全 文 ：园 艺 学 报 2003，30(3)：341～342
Acts Hoaiculturae Siniea
雪花莲外源凝集素基因在大 白菜中的表达和抗蚜性
遗传分析
杨广东 朱 祯2 李燕娥 朱祝军 上官晓霞 吴 霞
( 山西农业科学院棉花研究所，运城 044000； 中国科学院遗传所，北京 100101； 浙江大学园艺系，杭州 310029)
摘 要：通过农杆菌介导法将雪花莲外源凝集素基因 (gna)导入了大白菜自交系 282。分子检测和抗
虫试验表明gna基因已整合进大白菜基因组，转基因植株较非转化对照植株有一定的抗蚜虫能力，抗虫性
好的植株可以检测到较强的 gna基因转录产物；后代遗传分析表明外源基因在转基因大白菜植株282—3和
282—9的 Tl代呈 3：1的孟德尔分离比例。
关键词 ：大白菜；外源凝集素基因 gna；表达 ；遗传；抗蚜性
中图分类号：S 634．1 文献标识码 ：A 文章编号 ：0513—353X (2003)03-0341—02
1 目的、材料与方法
雪花莲外源凝集素对刺吸式ISl器同翅目害虫，如蚜虫 、褐飞虱等具有明显的抑制作用。朱玉等u J
分离和克隆了雪花莲外源凝集素基因 (gna)，获得的转化植株对蚜虫均表现了一定抗性。本试验用
gna基因转化大白菜，以期获得抗蚜植株 ，并对外源基因在大白菜中的表达和遗传进行分析。
供试大白菜品系为自交不亲和系 282，转化质粒 pBinGNA含有由花椰菜花叶病毒启动子 (CaMV
35S)驱动的 gna基因，新霉素磷酸转移酶基因 (nptI)作为筛选标记基因。以 3日苗龄的大白菜无
菌苗带柄子叶 (柄长 1 mln)为外植体，工程菌液的制备及转化方法参见文献 [2]。
转化植株的 PCR、Southem blot和 Northem dot blot分析参照 Sambrook等【3J的方法进行。引物 1：
5，CAAAA 目 AAGGCAAG3，；引物 2：3ACTGCCGTITCArITACTGGC5’是根据 gna序列由上海生物工程
公司合成。杂交所用探针来 自BamHI／KpnI酶切质粒 pBinGNA回收约40O bp的 gna基因片段。
对 PCR阳性的转基因植株进行室内抗蚜鉴定，在直径 9 cm的培养皿中放置两层滤纸，无菌水浸
湿后置适量新鲜叶片，以非转化植株叶片为对照，每皿内放置 3只 1～2龄的菜蚜，重复 3次，在
25～280(]和湿度 85％下培养。每 5 d调查 1次蚜虫总数，连续观察 20 d，计算蚜虫抑制率 [(对照平均
感蚜总数 一样品平均感蚜总数)／对照平均感蚜总数X 100％]。在温室和田间观察转基因植株的抗蚜性。
选择抗虫性好的单株 282—3和 282—9在花期套袋自交，得到 Tl代种子并播种在网室，当第 4片真
叶完全展开后，在其叶面滴 1滴 100 mg／L的卡那霉素，重复3次，5 d后根据颜色变化结合PCR方法
分析外源基因在 Tl代的分离和遗传情况。同时当 Tl代植株长至六叶一心时，分别从里往外数取第 3
片叶进行室内抗蚜鉴定，方法同上，最后统计 Tl代植株的蚜虫抑制率和 gna基因的遗传分离情况。
2 结果与分析
通过 3次转化实验，从 600个外植体 (带柄子叶)中得到 l1个卡那霉素抗性植株。PCR扩增结
果表明 11株中有 7个植株扩增出了预期的目的片段 ，而未转化植株没有此条带。对这 7个 PCR阳性
的抗性植株进行 Southem blot杂交分析 (见插页 1图版，A)，所有植株都出现了 DNA杂交带。因此可
见，经卡那霉素抗性筛选、PCR和 Southem blot检测均为阳性的植株是转基因植株。
收稿日期：20o2一io一07；修回日期：2oo3一Ol一03
基金项目：国家自然科学基金项目 (39770440)；山西省农业科学院基金项 目
维普资讯 http://www.cqvip.com
园 艺 学 报 30卷
抗蚜性试验表明，与对照相比，转基因植株表现出明显的对蚜虫生长的抑制作用，平均能抑制蚜虫
密度达2o％，而非转化对照为0；但单株之间差异很大，比如转基因植株 282．3和282．9的蚜虫抑制率可
分别达到 35％和29％，而 282．7仅 7％左右。转基因植株在田间生长时正值蚜虫发生旺期 (2001年 5～6
月)，比相邻的非转基因植株表现出了较强的抗虫性 (插页 1图版，C)。对 7个转基因植株中gna基因的
转录情况进行 Northern dot blot杂交分析 (插页 1图版，B)，结果表明抗蚜性好的转基因植株如 282．3、
282-9出现了较强的杂交信号，而抗虫性较弱的282-4、282．7等杂交信号很弱或几乎没有信号，这预示转
基因失活可能发生在基因转录时期。同一自交系的不同植株尽管基因型相同，但抗虫性差异很大，可见
外源基因在转基因植株中的表达调控是一个十分复杂的问题，有待于深人研究。
选抗虫的 282．3和 282．9两个植株在花期套袋 自交，得到了 TI代种子。室外卡那霉素筛选结合
PCR分析表明，转基因植株 TJ代中外源基因发生3：1分离，经 适合性检测表明 (表 1)符合孟德
尔分离比例。推断两个转基因植株中目的基因 gna和卡那霉素抗性筛选基因nptI为共整合，且插入
位点相同，并能稳定地遗传给后代。
表 1 转 gna基因大白菜 Tl代植株中外源基因的遗传分析
Table1 Inheritance analysis offoreign geneintransgmicTIChinese cabbageplants
注：碡惦=3．841，*表示 测验符合3：1分离比例。Note：碡∞=3．841，*Representthat test accord with 3：1 segregationmtio
对转基因的282．3和 282．9的Tl代植株抗蚜性试验表明，不同植株之间抗蚜能力差异很大，大部
分植株的蚜虫抑制率在 20％ ～30％之间，23％～27％的植株几乎没有抗蚜性，蚜虫抑制率低于 10％，
若以蚜虫抑制率低 10％者为不抗蚜植株，高于 10％者为抗蚜植株 ，那么经过卡方 ( )适合性检测
表明，Tl代植株中抗与不抗的分离比例符合 3：1的孟德尔分离规律，这同前面的卡那霉素检测和 PeR
分析结果相符合。
参考文献：
l 朱 玉，吴 茜，高越峰 ，等．雪花莲外源凝集素基因的克隆，序列分析和植物表达载体的构建 ．农业生物技术学报，1997，5
(4)：331～338
2 杨广东，李燕娥，上官晓霞．大白菜遗传转化体系优化的研究．见：奥岩松 ，秦智传主编．园艺学进展 (第四辑)．哈尔滨 ：哈尔
滨工程大学出版社，2000．31)0～304
3 sa玎止lm0k J，Fritseh E F，l~niatis T．Molecular cloning：A l~omtory manual，2nd ed．New York：Cold Spring}Iarb0|lr Lal~mtory Press，
1989．362～490
F~ression and Inheritance of Snowdrop Leetm Gene(g凇 )il Cl~ese Cab-
Yang C4mngdongI，Zhu Zhen2
， Li Yan’e ，Zhu Zhujun3，Shangguan Xiaoxia ，and Wu Xia
( 船 Institute， Academy ofAgric~urol&ien~ ， 咖 04400O，China； Institute of Genetics，Chinese
Academy 踯 ， 100101，China； 舶 础 眦 ， ， 叽g “310029，Ch／na)
Abstract：Molecular test and insect bi~ssays with aphid(Mrzus pers／cae$ulzer)larvae verifed that gna
gene had been integrated into Chinese cabbage genome mediated by Agrobacterium tumefaciem ，and al 7 transgenic
plants were aphid resistant，strong mRNA of gna could be detected in transgenic p]ants’vitl1 higher insect resis-
tmlce． I1le results of inheritance analysis showed foreign gene in 2 transgenic Chinese e~bage p]ants 282—3 and
282—9 is in the model of the simple Mendel’S fashion in their TI progenies．
Key words：Chinese cabbage； gna；Expression； Inheritance； Aphid resistance
维普资讯 http://www.cqvip.com
杨广东等：雪花莲外源凝集素基因在大 白菜中的表达和抗蚜性遗传分析
Yang Guangdong，et a1．Expression and Inheritance of Snowdrop Lectin Gene(gna)in Chinese Cabbage
A
484bP_—’
B
a
b
C
2 3 4 5 6 7 8 9
·◆· 誊◆
2 3 4 5 6 7 8
●
●
0
— 18sRNA
插页1
图版说明：A．转化植株的Southern blot分析 (1．阳性
对照，SalI酶切pBinGNA；2．阴性对照，SalI酶切
非转化植株基因组DNA；3～9．Sal I酶切转基因植
株基因组DNA)； B．转基因植株Northern dot blot杂
交分析 (1．非转基因植株RNA；2～8．转基因植株
RNA；a．以gna基因片段为探针的杂交结果；b．以
l 8sRNA基因为探针的杂交结果)； C．田问自然抗
蚜性观察 (左为抗性植株 ，右为对照)。
Explanation of plates：A．Southern blot analysis on
transformed plants r 1．pBinGNA digested with Sal I as
positive control；2．Nontransformed plants as negative
control；3-9．Transgenic plants)；B．Northern dot blot
of transgenic Chinese cabbage plants f 1．RNA of non—
transform ants：2-8．RNA of transgenic plants；a．result
of gna used as probe：b．Result of l 8sRNA used probe)：
C．Survey on insect aphid resistant in the field，trans—
genic plant(1eft)and nontransform ed plant(right)．
姜长阳等：蕨菜愈伤组织高效再生体系的建立
Jiang Changyang，et a1．A High Eficient Plant Regeneration System from Calus of Pteridium apuilinum
图版说明：A．在1／2MS／~养基上诱导芽分化；B．在生根培养基上形成的根茎；C．根茎上长出叶片。
Explanation of plates：A．Shoot diferentiation on medium of 1／2MS；B
．Rhizome form ation on rooting medium；C．Leaves on rhizomes
、
维普资讯 http://www.cqvip.com