全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (6) : 1111～1113
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 12 - 10; 修回日期 : 2005 - 01 - 20
基金项目 : 广东省自然科学基金项目 (003062) ; 广东省科技计划项目 (2005B20901019)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: lilab@ scnu1edu1cn)
蝴蝶兰褐变外植体的显微结构观察以及褐变成分的
初步分析
许传俊 1, 2 　李　玲 13 　李　红 1 　张铭光 1
(1 华南师范大学生命科学学院 , 广东省植物发育生物工程重点实验室 , 广州 510631; 2 福建省亚热带植物研究所 , 厦
门 361006)
摘 　要 : 对蝴蝶兰褐变外植体进行扫描电镜和显微结构观察 , 发现褐变叶片外植体的上表皮已经变形 ,
维管束完全破坏 , 被有毒的鞣质填充 , 有些薄壁细胞中发现有不明物质沉积。初步分析褐变外植体分泌到培
养基中的成分有缩合鞣质。外植体总酚含量和 PAL活性随褐变程度加重逐渐增加 , 两者呈现显著正相关。
关键词 : 蝴蝶兰 ; 褐变 ; 外植体 ; 显微结构 ; 鞣质
中图分类号 : S 68　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0621111203
Prelim inary Stud ies on the Elem en ts of Brown ing and the Changes in Cellu2
lar Texture of L eaf Explan t Brown ing in Pha laenopsis
Xu Chuanjun1, 2 , L i L ing13 , L i Hong1 , and Zhang M ingguang1
(1 College of L ife Science, Sou th China N orm al U niversity, Guagndong Key L abora tory of B iotechnology for Plan t D evelopm ent,
Guangzhou 510631, Ch ina; 2 Fujian Institu te of Subtropical B otany, X iam en 361006, Ch ina)
Abstract: The m icrostructure of Phalaenopsis sp. was exam ined with m icroscope and scanning electron
m icroscope. The results showed that the vascular bundle of browning cell filled with tannin and the upper ep i2
derm is shriveled; There are something deposited in parenchyma cell. The colorimetric assay demonstrated that
the substance extracted from medium was condensed tannins. W ith the browning of exp lant, the content of to2
tal phenol compounds and the activity of PAL were increased, and the co2relationship analysis showed that
they were positive correlation significant at 1% level.
Key words: Pha laenopsis; B rowning; Exp lant; M icrostructure; Tannin
1　目的、材料与方法
植物组织离体培养时 , 外植体褐变是影响初代培养是否成功的关键。关于外植体褐变 , 在培养
基、取材时间、激素、外植体的生理状态方面的原因研究较多 , 但对于外植体发生褐变时 , 外植体的
结构变化研究较少 , 仅见 Laukkanen等〔1〕报道松发生褐变的愈伤组织细胞结构已被破坏 , 细胞中沉积
有毒的鞣质。也有导致酶促褐变底物的报道 , 迄今为止尚未见褐变产物分析的报道。作者观察了褐变
外植体细胞的显微和亚显微结构 , 初步分析外植体分泌到培养基中的褐色物质成分 , 以期认识外植体
发生褐变的机理 , 为防止褐变提供基础。
取蝴蝶兰 ( Phalaenopsis sp. ) 褐变的叶片外植体 , 通过徒手切片 , 在光学显微镜下观察褐变叶片
外植体结构 ; 按常规方法制扫描电镜切片 , 利用 Philip FE I - XL30ESEM环境扫描电镜观察拍摄显微
照片。外植体的总酚含量〔2〕、PAL (苯丙胺酸解氨酶 ) 活性〔3〕、叶绿素含量〔4〕测定重复 3次 , 取平
均值进行统计分析。以培养 0 d的叶片外植体为对照。
取褐变外植体周围的培养基 , 用 50%的丙酮溶液提取 , 过滤 , 将提取液在通风橱内抽干 , 获得
园 　　艺 　　学 　　报 32卷
沉淀后 , 用丙酮反复溶解提取 , 提取液分别加入 1% FeCl3、醋酸铅 -稀醋酸、甲醛浓盐酸等 , 观察颜
色反应及沉淀变化〔5, 6〕。
2　结果分析与讨论
211　蝴蝶兰褐变叶片外植体组织结构观察
与相同部位的新鲜蝴蝶兰叶片比较 , 褐变叶片外植体维管束发生变化 , 呈现较深的颜色 , 用
FeCl3 染色后着色加深 (图 1, A) , 对照叶片基本不着色 (图 1, B)。光学显微镜下观察到褐变叶片
的外植体细胞的叶绿体数量减少。同时用透射电镜证实褐变外植体的叶绿体已经解体。
212　蝴蝶兰褐变叶片外植体扫描电镜观察
蝴蝶兰新鲜叶片的上表皮细胞存在有明显的珍珠状突起 (图 1, C) , 表面有蜡质样物质分布 , 没有
气孔结构 ; 发生褐变外植体叶片的上表皮突起不显著 (图 1, D) , 并且细胞皱缩 , 整个向外突起 , 细胞
之间的边界不清晰。新鲜叶片的下表皮 (图 1, E) 有气孔分布 , 细胞表面亦有珍珠状突起 , 细胞饱满 ;
褐变叶片外植体的下表皮 (图 1, F) 气孔没有明显的变化 , 细胞出现皱缩 , 细胞边界模糊。
蝴蝶兰新鲜叶片分上表皮、下表皮和叶肉组织 3个部分 , 维管束分布在中间清晰可见 (图 1, G)。
而褐变外植体的维管束已被完全破坏 (图 1, H) , 被填充物堵塞 , 有些薄壁细胞中有不明物质沉积。
图 1　蝴蝶兰褐变叶片外植体显微结构观察
A, B: 光学显微镜观察 ; C～H: 扫描电镜观察。A: 褐变外植体 FeCl3 染色 ; B: 新鲜叶片 FeCl3 染色 ; C: 新鲜叶片上表皮 ;
D: 褐变叶片上表皮 ; E: 新鲜叶片下表皮 ; F: 褐变叶片下表皮 ; G: 新鲜叶片的维管束 ; H: 褐变叶片的维管束。
V: 维管束 ; S: 气孔。
F ig. 1　M icrostructure of Pha laenopsis sp. leaf explan t
A, B: Op tical m icroscope exam ination; C - H: Scanning electron m icroscope exam ination. A: B rown exp lant stained with FeCl3 ;
B: Control stained with FeCl3 ; C: The ep icuticle of control; D: The ep icuticle of browning exp lant; E: The lower ep iderm is of control;
F: The lower ep iderm is of browning exp lant; G: Vasula bundle of control; H: Vasula bundle of browning exp lant.
V: Vasula bundle; S: Stoma.
213　蝴蝶兰叶片外植体在褐变过程中总酚含量和 PAL活力的变化
蝴蝶兰外植体内总酚含量在培养初期增加不明显。外植体在第 6天开始褐变 , 这时总酚含量明显
增加 (图 2) , 为对照含量的 2倍 , 培养第 8天褐变外植体的总酚含量又比第 6天提高 50% , 第 14天
外植体总酚含量达到最高值 , 为对照的 413倍。
对照样品中几乎检测不到 PAL活力 (图 3) , 叶片离体培养 2 d之后可以检测到酶值 , 随着叶片
外植体褐变程度的加重 , PAL活力逐渐增加 , 培养第 6天的外植体 PAL的活力为培养 2 d值的 2195
倍 , 到第 12天 PAL活力达到最大 , 为第 2天的 5倍。PAL活性变化与总酚含量的变化之间呈现极显
著的正相关 ( r = 018971, P 0101)。
2111
　6期 许传俊等 : 蝴蝶兰褐变外植体的显微结构观察以及褐变成分的初步分析 　
214　蝴蝶兰叶片外植体褐变过程中叶绿素含量变化
叶绿素 a和 b含量在离体培养 2 d内降低
46% , 以后缓慢减少 , 在培养 4～14 d期间 , 叶
片外植体叶绿素含量变化不大 , 叶绿素 a和 b的
含量变化基本一致 (图 4)。叶绿素含量降低 , 与
显微结构观察中发现的叶绿体数量减少以及在电
镜照片上看到的叶绿体解体相一致。
215　蝴蝶兰叶片外植体褐变成分的颜色反应
用丙酮溶液提取培养基中的褐色物质 , 经
FeCl3 反应呈墨绿色 ; 提取液经醋酸铅沉淀 , 再加
图 4　蝴蝶兰叶片外植体褐变过程中叶绿素含量的动态测定
F ig. 4　Chlorophyll a and b con ten t of Pha laenopsis
explan t dur ing brown ing
稀醋酸沉淀溶解 ; 提取液与甲醛浓盐酸反应有沉淀 ; 与稀盐酸共沸产生红色沉淀 , 因此推测丙酮提取
的培养基褐色物质中存在缩合鞣质。提取液经香草醛 -浓硫酸反应呈先沉淀后溶解 , 提取液和 1%明
胶氯化钠反应溶液变得浑浊 , 证明存在儿茶素型缩合鞣质〔5〕。植物组织在离体培养时 , 由于切割、
消毒和接种等导致细胞环境改变 , 使组织细胞产生防御性反应 , 并产生防御性物质。植物酚类多聚体
中除了木质素具防御功能外 , 还有鞣质 (单宁 ) , 鞣质有毒可以防止草食性动物的取食或真菌或细菌
引起的破坏〔7〕。松组织培养中 , 褐变的愈伤组织积累大量的鞣质〔1〕, 同时细胞间和胞质都有鞣质积
累 , 使细胞死亡。本试验结果证明褐变的外植体分泌到培养基中的物质和沉积在维管束中的成分均是
鞣质 , 且总酚含量和 PAL的活性变化呈显著正相关 , 说明蝴蝶兰外植体在褐变过程中 , 酚类进一步
聚合形成缩合鞣质 , 鞣质毒害细胞导致外植体培养失败。
参考文献 :
1　Laukkanen Hanna, Rautiainen Lea, Taulavuorl Erja. Changes in cellular structures and enzymatic activities during browning of scots p ine cal2
lus derived from mature buds. Tree Physiology, 2000, 20: 467～475
2　罗晓芳 , 田砚亭 , 姚洪军. 组织培养过程中 PPO活性和总酚含量的研究. 北京林业大学学报 , 1999, 21 (1) : 92～95
Luo X F, Tian X T, Yao H J. Polyphenol oxidase activities and phenol contents in tissue culture. Journal of Beijing Forestry University,
1999, 21 (1) : 92～95 ( in Chinese)
3　Engelsma G. On the mechanism of the changes in phenylanine ammonia2lyase activity induced by ultraviolet and blue light ingherk in hypocot2
yls. Plant Physiol. , 1974, 54 (5) : 702～705
4　A rnon D I. Copper enzymes in isolated chlorop lasts polyphenoloroxidase in B eta vulgaris. Plant Physiol. , 1949, 24: 1～15
5　谭仁祥. 植物成分分析. 北京 : 科学出版社 , 2002. 514～530
Tan R X. Analysis of p lant composition. Beijing: Science Press, 2002. 514～530 ( in Chinese)
6　陈科力 , 陈艳明. 蛇葡萄根中鞣质的分析及测定. 湖北中医杂志 , 1997, 17 (6) : 46～47
Chen K L, Chen Y M. Determ ination of tannic acid in Am pelopsis sin ica (M iq) W. T. W ang. Journal of Hubei Traditional Chinese Medi2
cine, 1997, 17 (6) : 46～47 ( in Chinese)
7　潘瑞炽. 植物生理学 (第 4版 ) . 北京 : 高等教育出版社 , 2001. 129～137
Pan R C. Plant physiology (4 th ed) . Beijing: H igher Education Press, 2001. 129～137 ( in Chinese)
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