全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2003) 01-0063-04
苜蓿抗性愈伤组织诱导的初步研究
李波1 , 李红2, 王秀丽1, 于非1
( 1. 齐齐哈尔大学生命科学与工程学院, 黑龙江 齐齐哈尔 161006;
2. 黑龙江省畜牧研究所, 黑龙江 齐齐哈尔 161000)
摘要: 以硫酸二乙酯( DES)和紫外线( UV )对准格尔苜蓿愈伤组织进行诱变处理,筛选其半致死浓度和剂量。对诱
变处理后的材料进行脯氨酸含量测定。结果表明,脯氨酸含量明显高于对照。筛选出具有抗性的苜蓿愈伤组织,为
苜蓿抗性育种提供基础材料。
关键词: 苜蓿; 愈伤组织; 硫酸二乙酯; 紫外线
中图分类号: Q813. 1　　　文献标识码: A
A Preliminary Study of Callus for Inducing
Cold Tolerance in Alfalfa Breeding
LI Bo1 , L I Hong 2, WANG Xiu-li1 , YU Fei1
( 1. Life S cien ce and Engineering Col lege, Qiqihar Un iversi ty, Qiqihar, Heilongj iang Province 161006, Chin a;
2. Heilongjiang Inst itute of Anim al Scien ce, Qiqihar, Heilon gjian g Province 161006, Ch ina)
Abstract: M S w as used as a fundamental medium for alfalfa breeding . DES and U V were successively
used for callus mutat ion and selection. Eventually, some callus show ed certain degree of cold tolerance.
Key words : Alfal fa; Callus; DES; U V
　　由于黑龙江省冬季寒冷, 适于本地区种植的牧
草非常少,急待培育具有一定抗性的牧草, 以满足今
后生产的需要。应用化学和物理方法,对苜蓿愈伤组
织进行诱变处理,以期筛选出具有一定抗性的愈伤
组织,用于苜蓿的抗性育种。
1　材料和方法
1. 1　选择籽粒饱满、有光泽的准格尔苜蓿(M edica-
go sativa L. cv. Neimeng Zhungeer)种子(由黑龙
江省畜牧研究所提供)。消毒后用无菌水冲洗, 植入
无激素 MS 固体培养基中萌发, 4 d后即可得到无菌
苗,经培养 7～10 d取出茎段( 0. 5 cm)作愈伤组织
诱导材料,接种于 MS 培养基( MS + 1 mg/ L2, 4-
D + 0. 5 mg/ L6- BA)中诱导愈伤组织 [ 1, 2] , 每天光
照 12 h,光照强度1500 Lx, 温度 25℃。接种 10 d, 长
出愈伤组织,选取白色新鲜松脆的组织,转入继代培
养基(同上) , 温度 25℃,漫射光下培养,每次继代为
半个月,继代二次即可作为诱变的材料使用。
1. 2　用 DES对愈伤组织进行诱变
将愈伤组织切成约 3 mm2 的小块, 分别转入
DES不同浓度[分别为 0. 4%、1. 0%、1. 6%、2. 2%、
2. 8% ( v / v) ]的 MS 液体培养基中,浸泡 1、1. 5和 2
h 后用 180目筛网滤出愈伤组织块,将其接种于新
鲜的 MS 固体培养基(同上) ,在 25℃下培养。诱变
实验终止时用大量的液体培养基冲洗[ 3, 4]。
收稿日期: 2002-08-22;修回日期: 2002-12-03
基金项目:黑龙江省教育委员会科研基金资助项目( 2002)
作者简介:李波( 1962-) ,女,辽宁省鞍山市人,副教授,从事牧草抗性研究,植物组织培养和细胞生物学教学与研究
第 11卷　第 1期
　Vo l. 11　　No. 1
草　地　学　报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
　2003 年　3月
　M arch 　2003

1. 3　愈伤组织的 UV辐射
切取 2 mm 见方的愈伤组织小块,接种于 MS
固体培养基中, 用 30 W 的紫外灯辐射, 将灯固定于
高 20 cm 处 [ 5] , 分别辐射 1、3、5、7、9、11、13 min,以
不辐射为对照组, 各重复 3次。
1. 4　半致死浓度和剂量测定
用荧光素双醋酸酯( FDA )和伊文思蓝溶液下
测定计数,观察死活细胞的比率[ 6] ,各重复 5次。
1. 5　测定游离脯氨酸含量
在测定样品游离脯氨酸含量时, 采用 Tro ll的
酸性茚酸酮显色法。在样品前处理(提纯和纯化脯氨
酸) ,本实验采用了磺基水杨酸法浸提样品中的游离
脯氨酸[ 7, 8]。
2　结果及分析
2. 1　硫酸二乙酯半致死浓度
从培养的细胞中筛选突变体时, 诱变剂最适剂
量的选择,不仅要考虑突变率的高低,而且还要考虑
次级损伤的大小,尤其是对再生能力影响的大小, 一
般认为适宜的诱变剂量是处理后存活率一半左右的
剂量即为半致死剂量 [ 9]。用DES诱变苜蓿的愈伤组
织, 结果处理 1. 5 h, 半致死浓度为 2. 8%( v/ v ) , 存
活率为53. 47%,接近 50% ;处理 2 h,半致死浓度为
2. 2%( v/ v ) ,存活率为 48. 25%, 也接近 50%; 而处
理 1 h, 当 DES 浓度为最大值 2. 8%( v/ v )时, 愈伤
组织细胞存活率为 69. 57% ,无法测定半致死浓度,
所以 DES 半致死浓度的测定受诱变条件和时间的
控制,诱变条件和时间不同,直接影响半致死浓度的
改变。
2. 2　UV对愈伤组织的影响
对处理后培养 21 d 的愈伤组织块进行统计(表
2)。UV 照射愈伤组织,以愈伤组织块为统计单位所
得的半致死时间为 5 min。
表 1　DES处理对愈伤组织块存活率的影响
Table 1　T he sur viv al rate o f different concentr ation of DES tr eated alfalfa callus
浸泡时间( h)
Soak tim e
DES 浓度( v / v )
DES concent ration
愈伤组织块总数(个)
Callus to tal
存活数(个)
Sur viv al individual
存活率( % )
Survival rat e
1 0 112 111 99. 11
0. 4 108 98 90. 74
1. 0 103 89 86. 40
1. 6 164 120 73. 17
2. 2 138 97 70. 29
2. 8 92 64 69. 57
1. 5 0 104 104 100
0. 4 89 80 89. 89
1. 0 120 102 85. 00
1. 6 115 83 72. 17
2. 2 147 96 65. 31
2. 8 101 54 53. 47
2 0 84 83 98. 81
0. 4 110 91 82. 73
1. 0 104 72 69. 27
1. 6 108 60 57. 41
2. 2 114 55 48. 25
2. 8 122 47 38. 25
64 草　地　学　报 第 11卷
表 2　UV对苜蓿愈伤组织块的影响
Table 2　Effect o f UV on alfa lfa callus
照射时间( m in)
I rr adiate time
CK 1 3 5 7 9 11 13
观察个数(块)
No . indiv idual obser ved
72 72 72 72 72 72 72 72
存活个数(块)
No . individual sur vived
70 62 38 37 32 31 21 11
存活率( % )
Surv iv al r ate
97. 2 86. 1 52. 8 51. 4 44. 4 43. 1 29. 2 15. 3
图 1　DES处理愈伤组织脯氨酸累积量的变化
F ig . 1　The change o f pr oline accumulated quality on DES handle of alfalfa ca llus
图 2　UV 处理愈伤组织脯氨酸含量的变化
Fig . 2　T he change of pro line cont ent on UV tr eatment alfalfa callus
2. 3　脯氨酸含量
2. 3. 1　DES处理愈伤组织脯氨酸的累积　学者对
许多材料的分析表明, 在正常情况下植物体内游离
脯氨酸含量很低。但由图 1可知, 苜蓿愈伤组织经
DES 处理后,游离脯氨酸含量明显增多。在同一处
理浓度下,随着处理时间的延续( 1、1. 5、2 h)脯氨酸
含量逐渐减少。按植物抗逆机理分析,脯氨酸含量应
随着时间的延续而累积增加[ 9～11] ,说明由于抗逆作
用所增加的脯氨酸量难以弥补因致死细胞的增多所
减少的游离脯氨酸量,故导致后面的曲线呈现下降
趋势。
65第 2期 郭　平等:四种草本植物可燃物含水率干燥时的变化规律
2. 3. 2　UV处理愈伤组织脯氨酸含量的变化　从
图 2中可以看出,经 UV 处理后的苜蓿愈伤组织脯
氨酸含量明显高于对照组,而且在半致死剂量达到
最大值, UV 处理 5 m in为 0. 217 mg / L , 7 min 为
0. 268 mg/ L , 说明苜蓿愈伤组织经 UV 处理后, 可
用以提高其抗性。
3　讨论
3. 1　适量的 DES诱变可增加愈伤组织的抗逆性
植物的抗逆性与脯氨酸含量的变化存在相关
性。通过测试诱变后愈伤组织脯氨酸含量的变化,可
以推知用硫酸二乙酯诱变苜蓿的愈伤组织可以提高
其抗逆性,但是其突变体是否能稳定遗传还要做进
一步研究。脯氨酸累积可以作为育种指标, 如果能稳
定遗传,应用 DES 诱变育种可为今后的选择抗性育
种工作奠定良好的基础。
处理时间为 1 h, 脯氨酸含量随着处理浓度的
增大而逐渐增多; 处理 1. 5 h, 在半致死浓度之前,
脯氨酸含量也随着处理浓度的增大逐渐增多, 在
DES 浓度为 2. 2%时出现一个峰值,为 0. 211 mg/
g ;在 2. 2%之后,脯氨酸含量呈下降趋势但仍比初
始值要高; 处理 2 h, 脯氨酸含量在 DES 浓度为
1. 6%时出现一个峰值( 0. 159 mg / g ) , 以后随着浓
度的增加, 脯氨酸下降幅度较大, 在半致死浓度为
2. 8%时,脯氨酸含量下降到 0. 035 mg/ g ,仅比未经
药剂处理的脯氨酸高。综上所述,考虑存活率、突变
率、抗逆性几方面因素,选择硫酸二乙酯处理浓度为
2. 2%, 时间为 2 h 是一个最佳的处理条件。
3. 2　应用 UV的优越性
物理诱变剂大都为采用各种生理射线辐射组
织、细胞, 使 DNA 分子结构变异进而筛选出突变
体。在各种物理射线中,有近 95%的是使用 X就

射线,到目前为止, U V 被用为辐射供体细胞(特别
是苜蓿)可为寥寥无几。主要原因可能是因为 UV
的穿透力太弱, 此外 UV 的可重复性不是很
好[ 4, 11～13]。但是 UV 的作用效果却是不容质疑的,
UV 造成继裂的染色体比
射线要多, U V 辐射后
发现有大量的 DNA 片段,出现的程度与使用的剂
量有关,而
射线,只有剂量为 1 kGy 时才发现有一
些 DNA 片段。
3. 3　诱变育种发展迅速,紫外线在该领域中还未得
到广泛的应用。以往用 X射线辐射供体细胞,时间
长,而且使用的仪器极为昂贵,一般的实验室尚难以
达到。而紫外线光源却很容易找到,即使在很普通的
试验室也能开展此类试验。由于紫外线穿透力较弱,
以苜蓿愈伤组织块为诱变材料的实验中愈伤组织块
应尽量小,而且要大小相同,实验采用双刀法使切取
愈伤组织在 2 mm 大小,使细胞接受辐射剂理相同。
试验中经紫外线处理的材料脯氨酸含量有明显增
加。由此可见只要应用得当,紫外线辐射不仅作用时
间短而且有较好的效果。
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66 草　地　学　报 第 11卷