全 文 ：园 艺 学 报 2003，30(3)：343～345
Aeta Horticulturae Sinica
蕨菜愈伤组织高效再生体系的建立
姜长阳 宁淑香 于 淼 王 宇 宋立秀
(辽宁师范大学生命科学学院，大连 116029)
摘 要：报告了蕨菜不同外植体在含有不同激素的培养基上诱导 、分化及生根情况，建立起高效再生
体系。诱导愈伤组织的最适培养基为 1／2 MS+BA 0．2 mg／L+IBA 0．4 mg／L+NH4H2PO4 200 mg／L；诱导愈伤
组织芽分化的最适培养基为 1／2 MS，芽分化率为 100％；不定苗在 1／2 MS+LM 0．2 mg／L培养基上生根率
为 100％，同时可以形成健壮根茎；具有根茎的试管苗移栽成活率达 94％。
关键词：蕨菜；组织培养；植株再生
中图分类号：S 647 文献标识码 ：A 文章编号：0513—353X (2003)03—0343—03
1 目的、材料与方法
蕨菜 [Pter／dium aqu／imun(L．)Kuhn．]具有重要的经济价值。目前，已有关于蕨类植物组织培
养的报告【l ]，但未见愈伤组织诱导及分化的报道。作者以采 自大连旅顺山地的蕨菜根茎生长点 、叶
柄、叶片为试材进行离体培养 ，以期建立蕨菜愈伤组织的高效再生体系。将采集的试材用清水冲洗
15 min，剪成约 5 cm的小段装到500 mL磨口广口瓶中，先用 0．05％的安利洗涤液振荡洗涤 3次，再
用无菌水洗涤 2次，将材料移至超净工作台上，在无菌条件下用 70％乙醇灭菌 30 s后，加入无菌水
冲洗 1次，再倒入0．05％的HgCI2溶液振荡灭菌 10 min，最后用无菌水振荡洗涤4—5次。基本培养基
为 1／2 MS，琼脂 6 g／L，pH 5．8，诱导培养基含蔗糖 3O g／L，生根培养基含蔗糖 15 g／L，光照强度
2 000—3 000 lx、光照时间 1O一13 h／d，培养温度 16—26℃。
2 结果分析与讨论
2．1 愈伤组织的诱导
将无菌材料剪成约0．5 cm切段后 ，接种到附加 NH4H2PO4 200 mg／L、不同激素不同浓度的 1／2 MS
培养基中进行愈伤组织的诱导。接种 20 d左右，部分培养基上的外植体开始形成愈伤组织，初始为
直径约 1 mil、黄绿色颗粒状 ，随后逐渐长成鲜绿色较大颗粒状。由于培养基激素组合与浓度配比不
同，对根茎生长点愈伤组织的诱导效果有较大差异。
由表 1可见，培养基中单独使用 BA 0．2 mg／L或 0．5 mg／L，不能诱导根茎生长点形成愈伤组织。
用浓度为0．2 mg／L或 0．8 mg／L的IBA、 、NAA、2，4．D，以及浓度为0．4 mg／L的 、NAA、2，4．
D，与上述浓度的 BA配合使用，有的不能诱导出愈伤组织，有的虽能诱导出愈伤组织 ，但诱导率低，
生长差。当 IBA 0．4 mg／L与 BA 0．2 mg／L配合使用时，根茎生长点愈伤组织诱导率为 56％，并且长
势良好。这说明，诱导蕨菜根茎生长点愈伤组织的最适培养基是 1／2 MS+BA 0．2 mg／L+IBA 0．4 me,／
L+NH4H2PO4 200 mg／L。在该培养基上再分别以根茎生长点、叶片和叶柄为外植体进行愈伤组织的诱
导，诱导率分别为 59．5％、24．6％和 26．7％。这说明蕨菜孢子体的不同器官都能诱导形成愈伤组织，
但以根茎生长点为外植体愈伤组织诱导率高。
2．2 愈伤组织的分化
把在上述培养基中形成的愈伤组织在同一培养基上进行继代培养 ，愈伤组织迅速增殖，20 d可增
收稿日期：2002—10—31；修回日期：2003—02—11
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园 艺 学 报 30卷
殖 15～20倍。增殖后的愈伤组织由许多 0．1～0．3 cm、外观质地光滑疏松、颜色嫩绿的颗粒组成。
将这种愈伤组织接种到附加不同激素的 1／2 MS培养基上，进行芽分化培养，20 d后可见 (表
2)，不同激素及不同浓度对芽分化影响很太。单独添加 队 0．5 mg／L，芽不分化；单独添加 zT
0．5 mg／L，芽分化率为 98．6％。分别单独添加 0．2 mg／L的 、IBA、NAA和 2，4．D时，愈伤组织均
有芽分化，其中添加 的，芽分化率达 95．9％；分别单独添加 0．6 mg／L的 、IBA、NAA和 2，4．
D时，芽分化率分别为0、4．3％、0、0，这说明高浓度的生长素有抑制分化作用。相反，在不加任何
激素的 1／2 MS培养基上芽分化率达 100％ (插页 1图版，A)。由此说明，在 1／2 Ms+BA 0．2 mg／L+
IBA 0．4 mg／L+NH4H2PO4 200 mg／L培养基上诱导的愈伤组织具有分化能力，并且分化率高于添加激
素的培养基。所以，1／2 MS是蕨菜愈伤组织分化的最佳培养基。
表 1 不同激素浓度对蕨菜根茎生长点愈伤组织诱导的影响
Table 1 C日lI璐 iatuetion of Pter／d／tan aquaou,m witlI V~iOUS eonceatrations ofhormones from rllizome growlng point
BA ZT 2．4-D N从 I从 IBA
愈伤组织颗粒数
Number ofcam
分化芽的颗粒数 芽分化率
Number of calli Frequency of shoot
producing shoots formation (％)
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3期 姜长阳等：蕨菜愈伤组织高效再生体系的建立 345
统计表明，在 150 mL锥形瓶中分化培养 20 d后，平均每瓶可分化出 1 228片幼叶，分化出的幼
叶密被在培养基表面，幼叶生长 l0～20 d可伸长 0．5—1 cm，颜色嫩绿，并随着培养时间的延长而继
续生长，最后几乎占满瓶内全部空间。试验还表明，继代培养 l8代的根茎生长点、叶柄和叶片愈伤
组织 ，不仅形态特征没有变化，而且在 1／2 MS培养基上的分化率也仍为 100％。就愈伤组织的芽分化
而言，附加不同浓度激素的所有组合均不如 1／2 MS的效果好。其原因可能是外植体经过一段时间的
诱导和增殖培养，愈伤组织所含的激素水平已可满足自身芽分化的需要，这时再补加外源激素，就会使
体内的激素含量超出诱导芽分化的最适值，反而抑制分化。杜克久等【4j也有相关的报道。试验还证明，
虽然叶柄、叶片的愈伤组织诱导率低于根茎生长点，但其愈伤组织在 1／2 MS上的分化率却为 100％。
2．3 生根与移栽
将分化培养基诱导的高为 0．5 cm以上叶片的愈伤组织块 ，切成具 2～4个叶片的小块 ，转移到附
加不同浓度的 、IBA、NAA和 2，4．D的 1／2 MS培养基上进行生根培养。20 d后统计表明，当这 4
种生长素的浓度为0．2 m#L时，均能获得较高的生根率。其中 的效果最好，生根率达 100％，并
且平均根数与根长也较为理想。这说明 1／2 MS+ 0．2 L是蕨菜组培苗的适宜生根培养基。在
该培养基上诱导的根，属于不定根，呈白色，长为 0．5～2 cm。随着培养时间的延长，根逐渐伸长，
颜色变黄。
在 1／2 MS+ 0．2 m#L培养基中形成不定根后 ，伴随着上部叶片的旺盛生长，培养基下部逐
渐形成直径约 0．3 cm的根茎，起初为白色，逐渐变为浅黄色，30 d时根茎可长至 7～15 cm (插页 1
图版，B)。根茎形成以后，培养基中的营养迅速消耗，此时若补充相同成分的液体培养基，根茎上
就会萌发出新叶，并且萌发能力极强。长度为 1．2 cm的根茎上发出的叶片数多达 l2片 (插页 1图
版，C)。由根茎上生出的叶片与由愈伤组织分化出的叶片相比，前者叶柄粗 ，叶片大，生长旺盛。
对生长旺盛的试管苗，打开瓶塞炼苗 2 d，移栽到下层为肥沃园土，上层为 5 cm厚炉渣的基质
中，l5 20 d逐渐长成健壮的植株 ，带有根茎的试管苗移栽成活率为94％。移栽成活的试管苗与非试
管苗相比，生长旺盛，根茎及根系发达。在大连地区，5月移栽到田间的试管苗，当年可形成孢子囊。
参考文献：
l 李华赐，陈志红．鹿角蕨的组织培养 ．植物生理学通讯 ，1988，(2)：59
2 黄韶玲 ，张洁莲．鹿角蕨的组织培养．植物生理学通讯 ，1993，(1)：46
3 李文安 ，王玉琴．狼尾蕨的离体培养．植物生理学通讯 ，1990，(3)：44
4 杜克久，郑均宝，徐振华 ．741杨器官、体细胞胚胎发生的细胞组织学及生理学的研究 ．林业科学，1998，34(6)：99～104
A High Eficient Plant Regeneration System from Calus of Pteridium apuilinum
Jiang Chal ang，Ning Shuxiang，Yu Miao，Wang Yu，and Song I．flXiU
( 如 of Science， 咖 Normal Uni~rsity，Ddian 116029，China)
AhsWaet： Induction。diferentiation an d rooting of diferent explants of Pt．r／dium apuilimun were described
on diferent medium in which contained diferent hormones and a high egicient plant regeneration system was
established．The result showed that the most suitable mediumWas 1／2 MS+0．2 ne／L BA+0．4 ne／L IBA+20o
mg／L NH4H2P04： the induced frequency of bud from callus was 100％ on medium in contained 1／2 MS； rI11e
radiation rate of adventitous seedling Was 100％ on medium 1／2 MS+0．2 m#L nA．simultaneously vigorous
rhizome Was formed and the survival rate of transplan tation of test．tube seedling could reach a hi【sh level at 94％ ．
Key words：Pter／d／um aq,ali,uo,~(L．)Kuhn．；Tissue culture；Plant regeneration
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杨广东等：雪花莲外源凝集素基因在大 白菜中的表达和抗蚜性遗传分析
Yang Guangdong，et a1．Expression and Inheritance of Snowdrop Lectin Gene(gna)in Chinese Cabbage
A
484bP_—’
B
a
b
C
2 3 4 5 6 7 8 9
·◆· 誊◆
2 3 4 5 6 7 8
●
●
0
— 18sRNA
插页1
图版说明：A．转化植株的Southern blot分析 (1．阳性
对照，SalI酶切pBinGNA；2．阴性对照，SalI酶切
非转化植株基因组DNA；3～9．Sal I酶切转基因植
株基因组DNA)； B．转基因植株Northern dot blot杂
交分析 (1．非转基因植株RNA；2～8．转基因植株
RNA；a．以gna基因片段为探针的杂交结果；b．以
l 8sRNA基因为探针的杂交结果)； C．田问自然抗
蚜性观察 (左为抗性植株 ，右为对照)。
Explanation of plates：A．Southern blot analysis on
transformed plants r 1．pBinGNA digested with Sal I as
positive control；2．Nontransformed plants as negative
control；3-9．Transgenic plants)；B．Northern dot blot
of transgenic Chinese cabbage plants f 1．RNA of non—
transform ants：2-8．RNA of transgenic plants；a．result
of gna used as probe：b．Result of l 8sRNA used probe)：
C．Survey on insect aphid resistant in the field，trans—
genic plant(1eft)and nontransform ed plant(right)．
姜长阳等：蕨菜愈伤组织高效再生体系的建立
Jiang Changyang，et a1．A High Eficient Plant Regeneration System from Calus of Pteridium apuilinum
图版说明：A．在1／2MS／~养基上诱导芽分化；B．在生根培养基上形成的根茎；C．根茎上长出叶片。
Explanation of plates：A．Shoot diferentiation on medium of 1／2MS；B
．Rhizome form ation on rooting medium；C．Leaves on rhizomes
、
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