全 文 ：园
艺
学
报
2002, 29 ( 4) : 375~ 377
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期: 2001- 12- 12; 修回日期: 2002- 03- 27
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (39970521) ; 莱阳农学院博士基金资助项目 (Y0120)
新红星 苹果果实蔗糖合酶的活性及亚细胞定位
李培环1
董晓颖1
王永章1
刘成连1
原永兵1
李
鹏2
( 1莱阳农学院园艺系, 莱阳 265200;
2 莱阳市高格庄镇, 莱阳 265200)
摘
要: 在 新红星 苹果果实发育过程中, 伴随果糖、葡萄糖和蔗糖的积累, 蔗糖合酶的分解活性
逐渐下降, 而合成活性逐渐升高。苹果果实的蔗糖合酶由分子量为 90 kD的亚基组成, 其免疫信号强度随
发育进程而增加。蔗糖合酶主要定位于果肉细胞的细胞质中, 发育中后期该酶的分布密度有一定增加。综
合结果认为, 蔗糖合酶调控发育早期蔗糖的降解和发育后期蔗糖的积累。
关键词: 苹果; 果实; 蔗糖合酶; Western 印迹; 免疫电镜定位
中图分类号: S 661. 1

文献标识码: A

文章编号: 0513
353X ( 2002) 04
0375
03
1
目的、材料与方法
蔗糖作为苹果碳水化合物的一种运输形式和贮存形态, 是果实糖代谢的一个调控枢纽!1~ 4∀。现有
研究表明: 转化酶、蔗糖合酶及蔗糖磷酸合酶均是参与果实蔗糖代谢的相关酶!3, 4∀, 其中转化酶将蔗
糖不可逆地分解成果糖和葡萄糖, 而蔗糖磷酸合酶催化蔗糖合成的反应也是不可逆的。由于蔗糖合酶
具有分解和合成蔗糖的双重属性!2, 3∀, 所以在调控蔗糖代谢中可能起更重要的作用。但有关蔗糖代谢
的细胞学路径尚不清楚。
本试验于 2000~ 2001年在莱阳农学院进行。以 12年生新红星/西府海棠 ( Malus domestica Borkh
cv. Starkrimson/Malus micromalus) 为试材, 盛花后每隔15 d取样 1次。每次随机取 20个果实, 将果实
去皮、去核后, 每果取 1/ 2果肉, 用液氮速冻后置- 70 # 冰箱中待用。按照Miron等!5∀的方法提取酶
液和测定果实蔗糖合酶活性 (包括合成活性和分解活性) ; 参照王永章等!1∀的方法测定糖含量。依据
王永章等!1∀的方法进行蔗糖合酶的Western印迹和胶体金免疫电镜定位, 略有调整。一抗为番茄果实
蔗糖合酶抗体 (苏格兰Heather A Ross 博士提供) , 二抗分别为羊抗兔标记的碱性磷酸酶 ( 1∃5 000,
Western印迹) 和交联 10 nm 金颗粒的羊抗兔抗体 ( 1∃50, 体金免疫电镜定位)。
2
结果与分析
2. 1
果实发育过程中糖含量及蔗糖合酶活性的变化
图1表明, 新红星苹果果实发育早期果糖、葡萄糖和蔗糖含量均较低, 且差异不显著。从花后
60 d开始, 随着果实的发育, 果糖和葡萄糖含量迅速增加, 其中以果糖的积累最为显著, 到采收期
(花后 150 d) 其含量为葡萄糖的 2. 06倍, 蔗糖的 3. 14倍左右。蔗糖含量仅在发育后期 (花后 90~
150 d) 才有一定的增加, 但最终含量远低于果糖和葡萄糖。
从图 1还可以看出, 在苹果果实的发育早期, 蔗糖合酶具有较高的分解活性, 随着果实的发育,
其分解活性逐渐降低, 在果实的发育后期 (从花后 75 d到果实成熟) 维持较低活性且变幅较小。而
蔗糖合酶的合成活性在发育早期也较高 (但低于分解活性) , 随果实的发育, 在发育中期活性略有下
降, 发育后期, 蔗糖合酶的合成活性再次升高且显著高于早期。因此表明, 在苹果果实的发育早期,
蔗糖合酶促进蔗糖的降解, 而在果实的发育后期促进蔗糖的积累。
2. 2
果实发育过程中蔗糖合酶的Western印迹
用番茄蔗糖合酶抗体, 在果实蛋白质 SDS
PAGE电泳条带上, 特异地识别出一条分子量约为 90kD
的多肽 (图2, A) , 表明苹果果实蔗糖合酶由 90 kD的亚基组成。从图中还可以看出, 在果实发育过
程中, 免疫检测到的蔗糖合酶的亚基分子量没有变化; 然而, 随着果实的发育, 免疫检测信号有所增
强, 花后 30~ 75 d免疫信号增强趋势明显, 但花后 75 d与花后 135 d的免疫信号强度相比, 看不出
明显的变化, 表明在果实发育的中 (花后 75 d) 后 (花后 135 d) 期, 蔗糖合酶的表观数量有一定量
的增加。
以免疫前兔血清代替蔗糖合酶抗体所进行的对照试验 (图 2, B) , 在果实蛋白质 SDS
PAGE电泳
条带上均没有检测到任何免疫信号。
图 1
新红星苹果果实发育过程中可溶性糖含量及蔗糖合酶活性变化
Fig. 1
Changes of soluble sugar contents and sucrose synthase
activities in Starkrimson apple during frui t development
图 2
新红星苹果果实发育过程中蔗糖合酶的Western印迹
A 苹果果实蔗糖合酶的Western印迹; B对照。Mr. 标准蛋白分子量;
1. 花后 30 d; 2. 花后 75 d; 3. 花后 135 d。SDS
PAGE电泳的上样量
按果实鲜样质量计, 各发育时期完全相同, 均为 25
L的制备样液。
Fig. 2
Western blotting analysis of sucrose synthase inStarkrimson
apple during fruit development
A: Western blott ing of soluble protein from apple fruit with antibody against
sucrose synthase from tomato fruit. B: Control. Mr Standard protein molecular
weight markers. 1: represent ing fruit at 30 days after anthesis. 2: represent ing
fruit at 75 days after anthesis. 3: representing fruit at 135 days after anthesis.
25
L of extract which contains the same volume based on fresh weight at each
developmental stage was loaded per lane and was analyzed on a 10% SDS

polyacrylamide gel and then electro
transferred to nitrocellucose membrane,
immuno
blott ing with polyclonal antiserum against tomato sucrose synthase.
2. 3
果实发育过程中蔗糖合酶的胶体金免疫电子显微镜定位
从图版可以看出, 代表果实蔗糖合酶的金颗粒主要定位于果肉细胞的细胞质中, 而在细胞壁和液
泡中的金颗粒分布很稀少 (图版, A~ G)。细胞质中的金颗粒密度从花后 30 d (图版, A、B) 到花后
75 d (图版, C、D) 有一定的增加, 但发育中期 (图版, C、D) 和发育后期 (图版, E~ G) , 细胞质
中的金颗粒密度差异不明显, 这些定位结果表明, 果实发育中期 (图版, C、D) 和发育后期 (图版,
E~ G) , 蔗糖合酶的数量比发育早期 (图版, A、B) 有一定量的增加。
以免疫前兔血清代替蔗糖合酶抗体进行的对照试验表明, 苹果果肉细胞各部位基本没有金颗粒标
记 (图版, H) ; 省略蔗糖合酶抗体所进行的检测非特异性标记的对照试验也未检测到金颗粒的分布,
由此表明番茄蔗糖合酶抗体对苹果果实蔗糖合酶的识别是特异的和可靠的。
参考文献:
1
王永章, 张大鹏. 果糖和葡萄糖参与诱导苹果果实酸性转化酶翻译后的抑制性调节. 中国科学 ( C辑) , 2002, 32 ( 1) : 30~ 39
2
王永章, 张大鹏. 红富士苹果果实蔗糖代谢与酸性转化酶和蔗糖合酶关系的研究. 园艺学报, 2001, 28 ( 3) : 259~ 261
3
王永章, 蒋家慧, 李培环, 等. 肉质果实碳水化合物代谢及调控研究进展. 莱阳农学院学报, 2001, 18 ( 3) : 241~ 250
4
Beruter J. Studer M E, Rued P. Sorbitol and sucrose part it ioning in the growing apple fruit. J. Plant Physiol. , 1997, 151: 269~ 276
5
Miron D, Schaffer A A. Sucrose phosphate synthase, sucrose synthase and invertase activit ies in developing fruit of Lycopersi con esculentum Mill . and
sucrose accumulation in Lycopersicon hirsutum Humb. and bonp. Plant Physiol. , 1991, 95: 623~ 627
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29 卷
Activity and Subcellular Localization of Sucrose Synthase in Starkrimson
Apple during Fruit Development
Li Peihuan1, Dong Xiaoying1, Wang Yongzhang1, Liu Chenglian1, Yuan Yongbing1, and Li Peng2
( 1Department of Horticulture, Laiyang Agricultural College , Laiyang 265200, China; 2Gaogezhuang town, Laiyang city , Laiyang
265200, China)
Abstract: The experiment conducted with Starkrimson apple fruit showed that the degradation activity of su

crose synthase declined gradually with the accumulation of fructose, glucose and sucrose during fruit development.
However, the synthesis activity of sucrose synthase decreased during the early stage of fruit development and then
increased significantly during the late development stage. Western blotting assay of sucrose synthase detected the
presence of a 90 kD peptide and the intensity of immuno
signal increased with fruit developing. On the other hand,
the results of immunogold electron
microscopy assay showed that sucrose synthase was mainly located in the cyto

plasm of apple flesh cell and few immunogold particles were found on cell wall or in vacuole. The results also indi

cated that the quantity of sucrose synthase increased with fruit development and was consistent with the results of
Western blotting. So it is suggested that the degradation and synthesis of sucrose in apple fruit may be modulated by
sucrose synthase. Fructose may act as sugar signal and modulate the activity of sucrose synthase.
Key words: Apple fruit; Sucrose synthase; Western blotting; Immunogold subcellular localization
图版说明
新红星苹果果实细胞中蔗糖合酶的胶体金免疫电镜定位
A, 花后 30 d ( % 26 000) ; B, 花后 30 d ( % 26 000) ; C, 花后 75
d ( % 20 000) ; D, 花后 75 d ( % 33 000) ; E, 花后 135 d ( % 13 000) ; F, 花后 135 d ( % 33 000) ; G, 花后 135 d ( % 26 000) ; H, 花
后 75 d, 以免疫前兔血清代替蔗糖合酶抗体的对照 ( % 20 000)。CW, 细胞壁; V , 液泡。
Explanation of Plate
Immunogold electron
microscopy localization of sucrose synthase in fruit cells of Starkrimson
A, 30 days after anthesis
( % 26 000) ; B, 30 days after anthesis ( % 26 000) ; C, 75 days after anthesis ( % 20 000) ; D, 75 days after anthesis ( % 33 000) ; E, 135 days after
anthesis ( % 13 000) ; F, 135 days after anthesis ( % 33 000) ; G, 135days after anthesis ( % 26 000) ; H, 75 days after anthesis ( control) , there is al

most no immunogold part icle in fruit cell using the preimmune serum instead of sucrose synthase ant ibody ( % 20 000) . CW, cell wall ; V, vacuoles .
3774 期









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