全 文 ：第 18 卷
第 2 期

Vol. 18
No. 2
草
地
学
报
ACTA AGRESTIA SINICA



2010 年
3 月

Mar .

2010
苜蓿愈伤组织原生质体游离与培养
王
娟 , 李玉珠, 师尚礼*
(甘肃农业大学草业学院,草业生态系统教育部重点实验室, 中
美草地畜牧业可持续发展研究中心, 甘肃 兰州
730070)
摘要 : 对阿尔冈金苜蓿( Medicago sativa L . cv . A lgonguin)原生质体游离和培养的最佳条件进行研究, 建立其细
胞融合原生质体杂交体系。以下胚轴诱导的愈伤组织为材料, 研究了愈伤组织继代培养时间、酶液组合、酶解时间
及酶液渗透压对原生质体游离的影响,并探讨了愈伤组织原生质体在 KM 8P 培养基上的分裂情况。结果表明: 继
代 12 d 的愈伤组织游离性最好,最佳酶液组合为 2%纤维素酶+ 0. 5%果胶+ 1%半纤维素酶、最佳酶解时间为 12
h、最佳酶液渗透压为 0. 55 mo l/ L ; 最适宜培养苜蓿愈伤组织原生质体的培养基为 KM 8P+ 2. 0 mg/ L2, 4
D+ 1. 0
mg/ LNAA。
关键词:苜蓿; 愈伤组织;原生质体; 酶解条件
中图分类号: S541; Q943. 1



文献标识码: A




文章编号: 1007
0435( 2010) 02
0258
05
Dissociation and Culture of Callus Protoplasts of Medicago sativa L.
WANG Juan, LI Yu
zhu, SH I Shang
li*
( Pratacul tu ral College, Gan su Agricul tu ral Un iversity / Key Laboratory of Grassland Ecosystem, Minis t ry of Edu cat ion /
Sino
U S Centers for Graz ingland E cosystem Sustainab ilit y, Lanzh ou , Gan su Provin ce 730070, C hina)
Abstract: T he object iv es of this study were to optim ize the isolation and cultur e conditions for protoplast of
Med icago sat iv a L. cv. Algonguin and establish the cell fusion and pr otoplast hybridizat ion sy stem . Using
hypocotyls callus as tested mater ials, the influences of callus derived t ime, enzyme combinat ion, and enzy

molysis time on protoplast disso ciat ion w ere studied and the div ision of callus pro toplasts on KM 8P basic
medium was discussed. T he results show that the callus subcultured 12 days w as the opt imum free materi

al and the opt imum condit ion fo r high y ield of v iable protoplast w as as follow s: enzyme combination contai

ning 2% cellulase Onozuka R
10+ 0. 5% pect inase+ 1. 0% hemicellulase, mannito l concentr at ion at 0. 55
mol/ L, and enzymolysis time of 12 h. T he optimal medium fo r callus pro toplast cultur e w as KM8P+ 2. 0
mg/ L 2, 4
D+ 1. 0 mg/ L NAA .
Key words: M edicago sat iv a L. ; Callus; Pro toplast ; Enzymo lysis condit ion


原生质体是除去细胞壁后由质膜所包围的
裸
露细胞
, 由于除去了细胞壁, 原生质体可以摄入病
毒、细胞器、微粒体以及一些如 DNA 的大分子物
质,这为遗传物质的导入和表达研究提供了机会, 易
于进行准确的操作及转化体和重组体的分析, 脱去
细胞壁的原生质体仍然具有细胞的全能性, 在控制
条件下可再生成完整植株, 进行无性繁殖 [ 1]。原生
质融合是改变植物遗传品质的一种短期且非常有效
的生物技术,已被广泛用于苜蓿和其他牧草抗性育
种、提高干物质消化率、减少膨胀病危害、土壤生物
改良、生物疫苗及活性制剂等方面[ 2~ 4] 。目前有关
苜蓿原生质体的培养多选用叶片、子叶、叶肉、根和
悬浮细胞系分离的原生质体 [ 5~ 10] , 但愈伤组织原生
质体培养研究的报道较少, 成功者更少[ 11]。为此,
笔者对苜蓿愈伤组织原生质体的游离与培养进行了
研究,旨在探讨苜蓿愈伤组织原生质体游离和培养
的最佳条件, 以建立快速高效的苜蓿原生质体分离
体系,为进一步利用体细胞杂交、遗传转化等手段培
育新品种提供技术手段和理论依据。
紫花苜蓿 ( Med icago sativa L. )素有
牧草之
王
的美称[ 12]。其品种阿尔冈金苜蓿与普通品种相
比,具有抗寒、抗旱能力强、刈割后生长快、抗病性
高、产量高等突出特性,是北美种植最为广泛的产草
型苜蓿品种之一, 目前以它为材料进行原生质体的
研究尚未见报道。
收稿日期: 2009
11
09;修回日期: 2009
12
23
基金项目:国家科技支撑计划( 2007BAD52B06)、( 2006BAD01A19
6) ,国家牧草产业技术体系专项( chy e031231)资助
作者简介:王娟( 1984
) ,女,汉族,甘肃兰州人,硕士研究生,从事牧草种质资源方面的研究; E
mail: w angju ant ianxiezuo@ 163. com; * 通
讯作者 Author for correspondence, E
mail: shishl@ gsau. edu . cn
第 2期 王娟等:苜蓿愈伤组织原生质体游离与培养
1
材料与方法
本实验以阿尔冈金苜蓿 ( Med icago sativa L.
cv. A lgonguin)为供试材料, 种子由甘肃农业大学
草业生态系统重点实验室提供。
1. 1
适合于原生质体分离的愈伤组织细胞系的建立
取成熟种子用自来水冲洗 10 m in, 在 70%的酒
精中浸泡 2 min,无菌水洗涤 4 次; 转入 0. 1%升汞
中浸泡 10 min, 无菌水洗涤 5 次, 用无菌滤纸吸干,
接种于 MS 培养基上。将萌发 7- 8 d 的无菌苗下
胚轴切成 5 mm 长小块, 接种于 MS+ 2. 0 mg / L2,
4
D+ 1. 0 mg/ LNA A+ 2. 5 %蔗糖+ 0. 6%琼脂的
培养基中诱导愈伤组织, 选取胚性愈伤组织, 在相同
培养基上继代, 20 d继代一次,继代10- 12次后, 大
部分大颗粒淡黄色的愈伤组织转变为淡黄色松软且
易分散的小颗粒,最终成为稳定的细胞培养系,取此
类愈伤组织用于原生质体的游离。愈伤组织诱导并
继代的培养条件: 光周期 16 h、光照强度 1000 -
2000lx、温度 25
1
。
1. 2
原生质体的分离与纯化
从MS 培养基上继代培养10- 12个月后,更换
新鲜培养基培养 6- 16 d的愈伤组织细胞系中取 1
g 左右的材料,于 10 mL 混合酶解液中分离原生质
体。实验设置 5个酶液处理:
. 2%纤维素酶 Cel

lulase Onozuka R
10、0. 5%果胶酶 Pecto lase Y
23;

. 2%纤维素酶 Cellulase Onozuka R
10、0. 5%果
胶酶 Pectolase Y
23、1% 半纤维素酶 Hemicellu

lase;
. 2% 纤维素酶 Cellulase Onozuka R
10、
0. 5%果胶酶 Pecto lase Y
23、0. 3%离析酶 Macer

o zyme R
10;
. 2% 纤维素酶 Cellulase Onozuka
R
10、0. 5% 果胶酶 Pectolase Y
23、0. 3% 崩溃酶
Driselase;
. 2%纤维素酶 Cellulase Onozuka R

10、0. 5%果胶酶Pectolase Y
23、0. 3%离析酶 Mac

erozyme R
10、0. 3%崩溃酶 Driselase、0. 3%半纤维
素酶 Hemicellulase。酶溶剂为 CPW 和甘露醇
( M annitol ) 混合溶液 ( 溶解组成为 27. 2 mg/ L
KH2 PO 4、101. 0 mg / L KNO3、1480. 0 mg/ L CaCl2

2H 2O、246. 0 mg/ L M gSO 4
7H 2O、0. 16 mg/ L
KI、0. 025 mg/ L CuSO 4
5H 2O、1000 mg/ L
MES) , pH 5. 8,经 0. 45
m 微孔滤膜过滤灭菌。酶
解混合物置于 25
1
黑暗条件, 酶解前静置 30
min, 50 rpm 震荡酶解 4- 16 h, 每隔 2 h 取样在倒
置显微镜下观察原生质体的释放情况和活力, 以确
定最佳酶解时间。充分酶解后,用 200目、400 目尼
龙网过滤酶解分离的原生质体, 以500 r/ min离心5
m in,去掉上清液, 再经清洗液( CPW 溶液+ 0. 55
mol/ L 甘露醇)和原生质体培养液( KM 8P)各洗涤 2
次,得到纯化的原生质体。
1. 3
原生质体的培养
将纯化后的原生质体放于附加不同激素浓度的
KM 8P 液体培养基中进行浅层培养。以 KM8P 为
基本培养基,附加 100 mg / L 水解酪蛋白、100 mg / L
水解乳蛋白、1%蔗糖、0. 55 mo l/ L 甘露醇、1. 0 mg/
L NA A和不同浓度的 2, 4
D, pH 5. 8, 培养温度为
25
1
,暗培养, 每隔 7 d更换甘露醇浓度依次减
半的新鲜培养基, 并在倒置显微镜下观察细胞的分
裂情况。
1. 4
原生质体产量和活性的检测[ 13, 14]
取纯化原生质体悬浮液 1 mL, 滴加在血球计数
板上,显微镜下统计中央1 个大方格(随机的 5个小
格)内的原生质体总数( X) ,然后按下式计算原生质
体的产量,各处理平行测定 3 次, 取平均值。
1 mL 悬浮液中的原生质体数(个/ mL) = 1个
大方格悬浮液( 0. 1 mm3 )中的原生质体数
104

稀释倍数
原生质体存活率( %) = (染色原生质体数/原生
质体总数)
100%
原生质体的产量(个/ g ) = 原生质体的密度
(个/ mL)
原生质体悬浮液的总体积( mL) /材料
总质量( g)
2
结果与分析
2. 1
原生质体分离与纯化
2. 1. 1
适合于原生质体分离和培养的胚性愈伤组
织细胞系的建立
阿尔冈金苜蓿幼苗下胚轴培养
30 d 后, 可形成大量的愈伤组织, 诱导率 89. 7%。
选取淡黄色或鲜黄色的愈伤组织进行继代培养, 继
代时去除水渍状的愈伤组织, 继代 10- 12次后, 愈
伤组织外观呈淡黄色或鲜黄色颗粒型,质地较紧密,
光滑,用无菌水将其悬浮在倒置显微镜下观察, 此时
愈伤组织的细胞大多数为细胞质浓、等径、壁薄、核
大、分裂旺盛,最终成为稳定的细胞系(图 a)。试验
证明利用这种胚性愈伤组织能够分离出大量的原生
质体(图 6)。
2. 1. 2
不同继代培养时间对原生质体活力和产量
259
草
地
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报 第 18卷
的影响
愈伤组织的状态对原生质体的游离和培养
起到关键性的影响。在酶液 pH 5. 8、甘露醇浓度
0. 55 mol/ L、酶液组合为 2%纤维素酶+ 0. 5%果胶
酶 Y- 23+ 1%半纤维素酶的处理条件下,研究了愈
伤组织不同继代培养时间对原生质体活力的影响
(表 1)。结果表明,继代培养 12 d的愈伤组织,可获
得大量具有活力的原生质体, 有活力的原生质体产
量达 3. 34
106 个
g - 1 , 并且原生质体质浓, 在后
继的培养中易于分裂。因此, 愈伤组织最佳继代培
养天数为 12 d。
表 1
不同取材时间对原生质体分离效果的影响
Table 1
Effect of sampling time on callus protoplast iso lation
愈伤组织培养天数
Cul tu re t ime, day
原生质体产量
Protoplast yield,

106
g- 1
存活率
Viabilit y,
%
细胞碎片
Cell br eakag e
6 1. 98 73. 0 多 Many
8 2. 65 79. 3 少 A lit t le
10 3. 70 81. 9 少 A lit t le
12 3. 92 85. 3 很少 Few
14 3. 61 80. 2 少 A lit t le
16 3. 52 76. 8 很多 A lot
2. 1. 3
酶液处理组合对原生质体活力和产量的影
响
酶解结果见表 2, 酶解液的成分不同,其原生质
体的产量和活力不同,酶液
较
、
、
、
组合成
分单一,游离出的原生质体活力和产量最低; 酶液

、
、
、
处理中, 随着酶种类的增加,原生质体
的产量呈现增加的趋势, 酶液
原生质体的产量较
其他酶液都高, 但细胞破碎程度也高,较多的细胞碎
片为以后的培养增加了难度。综合考虑有活力的原
生质体产量和细胞碎片的多少,适宜的酶液配比为 2%
纤维素酶+ 0. 5%果胶酶 Y- 23+ 1%半纤维素酶。
表 2
酶液组合对愈伤组织原生质体分离效果的影响
Table 2
Effect of enzyme combination on callus protoplast isolation
酶液编号
Enzym e no.
原生质体产量
Pr otoplast yield,

106
g- 1
存活率
Viabilit y, %
细胞碎片
Cell br eakag e

2. 55 72. 0 多 Many

3. 71 86. 9 很少 Few

3. 50 83. 5 少 A lit t le

3. 43 81. 2 少 A lit t le

3. 82 75. 4 多 Many


注:酶解时间 12 h ,甘露醇浓度为 0. 55 mol/ L, pH 5. 8
Note: En zymolysis t ime: 12 h; Mannitol con cen trat ion: 0. 55
m ol
L- 1 ; pH 5. 8
2. 1. 4
酶解时间对原生质体活力和产量的影响

酶解时间过短, 则酶解出的原生质体数量达不到培
养要求的密度。时间过长, 酶制剂及其中含有的杂
质会破坏细胞膜上的蛋白物质导致原生质体活力下
降,且不利于原生质体的培养。由表 3可见:试验中
尽管随时间的延长, 原生质体产量逐渐增多且增速
加快, 酶解 12 h 时, 有活力的原生质体产量达到最
大值,为 2. 98
106 个
g- 1 ,之后原生质体产量增
加不明显,并且活力明显下降, 细胞碎片明显增多,
为保证原生质体培养阶段的成功进行,酶解 12 h 最
佳,此时原生质体数量满足培养要求,且活力较高。
表 3
酶解时间对愈伤组织原生质体分离的影响
Table 3
Effect of enzymolysis time on callus protoplast isolation
酶解时间
Enzymolysis
t ime, h
原生质体产量
Protoplast yield,

106
g- 1
存活率
Viabil ity, %
细胞碎片
Cell breakage
4 1. 73 89. 4 很少 Few
6 2. 20 87. 3 很少 Few
8 2. 74 85. 6 少 A li tt le
10 3. 16 85. 1 少 A li tt le
12 3. 52 84. 7 少 A li tt le
14 3. 60 71. 2 多 Many
16 3. 71 62. 4 很多 A lot


注:酶液组合为 2%纤维素酶+ 0. 5% 果胶酶 Y- 23+ 1. 0% 半
纤维素酶,甘露醇浓度为 0. 55 mol/ L , pH 5. 8
Note: en zyme combinat ion: 2% C ellu lose onozu ka R - 10 +
0. 5% pect inase Y- 23+ 1. 0% H emicellulase; m ann itol concent ra

t ion: 0. 55 mol
L- 1 ; pH 5. 8
2. 1. 5
混合酶液中甘露醇浓度对原生质体活力和
产量的影响
原生质体为裸露细胞, 当酶解过程中
的渗透压与细胞内渗透压不同时, 就会出现胀破或
皱缩等现象。试验表明:甘露醇浓度为 0. 55 mo l/ L
时,原生质体的产量和存活率最高, 分别是 2. 56

10
6 个
g - 1和 87. 8%。高于或低于这一浓度原生
质体产量和活力均有所下降,并且能获得边缘清晰、
形状, 大小均一、内含物多、碎片少的原生质体。因
此, 0. 55 mol/ L 的甘露醇最有利于阿尔冈金愈伤组
织原生质体分离和保持细胞的稳定性(表 4)。
表 4
甘露醇浓度对愈伤组织原生质体分离的影响
Table 4
Effect of mannito l concentr ation
on callus pro toplast iso lation
甘露醇
Mannitol
( m ol / L)
原生质体产量
Protoplast yield
(
106
g- 1 )
存活率
Viabilit y ( % )
细胞碎片
C ell breakages
0. 40 1. 02 71. 3 很多 A lot
0. 45 1. 44 80. 6 多 Many
0. 50 1. 82 85. 3 少 A li tt le
0. 55 2. 56 87. 8 很少 Few
0. 60 2. 17 82. 1 少 A li tt le
0. 65 1. 60 70. 0 多 Many


注: 酶液组合为 2%纤维素酶+ 0. 5% 果胶酶 Y- 23+ 1. 0% 半
纤维素酶, 酶解时间 12 h , pH 5. 8
Note: enzyme combin at ion: 2% cellu lose on ozuka R - 10 +
0. 5% pect inase Y- 23+ 1. 0% H emicellulase; enz ym olysis t ime: 12
h; pH 5. 8
260
第 2期 王娟等:苜蓿愈伤组织原生质体游离与培养
2. 2
KM8P培养基中不同浓度 2, 4
D 对原生质体
培养的影响
将纯化后的原生质体培养在附加不同浓度激素
的 KM8P 液体培养基中。结果显示,不同浓度的 2,
4
D对原生质体起始分裂的时间和分裂频率有明显
作用,附加 1. 0 mg/ L NAA和 1. 0 mg/ L 2, 4
D时,
培养 5 d可观察到第一次分裂,分裂频率为38. 1% ;
2, 4
D浓度 2. 0 mg / L 时, 培养 1 d 的原生质体有
30%变形, 生成再生细胞壁; 2- 3 d 可见大部分原
生质体拉长呈椭圆形; 培养 4 d产生第一次分裂(图
c) ,之后迅速进行第二次分裂(图 d) ,分裂频率高达
50. 2% ,培养 2周后可观察到不同类型的细胞团,一
种结构紧密, 有等径细胞组成(图 e) ;另一种中心为
紧密的分生细胞团, 周围是分散的细胞团(图 f) ;还
有一些细胞分裂后分开成为游离状, 然后再分裂形
成新的细胞团(图 g )。由此可见,较高的 2, 4
D浓
度可以促进分裂, 提高分裂频率。
图版说明:Plate explanation
a阿尔冈金苜蓿胚性愈伤组织 Embryogenic callus fr om M. sativ a L . cv. A l gong uin
b 从阿尔冈金胚性愈伤组织分离的原生质体 P ro toplasts isolated fr om embryogenic callus of M. sativ a L . cv. A lg onguin
c一次分裂的原生质体 1st cell division from cultured protoplastas; d 二次分裂的原生质体 2nd cell division from cultured protoplastas
e 由等径细胞组成的紧密的细胞团 Mult icellular g roup formed by cells w ith equal diameter
f 周围是分散细胞的细胞团 Multicellular gr oup sur rounded by scatt er ed cells
g 分裂后在分新细胞团 Fo rmation of new cells sub- group after cracking
3
讨论与结论
3. 1
在植物原生质体培养过程中,原生质体的来源
是植株再生的关键所在。分离原生质体的材料是否
有较高的细胞分裂、分化和形态建成潜力,决定了其
原生质体所形成的愈伤组织能否继续分化形成再生
植株[ 14] 。研究表明,采用继代12 d的胚性愈伤组织
是苜蓿原生质体游离和培养的重要环节, 当采用处
于非旺盛生长期的愈伤组织分离原生质体时, 不仅
原生质体的产量低, 而且使用这种愈伤组织培养时,
原生质体再生细胞分裂几次后停止分裂和生长。但
获得状态良好的胚性愈伤组织需要较长的时间, 因
此探讨采用何种措施来缩短继代培养的时间而获得
适合于原生质体的游离细胞系是十分必要的。
3. 2
许多学者认为,苜蓿愈伤组织的诱导和分化与
品种的基因型密切相关,有些品种有很高的分化率,
有些却很难获得再生植株 [ 15]。基因型的差异导致
了苜蓿再生体系建立过程中众多不同的表现形式,
如形成胚性愈伤的状态不同,因此,选择适宜的基因
型是建立高效、稳定遗传转化体系的必要条件。同
种苜蓿,不同品种间诱导愈伤组织和再生植株的差
异很大,即使在相同的培养条件下,也常表现出很大
的差异。因此,在选择基因型时,要广泛取材,反复
比较,严格筛选。还要借鉴组织培养和细胞培养的
经验和规律,因为这些研究已经对基因型进行了筛
选。原生质体培养的研究在这些易培养成功的基因
型上势必会有利于积累经验、总结规律,进一步取得
全面突破。
3. 3
在许多植物原生质体分离和培养的研究中,多
采用纤维素酶、崩溃酶、离析酶、果胶酶和半纤维素
261
草
地
学
报 第 18卷
酶,本实验发现, 酶液配比 2%纤维素酶+ 0. 5%果
胶酶 Y- 23+ 1. 0%半纤维素酶为最佳,可以获得大
量有活力的原生质体, 这与刘明志[ 11]、王海波[ 16] 以
苜蓿的愈伤组织为材料游离原生质体的最佳酶液组
合不同,可能是实验材料的差异所致。在已建立的
各种植物原生质体的分离体系中,适宜的酶液渗透
压分布于 0. 23- 0. 9M 的范围内[ 17] 。王彩椒( Cap

si cum annum ) 愈伤组织及番茄 ( L y cop er sic hir su

tum )叶片要求酶液甘露醇浓度为 0. 7 mo l/ L [ 18, 19] ,
哈蜜瓜( Cucumis melon )子叶及卡特兰( Cat tl eya)
叶片原生质体分离要求 0. 4 mol/ L 甘露醇的渗透压
条件[ 20, 21 ] ,而马铃薯( S olanum tuber osum )叶片与刺
五加 ( Rad ix acanthopanaci s ) 幼叶酶解要求 0. 5
mol/ L 甘露醇[ 22, 23] 。即使同是苜蓿, 白静仁[ 6] , 舒
文华 [ 7]利用叶片分离原生质体,其酶液适宜的渗透
压为 0. 6 mol/ L 甘露醇, 与本实验分离愈伤组织原
生质体要求的渗透压( 0. 55 mol/ L 甘露醇)有差异,
表明不同植物甚至同一物种不同生理状态的原生质
体供体组织所要求的渗透压条件不尽相同, 有必要
根据具体的供体组织加以确定, 以保证原生质体的
分离效果。
3. 4
培养基是离体组织细胞存活和生长最基本的
条件, 和其它的培养基相比较, KM8 P培养基中含有
大量的有机成分, 更有利于原生质体的培养。原生
质体培养 1 d后可观察到几个甚至十几个原生质体
粘连在一起。一些研究者认为, 原生质体彼此粘连
是由原生质体表面再生的纤维物质互相交联造成
的,这些纤维物质是原生质体再生壁的成分 [ 17]。细
胞壁再生是原生质体恢复完整植物细胞的过程, 研
究各种植物原生质体细胞壁再生的时间, 对于确定
原生质体融合和基因转化实验的时间具有重要意
义。已有研究结果表明, 不同植物原生质体再生壁
起始形成时间是有很大差异, 从 1. 5 h 大豆 ( G ly

cine max ) [ 24]、6 h 百合 ( L il ium ) [ 25] 至 24 h 元麦
( H or deum dist ichon ) [ 26] 不等。在本实验中, 来自
荧光染色和超微结构观察的结果均表明, 苜蓿愈伤
组织原生质体开始再生细胞壁的时间为培养后 24 h。
国内外苜蓿原生质体的培养已用于苜蓿细胞融
合与基因工程, 成为改变苜蓿遗传品质的重要内容
和主要手段,进一步完善原生质体的研究,会促进苜
蓿生物技术育种的发展。
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