全 文 ：园 艺 学 报 2003，30(3)：346～348
Aeta Horticu]turae Siniea
甜瓜果实酸性转化酶基因 cDNA片段的克隆
于喜艳 赵双宜2 何启伟 孔庆国4
(。山东农业大学园艺学院，泰安 271018； 山东大学生命科学学院 ，济南 250100； 山东省农业科学院蔬菜研究所 ，
济南 250100； 山东滨州职业学院，滨州 256624)
摘 要：根据在 GenBank中登录的番茄、胡萝 卜和柑桔等酸性转化酶基因的保守序列设计引物，采用
RT—PER方法，从甜瓜果实总 RNA中扩增出目标 eDNA片段，克隆到 pMDI8．T载体中。序列分析表明，它
与其它植物的酸性转化酶基因的同源性很高，与番茄氨基酸序列同源性为 99％，说明已经成功克隆到甜瓜
果实酸性转化酶基因 eDNA片段，在 GenBank中登记号 AF490425。
关键词：甜瓜 ；果实；RT—PCR；酸性转化酶基因
中图分类号：S652 文献标识码 ：A 文章编号：0513．353X(2003)03．0346-03
1 目的、材料与方法
甜瓜果肉中主要的可溶性糖是蔗糖、葡萄糖和果糖。对于不同含糖量的品种来说葡萄糖 、果糖的
含量基本上没有太大差别，甜度差别主要取决于蔗糖含量的不同【J 。而甜瓜果实蔗糖代谢主要受酸性
转化酶和蔗糖磷酸合成酶的调控。而且酸性转化酶活性的降低是甜瓜果实蔗糖积累的必要前提【2j。改
善甜瓜品质，提高含糖量和适当提早蔗糖积累的主要突破口就是适时降低果实发育中酸性转化酶的活
性。因此 ，有必要对甜瓜果实酸性转化酶基因进行克隆和测序。
将 ‘伊丽沙白’甜瓜 (Cucum／s me／o L．)播种于山东省农科院蔬菜所 日光温室 ，以开花后 5 d果
实为材料 ，提取总 RNA。RNA PCR (AMV)Ver 2．1 Kit，pMD 18．T Vector和 T4 DNA连接酶购 自大连宝
生物有限公司；DNA Extraction Kit购自MBI公司；大肠杆菌 DH10B由山东大学生命科学院遗传实验室
提供。RNA的提取参照文献 (3]。根据在 GenBank中登录的番茄、胡萝 卜和柑橘等作物的酸性转化酶
基因的保守序列，设计 5’端引物为 5-GACCCGACTAC1℃a G3’(引物 A)和 3’端引物为 5’．TAT．
GACTGTILTICCTCCT-3’(引物 B)。按 RNA PCR Kit(AMV)Ver 2．1试剂盒说明书，逆转录：取 1
(约 1 p-g)甜瓜果实总 RNA于 8．5 无 RNA酶的双蒸水中，72℃水浴 10 min，立即置冰上 2 min后，
加入 25 mmol／L MgCh 4 tL，10×RNA PCR Bufer 2 ，10 mmol／L的 dNTP 2 tL，Rnase Inhibitor O．5 ，
Reverse Transcfiptase 1 (5 U／L)和 Oligo(dT)．Adaptor wimer 1 Lo置 PCR仪中，反应条件为 42℃
30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min。逆转录完成后，向反应体系中加入下列成分；25 mmol／L MgCh 6 ，
10×RNA PCR bufer 8 ，D．D．W 57．5 ，引物 A 4 tL(20 pmol／／db)，引物 B 4 (20 pmol／t&)，
Taq酶 0．5 (5 U／ )总体积 103 。PCR反应参数为 94℃预变性 5 min，随后 94℃ 1 min，50℃ 1
min，72℃ 3 min。30个循环后 。72℃再延伸 10 min。
目的DNA片段的回收采用购自MBI公司的DNA Extraction试剂盒。PCR产物纯化后直接与 pMD18．
‘T(大连宝生物 T载体试剂)载体连接，采用热激法转化大肠杆菌 DH10B感受态细胞 ，感受态细胞的
制备采用 CaCh法【4]。取 103 菌液涂布于含 x．gaJ和 IPTG的筛选培养基 (含氨苄青霉素)平板，
37℃培养 16 h后随机挑取 4个白色菌落分别接种于加有 Amp 50 mg／L的 LB液体培养基中，37~(2过夜
培养。按碱裂解法少量提取质粒。以质粒 DNA为模板进行 PCR鉴定，委托大连宝生物工程有限公司
测定 DNA序列 。
收稿日期：20O2—07—16；修回日期：2OO2—11—26
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3期 于喜艳等：甜瓜果实酸性转化酶基因 eDNA片段的克隆 347
2 结果与分析
2．1 RNA提取和酸性转化酶基因 RT—PCR扩增
通常情况下，甜瓜果实花后 10～15 d左右酸
性转化酶活性最高，但编码蛋白的 mRNA的高峰
期应早于酶的活性期 ，再考虑到 ‘伊丽莎白’为
早熟 品种，故取花后 5 d的果实作为材料提取
RNA。本试验从 10 g‘伊丽莎白’甜瓜果实组织
中提取到 336 tg RNA，完整性很好，ODz6o／OD2ao
= 2．03，达到了 RT—PCR对 RNA的要求。RT—
PCR产物经 1．0％琼脂糖凝胶电泳检查，在约 1 kb
处有一条带，片段大小与预期的一致 (图 1)。
2．2 RT—PCR产物的克隆
RT—PCR产物纯化后与 pMD18．T载体连接，
2 3
1kb
图1 甜瓜果实酸性转化酶基因RT—PER产物
空白对照；2．果实总RNA的RT—PCR产物；3．DNA分子量标记
飚 ．1 RT—PCR product ofacid invertase gene in melon fruit
Negative control；2．RT—PCR product amplifiedfrom melonfruit；
3． Marker DNA DL．2，000+15，000
转化大肠杆菌 DH10B，蓝 白斑筛选获得 285个 白
斑菌落，未见蓝斑。随机挑取 4个克隆提取质粒。
PCR检测结果均为阳性 (图2)，这表明 RT—PCR ⋯ 。．
产物已克隆到载体上。
2．3 甜瓜果实酸性转化酶 eDNA片段的序列分析
将所得克隆的重组质粒纯化后进行序列测定，
结果如图 3。双向测序结果表明克隆的 cDNA片段
长 1038 bp，推导的氨基酸序列长 346个氨基酸。
与GenBank中的同源序列 比较，本研究所分离的
1
1
76
26
151
51
226
76
301
101
376
126
451
151
526
176
601
201
676
226
751
251
826
276
901
301
976
326
6 5 4 3 2
图 2 重组质粒的PCR鉴定
1kb
500bp
1．DNA分子量标记；2．PMD 18-T质粒；3～6．重组子的 PCR产物
Fig．2 PCR products ofthe recomlma~t pI掰Ilil凼
1．Marker DNA DL．2，000+15，000； 2．pMD18-T plamid；
3—6．PCR products of recombinant plasmids
D P T T A ■ T G P Q N G Q W L L T I G S K I G K T
G V A L V Y E T S N F T S F K L L D G V L H A V P
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K Q V Y G S S V P V L D G E K H S
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GGAGG从 G¨ C^ GTC^ 1’A
G G R T V I
图 3 甜瓜果实酸性转化酶基因 cDNA片段序列及其推导的氨基酸序列
上行为 cDNA序列，下行为推导的氨基酸序列。
rag．3 smun~ 0f eDNA fragment and its deduced 呻 acid ofadd invertase gene in melon fruit
The above line showed cDNA S~~lllellCe．under which were the sequence of deduced amino acid．
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园 艺 学 报 30卷
eDNA片段的氨基酸序列与其它物种酸性转化酶的氨基酸序列同源性介于 55％一99％。其中与茄科作
物的同源性最高，与番茄同源性为 99％，与马铃薯为 96％，与辣椒为 93％；其次与甘薯 、胡萝 卜、
水稻的同源性都在 80％以上；与甘蓝、菜豆和葡萄等的同源性在 70％ 79％。据此认为，该 eDNA片
段属于甜瓜果实酸性转化酶基因 eDNA片段，在 GenBank中登记号 AF490425。
本试验为今后从甜瓜果实 eDNA文库中筛选全长基因和利用反义基因技术，促进甜瓜果实蔗糖积
累，从分子水平进行甜瓜品质改良奠定了基础。
参考文献：
l ungl S E，D|lIlap J R．Sucrosemetabolismin nestedmuskmelonfruit during development．Plant Physio1．，1987，84：386～389
2 Mc Collm T G， Hubert D J．Soluble sugar accumulation and activity of related e／1zyl／le$during muskmelon fruit development．J． Amel-．Soc
Hort．Sei．。1988，l13(3)：399～403
3 赵双宜，吴耀荣．介绍一种新的 RNA的提取方法．遗传，2002，24：(3)337～338
4 J萨姆布鲁克 ，E F弗里奇，T曼尼阿蒂斯．分子克隆实验指南．金科雁，黎孟枫译 ．北京：科学出版社 ，1992．55～56
Cloning of a cDNA Fragment of Acid lnvertase Gene from Cucum／s me／o L．Fruit
Yu Xiyan’
，
Zhao Shuangyi2
， He Qiwei3，and Kong Qingguo4
( &hod ofHort／cu／t~ ，ShandongA~r／cu／tura／Urdtersny，Ta／an 271018。Ch／na； &hod of Sc／ences，Shandong Un／versny，
．／／nan 250100，Ch／na； Vegetab／e Inst／tute，Shandong Academy ofAgricultural Sciences，Jinan 250100，Ch／na； Binzhou Voca—
tional C．oa~ ofShandong Province，Binzhou 256624，Ch／na)
Abstract： PCR primers were designed based on the eonsensu$ domain of some acid invertase genes in
GenBank．111e aimed cDNA fragment WaS amplifed from the total RNA isolated from melon fruit via RT—PCR and
cloned into pND18-T vector．111e amino acid sequence determined by this fragment shows 99％ homology to that of
the corresponding region of acid invertase of tomato． s confirms that we have cloned a eDNA fragment from
melon fruit successfully．the lteee$,$number of this gene in GenBank is AF 25．
Key words：Melon； Fruit； RT—PCR； Acid inverta~ gene
中国园艺学会十字花科蔬菜分会成立
经中国园艺学会第九届第 5次常务理事扩大会议讨论批准。中国园艺学会十字花科蔬菜分会成立，并于2OO3年 3月
27日在郑州召开成立大会，30余名从事十字花科蔬菜科研、教学 、生产、管理方面的代表参加了会议。代表们听取了筹
备小组的筹备工作报告，讨论并通过了分会章程，选举了分会领导机构的主要组成人员。会长：方智远；副会长：何启
伟、徐家炳、王均邦；秘书长：孙日飞；副秘书长：侯喜林、刘玉梅。会议决定2OO3年 l0月上旬在山东莱州市召开十
字花科蔬菜学术交流会。 ．
关于召开十字花科蔬菜学术交流会议的预备通知
中国园艺学会十字花科蔬菜分会决定 ，2003年 l0月上旬在山东省莱州市召开十字花科蔬菜学术交流会 ，会期预
计 3天。会议主要内容有：1．召开中国园艺学会十字花科蔬菜分会理事会；2．交流十字花科蔬菜生物技术及雄性不育方
面的研究进展 ；3．展示十字花科蔬菜的新品种。欢迎从事十字花科蔬菜科研、教学 、生产 、管理方面的单位和个人参加
会议。申请参加会议的代表请于 2OO3年 8月 30日前与中国园艺学会办公室张彦同志联系，拟在会上进行论文交流的，
请将论文全文寄到中国园艺学会办公室。会议费及差旅费自理。会议具体日期及提供展示新品种的要求将另行通知。
中国园艺学会十字花科蔬菜分会
20o3年 6月8日
t v f 息
信
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