全 文 ：园 艺 学 报 2005, 32 (2) : 284～287
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 07 - 14; 修回日期 : 2004 - 11 - 01
基金项目 : 云南省科技攻关项目 (2004NG08)3 通讯作者 Author for correspondence
应用多重 RT2PCR检测百合无症病毒和百合斑驳
病毒
王继华 1 王丽花 1 丁元明 2 瞿素萍 1 熊 丽 1 唐开学 13
(1 云南省农业科学院农业部花卉产品质检中心 , 昆明 650205; 2 云南出入境检验检疫局 , 昆明 650228)
摘 要 : 根据病毒外壳蛋白基因序列 , 设计了 2对检测百合无症病毒 (LSV )、百合斑驳病毒 (LMoV )
的引物 , 对扩增条件进行优化 , 建立了同时检测 LSV和 LMoV的多重 RT2PCR检测方法。此方法可特异地从
带有 LSV和 LMoV的样品中扩增出 2条带 LSV (876 bp)、LMoV (662 bp)。灵敏性测定结果表明 , 该双重
PCR可从稀释 104 组织中检测出病毒 , 具有与单一 PCR相同的灵敏性。扩增产物测序表明 , LSV扩增产物与
其它分离物核苷酸同源性为 8718%～9913% , LMoV扩增产物与其它分离物的同源性为 9011%～9915%。
关键词 : 多重 PCR; 检测 ; 百合无症病毒 ; 百合斑驳病毒
中图分类号 : S 68212 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2005) 0220284204
D etection of L ily sym ptom less virus and L ily m ottle virus by M ultiplex RT2PCR
W ang J ihua1 , W ang L ihua1 , D ing Yuanm ing2 , Qu Sup ing1 , Xiong L i1 , and Tang Kaixue13
(1 Yunnan A griculture A cadem y, Supervision and Testing Centre for Flow er of A gricu lture M in istry, Kunm ing 650205, China;
2 Yunnan Entry2ex it Inspection & Q uarantine B ureau, Kunm ing 650228, Ch ina)
Abstract: Two sets of specific p rimers were designed according to LSV and LM oV CP gene sequence,
and the conditions for PCR were op tim ized. The multip lex PCR method which can simultaneously detect the
two lily viruses was developed. It was showed that all samp les which infected LSV and LMoV could be amp li2
fied by multip lex PCR, yielding tow specific bands of LSV (876 bp) and LMoV (662 bp). The two viruses
were detected from dilutions of 104 by multip lex RT2PCR and RT2PCR, respectively. Sequence analysis on the
amp lified p roducts show that the nucleotide sequences homology of LSV was 8718% ～9913% compared with
sequences of other isolates, and LMoV was 9011% ～9915%.
Key words: Multip lex PCR; Detection; L ily sym ptom less virus; L ily m ottle virus
病毒病是百合鲜切花生产中的主要病害。在我国病毒病的发病率一般在 30% ～50% , 严重的达
80%以上 , 造成了较大的经济损失。目前国内外已报道侵染百合的病毒有 10种以上〔1, 2〕。其中为害
最严重的有两种 , 即百合无症病毒 (L ily sym ptom less virus, LSV ) 和百合斑驳病毒 (L ily m ottle virus,
LMoV) , 这两种病毒表现为复合侵染 , 常造成产量和质量的严重下降〔3～5〕。
由于百合种球主要通过组培和鳞片扦插等技术进行无性繁殖 , 从而加快了百合病毒的传播和为
害。防治百合病毒病最有效手段是采用无毒繁殖材料或进行脱毒快繁 , 而这有赖于灵敏、快速和可靠
的病毒检测技术〔6〕。当前 , 国内检测百合病毒的方法主要有 EL ISA、电镜和 PCR技术〔7～9〕。为提高
PCR检测效率和降低成本 , 本研究在前期工作基础上〔8, 9〕, 建立可同时检测 LSV、LMoV的复合 PCR
技术 , 以运用于百合主要病毒的检测、脱毒组培快繁和百合病毒流行规律的研究。
1 材料与方法
2期 王继华等 : 应用多重 RT2PCR检测百合无症病毒和百合斑驳病毒
111 材料
在斗南园艺场温室中采集具典型病毒症状的百合植株 , 经 EL ISA和电子显微镜检测 , 获得分别
带有 LSV、LMoV的样品 , 及两种病毒复合侵染的样品 , 活体保存。
112 方法
根据 NCB I (美国国立生物技术信息中心 ) 登记的 LSV、LM oV CP基因序列 , 应用计算机软件 ,
设计这两种病毒的特异引物 LSVCP1 /LSVCP2和 LMoV检测引物 LMoVP1 /LMoVP2, 引物核酸序列见
表 1。引物由大连宝生物公司合成。
表 1 L SV和 LM oV引物序列
Table 1 Sequence of L SV and LM oV pr im ers
病毒 V iruses 上游引物 Up p rimer(5pi23pi) 下游引物 Down p rimer(5pi23pi) 产物大小 Product size ( bp)
LSV LSVCP1: ATGCAACCAAGACCAGCACA LSVCP2: TCATCCATTATTTGCGTATC 876
LMoV LMoVP1: TGGGCACCTTGTGAATTACA LMoVP2: TGCTGTATGCCTCTCCGTGT 552
采用上海华舜公司的 RNA抽提试剂盒 RNAex Reagent System IV提取总 RNA。将 0105 g植物组织
在 1 mL缓冲液中研磨 , 其它步骤按说明书操作。提取的总 RNA溶解于 50μL的 ddH2 O中。
采用 5 ×MMLV缓冲液 4μL, 10 mmol/L dNTPs 1μL, 20μmol/μL Random p rimers ( Promega)
015μL, 2μL模板 RNA, 40 U /μL RNase 015μL, 200 U /μL M 2MLV反转录酶 1μL, 加 ddH2 O补足
至总体积 20μL。混合后 37℃反应 1 h, 合成 cDNA〔10〕。
对多重 PCR的各引物浓度及 PCR反应的退火温度进行优化 , 筛选出多重 PCR反应体系的最佳反
应模式。
将带有 LSV、LMoV、LSV +LMoV的百合叶片、百合健康叶片 , 分别进行多重 PCR扩增 , 3次重
复 , 以检测其特异性。
用 LSV +LMoV复合侵染的百合叶片提取总 RNA, 稀释为 101 ～108 (分别相当于 200μg、20μg、
2μg、200 ng、20 ng、2 ng、200 pg、20 pg) 后 , 分别进行 LSV、LMoV引物和多重 PCR扩增 , 3次
重复 , 以检测多重 PCR的灵敏度。
RT2PCR扩增产物经 Q IAEX GelExtrationKit (Q IAGEN 公司产品 ) 纯化后 , 与 pGEM 2Teasy载体
( Promega公司产品 ) 连接 , 转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞 , 利用 PCR技术和酶切进行筛选阳性克
隆。DNA测序由宝生物工程有限公司完成。用 DNASIS软件对所测 DNA序列进行分析比较。
2 结果与分析
211 多重 PCR反应条件的优化
经对多重 PCR的优化 , 最佳的反应模式为 :
在 50μL反应体系中 , 分别加入 10 ×PCR缓冲液
5μL, 10 mmol/L dNTPs 1μL, 20μmol/μL LSV
上下游引物各 1μL, LMoV上下游引物各 111μL,
5μL cDNA, 3 U /μL Taq酶 1μL, 加 ddH2 O至 50
μL。递降式 PCR程序 : 95℃变性 10 m in。前 10
次循环为 94℃变性 30 s, 退火 (每循环降 1℃,
从 64℃降至 54℃) 30 s, 72℃延伸 60 s。后 20次
循环为 94℃变性 30 s, 53℃退火 30 s, 72℃延伸
60 s。最后 72℃延伸 10 m in。
212 多重 PCR的特异性
多重 PCR可从分别带有 LSV、LMoV病毒的
图 1 多重 PCR的特异扩增
M: 200 bp分子量标准 ; 1: LSV; 2: LMoV; 3: LSV +LMoV;
4: 健康叶片。
F ig. 1 Spec if ic am plif ied by m ultiplex PCR
M: 200 bp Marker; 1: LSV; 2: LMoV; 3: LSV +LMoV;
4: Health leaf.
582
园 艺 学 报 32卷
叶片组织中扩增出单一的 PCR产物 , 大小分别约
为 876 bp、552 bp, LSV和 LMoV复合感染的叶
片组织则可扩出两条 PCR产物 , 健康叶片则无扩
增产物 (图 1)。这说明复合 PCR具有较高的特
异性 , 可准确地检测出百合叶片中的这两种病毒。
213 多重 PCR的灵敏度比较
LSV、LMoV单一引物扩增和多重 PCR 的检
测灵敏度比较结果表明 : 用 LSV或 LMoV的单对
引物 , 可从稀释至 104 (相当于 200 ng) 的粗提
液中扩增出 876 bp (图 2, A ) 或 552 bp (图 2,
B) 的产物 ; 用多重 PCR方法 , 可从稀释至 104
的总 RNA中同时扩增出 876 bp和 552 bp两条特
异扩增带 (图 2, C)。这表明多重 PCR方法具有
与单对引物 PCR相同的检测灵敏度。
214 PCR产物序列分析
测序表明 , LSV扩增产物共有 876个核苷酸
组成 , 与设计的 PCR产物大小相同 , 为 LSV CP
基因的全长。经序列比较 , 与 LSV荷兰分离物
和韩国分离物同源性大于 98% , 与日本分离物
核苷酸同源性大于 87%。LMoV 的 PCR 产物核
苷酸序列全长 553 bp , 与设计的 PCR产物大小
图 2 RT2PCR和 M ultiplex RT2PCR灵敏度比较
M: 200 bp分子量标准 ; 1～8: 稀释度分别为 101 ～108。
F ig. 2 Sen sitive com par ison between RT2PCR and
M ultiplex RT2PCR
M: 200 bp Marker; 1 - 8: D ilutions from 101 - 108.
相同。经序列比较 , 证实扩增产物为 LM oV CP基因部份序列 , 与其它 5个 LMoV分离物的同源性为
9011% ～9915%。以上结果表明 , 扩增产物与其它分离物有较高核苷酸同源性 , 证明了多重 PCR检
测结果的可靠性 (LSV CP基因序列 NCB I登录号 AY326460)。
3 讨论
311 采用多重 PCR检测植物病毒 , 在国内鲜有报道。本研究建立的百合两种病毒的多重 PCR检测技
术 , 比常规 PCR方法简化了程序 , 节约生物试剂 , 具有与常规 PCR相同的特异性和灵敏度 , 整个过
程可在 6～7 h内完成。此外 , 通过与前期研究〔8〕比较 , 多重 PCR的灵敏度是 DAS2EL ISA的 10倍以
上。本研究对复合病毒的多重 PCR检测有一定的指导意义 , 目前已应用于百合脱毒种苗的日常检测。
312 前期试验表明 , 影响多重 PCR的主要因素包括 : 每对引物扩增片段大小、退火温度和引物浓
度 , 而 PCR各步骤的时间和循环次数相对固定 , 对结果影响较小。根据多重 PCR反应较小片段优先
扩增的原则 , 本试验所设计的 2个扩增片段分别为 876 bp (LSV) 和 552 bp (LMoV ) , 片段之间大小
相差约 300 bp, 既有利于区分产物 , 也有利于每对引物的扩增。由于两对引物所要求最佳退火温度不
同 , 因此本试验采用了降落 ( TD ) PCR, 同时对引物浓度进行了优化 , 从试验结果可以看出 , 两对
引物均能获得较佳的多重 PCR扩增效果 , 即有较好的特异性和较高产量。
参考文献 :
1 Ki Hyun Ryu, HyeWon Park, Jang Kyung Choi. Characterization and sequence analysis of a lily isolate of cucumbermosaic virus form lilium
tsingtauense. Plant pathol. J. , 2002, 18 (2) : 85～92
2 沈淑琳. 百合病毒病及其检验. 植物检疫 , 1996, 10 (4) : 223～226
Shen S L. L ily virus disease and detection. Plant Quarantine, 1996, 10 (4) : 223～226 ( in Chinese)
3 Kim J, Lee S, Kim H, Choi S, Mark S Roh. Survey on virus diseases of L ilium spp. and their indexing by tissue and dot immunobinding as2
says. Acta Horticulturae, 1996, 414: 189～194
682
2期 王继华等 : 应用多重 RT2PCR检测百合无症病毒和百合斑驳病毒
4 A sjes C J, B lom2Barnhoorn G J, Piron P GM, Harrewijn P, van Oosten A M. Control review of air2borne tulip breaking virus and lily symp2
tom less virus in L ilium in the Netherlands. Acta Horticulturae, 1996, 432: 290～297
5 Cohen J, Gera A, Loebenstein G. V irus diseases of lilies in Israel. Acta Horticulturae, 1996, 432: 84～87
6 徐品三 , 苏 乔 , 安利佳. 百合不定芽培养脱毒初探. 园艺学报 , 2003, 30 (5) : 597
Xu P S, Su Q, An L J. Prelim inary study on virus2free by adventitious bud culture in L ilium spp. Acta Horticulturae Sinica, 2003, 30 (5) :
597 ( in Chinese)
7 Yang T C, L in C Y, Zettler F W , Ko N J. Identification and diagnosis of lily sym ptopm less virus in commercial lilies grown in Taiwan and
USA. Plant Prot. Bull, 1993, 35 (2) : 95～103
8 王继华 , 瞿素萍 , 孔宝华 , 陆 琳 , 余朝秀. 百合无症病毒的 RT2PCR和 IC2RT2PCR检测. 云南农业大学学报 , 2004, 19 ( 1) :
148～150
W ang J H, Qu S P, Kong B H, Lu L, Yu C X. Detection of L ily sym ptom less virus by RT2PCR and IC2RT2PCR. Journal of Yunnan Agricul2
ture University, 2004, 19 (1) : 148～150 ( in Chinese)
9 丁元明 , 王继华 , 刘忠善 , 和 捷. 应用特导引物和简并引物检测百合花叶病毒. 云南农业大学学报 , 2003, 18 (4) : 96
D ing Y M, W ang J H, Lu Z S, He J. Detection of L ily m ottle virus by RT2PCR using special p rimers and degenerate p rimers. Journal of Yun2
nan Agriculture University, 2003, 18 (4) : 96 ( in Chinese)
10 王继华 , 丁元明 , 王丽花. 百合无症病毒云南分离物的 CP基因克隆和序列分析. 植物病理学报 , 2003, 33 (6) : 562～563
W ang J H, D ing YM, W ang L H. The cloning and sequences analysis of CP gene of Yunnan isolates of L ily sym ptom less virus. Acta Phyto2
pathologica Sinica, 2003, 33 (6) : 562～563 ( in Chinese)
收稿日期 : 2005 - 01 - 20; 修回日期 : 2005 - 03 - 29
基金项目 : 北京市科技新星资助项目 (2004B13)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: fsx20@1631com)
日光温室嫁接番茄生长特性及抗病性研究
关美芝 1 范双喜 13 王绍辉 1 秦 勇 2 高 洁 2 (1 北京农学院植物科学技术系 , 北京 102206;
2 新疆农业大学园艺系 , 乌鲁木齐 830001)
Effect of D ifferen t Root Stocks on the Growth Character istics and Resistance
to D isea se of Toma to Grow ing under Solar Greenhouse
Guan Meizhi1 , Fan Shuangxi13 , W ang Shaohui1 , Q in Yong2 , and Gao J ie2 ( 1D epartm en t of P lan t Science and
Technology, B eijing A gricu lture College, B eijing 102206, Ch ina; 2 College of Horticulture, X in jiang A gricultural U niversity,
U rum chi 830001, China)
关键词 : 番茄 ; 嫁接 ; 抗病性
中图分类号 : S 64111 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2005) 0220287201
近年来 , 由于设施蔬菜生产的高复加值 , 使得连作障碍严重 , 土传病害广泛蔓延。有关嫁接栽培早结果、丰产、
增强植株抗性等报道较多。但嫁接对番茄生长特性及抗病性影响的研究报道较少。本试验旨在选择早产、高产、抗病
性砧木 , 为设施蔬菜无公害生产提供科学的理论依据和指导方向。
试材番茄自根苗 ‘日本满田 2170’于 2003年 11月 21日播种 , 4种砧木 (粘毛茄、北农茄砧、拖鲁巴姆、赤茄 )
于 2003年 10月 26日统一播种。当砧木生长为四叶一心、接穗二叶一心时采用劈接法嫁接。3月 8日统一定植于北京
农学院日光温室 , 常规栽培管理。2004年 2月 18日嫁接后采用小拱棚遮阴管理 , 棚内温度为 25～28℃, 相对湿度
95%。不同砧木嫁接番茄每小区定植 22株 , 两区共定植 44株。记录嫁接番茄第 1花序 50%开花时间和果实 10%～20%
转红的时间。观察晚疫病自然病害发生情况并进行测产。
试验结果 (表 1) 表明番茄嫁接后 , 第 1花序 50%开
花所需天数和果实 10% ～20%转红所需天数早于自根苗 ,
其中嫁接成活率高的番茄 , 开花结果早 , 产量高、抵抗晚
疫病能力较强 ; 嫁接成活率低的番茄则相反。如粘毛茄的
嫁接成活率较高 , 与自根苗相比 , 开花、果实转红分别早
25 d和 26 d、产量高 14%、晚疫病感病率较低。北农茄
砧的嫁接成活率较低 , 与自根苗相比 , 开花、结果转红提
前 14 d和 13 d、产量低 35% , 抵抗病害的能力也较低为
20%。从整体上看 , 说明嫁接番茄的初花期和初果期比自
根苗较提前 , 生产上能较早得到经济效益。在 4种砧木中
以粘毛茄为早产、高产、抗性强的优良砧木品种。
表 1 嫁接对番茄生长特性及抗病性的影响
Table 1 Effect of d ifferen t root stocks on the growth
character istic and resistance d isea se of toma to
处理
Treatment
成活率
Survival
rate
( % )
开花天数
Days from
grow to
first flower
果转红天数
Days from
grow to friut
turn red
晚疫病发
病率
D isease
rate ( % )
产量
Yeild
(kg/m2 )
自根苗 Rootself 45 95 14 50
粘毛茄 63 20 69 9 59
N ianmaoqie
赤茄 Chiqie 43 26 72 14 36
拖鲁巴姆 56 28 73 18 39
Tuolubamu
北农茄砧 38 31 82 20 32
Beinongqiezhen
782