂素 ZT 诱导愈
伤组织的效果优于 BA , 后者效果不明显。同时 , 随着生长素 2042D 浓度增加 , 愈伤组织诱导率明显
上升 (表 1) , 但在有 BA 的培养基中 2042D 浓度升高至 210 mg/ L 时 , 也可诱导胚乳愈伤组织产生
(表 1) 。从试验中看出 , 添加 ZT 111 mg/ L + 2042D 210 mg/ L 的培养基 , 胚乳愈伤组织诱导率最高 ,
达 1416 % , 但没有获得再生植株 ; 由含BA 培养基诱导分化出的愈伤组织 , 继代后短时间内增殖 , 但
继代 2～3 次后逐渐褐化死亡 , 没有产生再生植株 ; ZT 111 mg/ L + 2042D 110 mg/ L 培养基获得的再
生植株最多 (表 1) 。
表 1 　植物生长调节剂对‘罗田甜柿’胚乳愈伤组织诱导及再生的影响
Table 1 　Effect of plant growth regulator on callus induction and plant regeneration from endosperm of‘Luotiantianshi’persimmon
细胞分裂素
Cytokinin (mg/ L)
ZT BA
生长素
Auxin (mg/ L)
2042D IAA 接种胚乳数No. ofendosperms 产生愈伤数No. of callus 再生苗数 No. of regenerated plantlets总数Tolal 六倍体Hexaploid 九倍体Nonaploid 十二倍体Dodecaploid
111 — — 1175 72 2 8 5 0 3 (2n = 180)
111 — 015 — 51 2 10 6 0 4 (2n = 180)
111 — 110 — 49 3 15 7 0 8 (2n = 180)
111 — 210 — 48 7 0 — —
— 015 015 — 52 0 — — —
— 015 110 — 47 0 — — —
— 015 210 — 51 3 0 — —
注 :基本培养基为 1/ 2 MS + 水解酪蛋白 1000 mg/ L 。　　Note : The medium was 1/ 2MS + Casein hydrolysate 1000 mg/ L .
212 　再生胚乳植株倍性鉴定
21211 　形态学鉴定 　从外观上看 , 高倍性植株叶片大、厚、颜色深 , 叶面粗糙 , 脉纹加深 , 叶脆且
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易折断 , 植株明显矮化 (图 1 , A、B) 。同时其叶
片气孔增大 , 密度降低 (表 2 , 图 1 , C、D) 。低
倍性植株则相反 , 表现出叶片较薄、平整、色浅
且具有一定韧性。
21212 　染色体数目检测 　根尖染色体检查结果表
明 , 全部再生植株的染色体数目为 2n = 12x = 180
或 2n = 6x = 90 (图 1 , E、F) , 没有出现预期的
九倍体 (2n = 9x = 135) 和其他非整倍体。
表 2 　‘罗田甜柿’变异植株与正常植株气孔密度和大小比较
Table 2 　Comparison of density and size of stoma between mutated
and normal plant in‘Luotiantianshi’persimmon
植株类型
Plantlet type
密度
Density (/ mm2)
长度
Length (μm)
宽度
Width (μm)
六倍体
Hexaploid
217173
　
29155 ±5163
　
27106 ±6154
　
十二倍体
Dodecaploid
108100
　
44113 ±3174
　
31164 ±2168
　
21213 　DNA 相对含量 　通过 PA 倍性分析仪检测再生植株叶片 DNA 含量 , 结果表明再生植株 DNA
相对含量的分布分别对应于六倍体和十二倍体植株 , 没有出现中间的九倍体植株类型。
图 1 　罗田甜柿胚乳再生植株十二倍体与六倍体比较
A : 十二倍体再生植株 , B : 六倍体再生植株 , C : 十二倍体植株叶片气孔 ( ×100) , D : 六倍体植株叶片气孔 ( ×100) ,
E : 十二倍体植株根尖染色体 ( ×800) , F : 六倍体植株根尖染色体 ( ×800) 。
Fig. 1 　Comparison of regenerated plantlets between dodecaploid and hexaploid induced from endosperm of‘Luotiantianshi’persimmon
A : Regenerated plantlet of dodecaploidy , B : Regenerated plantlet of hexaploidy , C : Stoma of leave from induced dodecaploidy
plantlet ( ×100) , D : Stoma of leave from induced hexaploidy plantlet ( ×100) , E : The chromosomes of root2tip from
induced dodecaploidy plantlet ( ×800) , F : The chromosomes of root2tip from induced hexaploidy plantlet ( ×800) .
3 　讨论
植物生长调节剂对胚乳植株再生起着关键性作用〔7～9〕。本试验结果表明 , ZT 诱导甜柿胚乳产生
愈伤组织的效果明显优于 BA ; 同时 , 提高培养基中 2042D 浓度也有利于愈伤组织的产生 , 说明在柿
胚乳愈伤组织诱导过程中添加一定量的 2042D 是必需的 , 但高浓度 2042D (210 mg/ L) 可诱导愈伤组
织产生但没有获得再生植株 , 其原因还不清楚。
在试验过程中 , 我们采取完全排除胚细胞的操作 , 所获得的十二倍体 (2n = 12x = 180) 由胚细
胞发育而来的可能性极小。庄东红等〔2〕曾检测柿胚乳细胞为九倍体 (2n = 9x = 135) , 本试验中通过
胚乳培养获得十二倍体再生植株是预料之外的结果 , 可能说明胚乳愈伤组织及再生植株的染色体数常
常发生变化〔10 ,11〕。此外 , 通过气孔密度和根尖染色体数目检测结果说明其 L I 层和 L III 层染色体均
发生倍性变化 ; 流式细胞仪检测叶片 DNA 含量的结果也显示 , L II 层细胞和 L I、L III 两层细胞染色
体倍性一致。综合断定本试验获得的胚乳再生植株为染色体加倍的同质十二倍体 , 这是通过中国原产
195　5 期 陈绪中等 :‘罗田甜柿’胚乳培养获得十二倍体再生植株 　
甜柿胚乳培养获得同质十二倍体再生植株的首次报道。利用该十二倍体与六倍体进行杂交 , 有望培育
出无核的九倍体甜柿新种质 , 因此在中国甜柿倍性育种中具有潜在的应用价值。
参考文献 :
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