全 文 ：第21卷　第2期
　Vol.21　 No.2
草　地　学　报
ACTA AGRESTIA SINICA
　　　　　2013年 3月
　 Mar.　2013
doi:10.11733/j.issn.1007-0435.2013.02.024
紫花苜蓿黄酮的提取与纯化工艺初探
王成章,文开新,史莹华,严学兵,樊文娜,杜红旗
(河南农业大学牧医工程学院,河南 郑州　450002)
摘要:为探讨紫花苜蓿(MedicagosativeL.)黄酮的提取与纯化工艺,采用不同乙醇浓度和不同pH进行提取,然后
用不同来源和型号的大孔树脂进行纯化,以得出苜蓿黄酮的最佳提取和纯化方法。结果表明:30%乙醇、水浸提
(pH为7.5)对紫花苜蓿黄酮的浸出率最高,分别为0.46%和0.49%,pH在9.0时所得提取物黄酮含量最高为
1.61%;pH为2.2~2.4时,对紫花苜蓿黄酮有最好的沉淀效果,所得沉淀物中黄酮含量为9.80%;9种型号的大
孔树脂中DS-17对乙醇提取物中紫花苜蓿黄酮有较好的分离效果,所得提取物黄酮为5.87%;在大孔树脂对碱溶
酸沉提取物中黄酮的分离中,2组试验均以 DM130的效果最好,所得分离物黄酮含量最高分别为24.25%和
29.35%。
关键词:紫花苜蓿;黄酮类化合物;提取;纯化
中图分类号:Q946.889　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1007-0435(2013)02-0365-07
ExtractionandSeparationofAlfalfaFlavonoids
WANGCheng-zhang,WENKai-xin,SHIYing-hua,YANXue-bing,FANWen-na,DUHong-qi
(ColegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou,HenanProvince450002,China)
Abstract:Tooptimizetheprocessofextractingandseparatingflavonoidsfromalfalfa,differentmethods
wereadoptedtoextractandseparatetheflavonoidssystematicaly.Resultsshowedthat30%ethanolsolu-
tionandwater(pH=7.5)hadthebesteffectonalfalfaflavonoidsextraction.Leachingefficiencyofthe
flavonoidswere0.46%and0.49%,respectively.Thehighestcontentofalfalfaflavonoidsextractedwith
waterwas1.61%whenpHwas9.0.TheoptimumpHwas2.2forseparationofalfalfaflavonoidsandthe
contentofflavonoidsintheextractivewas9.80%.Differentmacroporousresinswereusedtoseparateal-
falfaflavonoidsextractedwithethanolsolution.DS-17showedthebestseparationeffectandthecontentof
flavonoidswas5.87%.Theeffectofmacroporousresinsontheseparationofalfalfaflavonoidsextracted
byacid-isolationwasanalyzed.DM130hadthebesteffectandthehighestcontentsofalfalfaflavonoidsin
twotreatmentswere24.25%and29.35%,respectively.
Keywords:Alfalfa;Flavonoids;Extraction;Purify
　　紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是一种多年生
豆科植物,具有适应性强、生物固氮能力强、产草量
高、品质好、适口性好、营养丰富、易于家畜消化等特
点,有“牧草之王”美誉。紫花苜蓿中含有多种生物
活性成分,如苜蓿皂苷、苜蓿黄酮、苜蓿多糖等[1]。
研究表明,黄酮类有药用价值的化合物很多,这些化
合物可用于防治心脑血管疾病;许多黄酮类成分具
有止咳、祛痰、平喘及抗菌的活性,同时具有护肝、解
肝毒、抗真菌、治疗急慢性肝炎、肝硬化及抗自由基
和抗氧化作用[2]。除此之外,黄酮类化合物还具有
植物雌激素样作用,在畜牧业动物生产上,黄酮类化
合物的应用能显著提高动物生产性能,提高动物机
体抗病力,改善动物机体免疫机能[3-5]。
目前,人们对大豆(Glycinemax (L.)Merr.)、
葛根(Puerarialobata (Wild.)Ohwi.)等植物中
黄酮类化合物的提取和纯化做了大量细致的研究,
而对紫花苜蓿该类化合物提取和纯化的研究很少。
大豆中总异黄酮含量为0.48%[6],葛根中黄酮含量
为0.34%[7],而适时收获的苜蓿茎叶干物质中,黄
酮含量约为0.53%[8]。可能由于苜蓿黄酮的种类、
分子结构等与其他种类植物不同,故国内外对
紫花苜蓿黄酮的提取与纯化研究较少,而且沿用传
收稿日期:2012-09-19;修回日期:2012-11-05
基金项目:国家牧草产业技术体系(CARS-35);国家“十二五”科技支撑计划项目(2011BAD17804)资助
作者简介:王成章(1955-),男,河南南阳人,教授,主要从事牧草营养与栽培学研究,E-mail:wangchengzhang@263.net
草　地　学　报 第21卷
统的工艺提取苜蓿黄酮时,得率少,纯化困难,目前
报道的紫花苜蓿提取物中黄酮含量仅为13.69%[9],
限制了苜蓿黄酮在生产中的应用和其功能的进一步
研究。本研究的目的在于建立工艺简单、纯度高的
提取和纯化工艺,为紫花苜蓿黄酮类化合物的研究
及应用奠定基础。
1　材料与方法
1.1　试验材料
提取材料来源于河南农业大学科教试验园区种
植的紫花苜蓿,于2009年11月选择分枝期健康无
病虫害的植株,人工收割,于水泥场地晒干后,0.3
mm筛孔粉碎,备用。
1.2　主要试剂
芦丁标准品(中国药品生物制品检定所),36%
~38%盐酸、无水乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸
铝、石灰水等。除盐酸、石灰水外,其余试剂均为分
析纯。
1.3　试验方法
1.3.1　不同乙醇浓度提取紫花苜蓿黄酮　准确称
取11份紫花苜蓿草粉,每份2g,分别用0%,10%,
20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,
100%的乙醇溶液各40mL浸泡4h,每隔30min
用玻璃棒搅动一次;用定性滤纸过滤,将滤液浓缩至
无醇味,用定性滤纸过滤;然后将滤液浓缩干燥,得
棕黄色浸膏,按照绘制标准曲线的方法测定其黄酮
含量。
1.3.2　不同pH 提取紫花苜蓿黄酮　分别称取6
份5.00g的紫花苜蓿草粉,按照固液比1∶30的比
例加入去离子水,水溶液加热至90℃,然后冷却至
50℃以下,分别用4%氢氧化钠溶液调节pH 至
7.5,8.0,8.5,9.0,9.5,10.0;沸水浴煮40min,
并不断搅拌,然后用定性滤纸过滤;将滤渣按照
1∶10加沸腾的去离子水,然后搅拌、用定性滤纸过
滤,将滤液浓缩干燥,按照绘制标准曲线的方法测定
黄酮含量。
1.3.3　不同pH提取对浸膏紫花苜蓿黄酮含量的
影响　将紫花苜蓿草粉按照固液比0.025g·mL-1
的比例,pH为8.5~9.0,水煮30min;用定性滤纸
过滤,取一定量的滤液,分别调pH 至1.6,1.8,
2.0,2.2,2.4,2.6,静置12h;用定性滤纸过滤,用
去离子水将沉淀物冲洗至无色,然后用60%乙醇溶
解沉淀物;用定性滤纸过滤,分别将滤液浓缩干燥,
按照绘制标准曲线的方法测定黄酮含量。
1.3.4　大孔树脂吸附
1.3.4.1　预处理流程　将大孔树脂分别用90%乙
醇浸泡48h→去离子水冲洗至无醇味→4%盐酸溶
液浸泡4h→去离子水冲洗至中性→4%NaOH 浸
泡4h→去离子水冲洗至中性→密封4℃保存备用。
1.3.4.2　大孔树脂吸附　处理1:将本实验室用
30%乙醇提取的粗提物按照固液比0.027g·mL-1
的比例溶于60%乙醇,然后按照3∶1比例加入去
离子水,pH调至5.0,按照0.1g·mL-1的比例加
入上样液,吸附所用大孔树脂分别为:宝 AB-8,
HPD100,宝D101,三AB-8,SX-5,SX-11,FL-1,FL-
2,FL-3,海D101,DM130,DS-17,静态吸附12h,每
隔2h轻微摇动一次,使大孔树脂充分吸附。
处理2:将本实验室在pH为2.2~2.4时,酸沉
所得提取物按照固液比0.027g·mL-1的比例溶于
60%乙醇,然后按照3∶1比例加入去离子水,分别
将pH调至4.9,5.0,5.1,5.2,按照0.1g·mL-1
的比例加入上样液,吸附所用的大孔树脂分别为:
FL-2,FL-3,宝 D101,HPD-100,AB-8,海 D101,
DM130,HPD722。静态吸附12h,每隔2h轻微摇
动一次,使大孔树脂充分吸附。
处理3:将本实验室在pH为2.2~2.4时,酸沉
所得提取物按照固液比0.027g·mL-1的比例溶于
60%乙醇,然后按照3∶1比例加入去离子水,分别
将pH调至4.8,4.9,5.0,5.1,5.2,5.3,5.4,5.5,
按照0.1g·mL-1的比例加入上样液,吸附所用大
孔树脂分别为海D101,DM130和DS-17,静态吸附12
h,每隔2h轻微摇动一次,使大孔树脂充分吸附。
1.3.4.3　解吸附过程　处理1:将吸附后的大孔树
脂用去离子水冲洗至无色,然后按照0.1g·mL-1
的比例加入90%乙醇溶液,密封,30℃于摇床中50
r·min-1,12h,将解吸液浓缩干燥,按照绘制标准
曲线的方法测定黄酮含量。
处理2和处理3这2组吸附试验均采用下述
方法进行解吸附:将吸附后的大孔树脂用去离子
水冲洗至无色,然后用60%乙醇将大孔树脂进行
冲洗,至冲洗液为无色,最后按照0.1g·mL-1的
比例加入90%乙醇溶液,密封,30℃于摇床中50
r·min-1,12h,将解吸液浓缩干燥,按照绘制标准
曲线的方法测定黄酮含量。
663
第2期 王成章等:紫花苜蓿黄酮的提取与纯化工艺初探
1.4　标准曲线绘制
1.4.1　对照品溶液配制　精确称取芦丁标准品
24.7mg放入烧杯中,加入适量的60%乙醇充分溶
解,置于100mL容量瓶中,用少量的60%乙醇多次
充分润洗烧杯,润洗液倒入容量瓶中,定容。
1.4.2　标准曲线的绘制　分别准确移取0.0,1.0,
1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0mL的标准液
于25mL容量瓶中,用60%乙醇定容至5mL;加入
5%亚硝酸钠1mL,摇匀放置6min;加入10%硝酸
铝1mL,摇匀放置6min;加入4%氢氧化钠10
mL,60%乙醇定容。摇匀,放置15min,以第1份作
对照于510nm波长处测定吸光度。以吸光度A为
横坐标,溶液浓度C为纵坐标,绘制标准曲线,制定
回归方程(图1)。
图1　标准曲线图
Fig.1　Canonicalcurve
2　结果与分析
2.1　不同乙醇浓度对紫花苜蓿黄酮浸出量的影响
　　如图2所示,紫花苜蓿黄酮浸出量受乙醇浓度的
影响较大,随着乙醇浓度的升高,黄酮浸出量呈现先
上升后降低的趋势,其中使用30%~40%乙醇浓度
时,紫花苜蓿黄酮浸出量高达4.46~4.55mg·g-1。
图2　不同乙醇浓度处理的紫花苜蓿黄酮浸出量
Fig.2　Effectofdifferentethanolconcentrationontotal
flavonoidsextractedfromalfalfa
2.2　不同pH对紫花苜蓿黄酮浸出量和沉淀量的影响
　　由图3~5可知,当pH为7.5时,紫花苜蓿黄
酮浸出量最高为0.49%,而在pH为9.0时所得提
取物黄酮的含量最高为1.61%,故综合两者,在用
碱性水提取黄酮时,pH选择为9.0;在pH为2.2~
2.4时,所得最终提取物黄酮含量为9.80%~
9.61%,沉淀效果最好。
图3　不同pH对紫花苜蓿黄酮浸出量的影响
Fig.3　EffectofdifferentpHvalueonflavonoids
leachingrateextractedfromalfalfa
图4　不同pH提取对浸膏紫花苜蓿黄酮含量的影响
Fig.4　EffectofdifferentpHvalueontotal
flavonoidsextractedfromalfalfa
图5　不同酸度对紫花苜蓿黄酮沉淀效果的影响
Fig.5　EffectofdifferentpHonflavonoidsprecipitation
2.3　不同型号大孔树脂分离乙醇提取物中紫花苜
蓿黄酮的效果
　　由图6可知,9种型号的大孔树脂中,DS-17对
紫花苜蓿黄酮有较好的分离效果,解吸附后,所得粗
提物黄酮含量为5.87%。
2.4　不同pH对大孔树脂吸附紫花苜蓿黄酮性能
763
草　地　学　报 第21卷
的影响
2.4.1　第1次试验　由图7可知,总体说来,8种
型号的大孔树脂中,海D101和DM130的吸附性能
较好,解吸附后所得提取物中黄酮含量最高,分别为
17.5%和24.25%,上样pH分别为4.9和5.2。为
研究比较稳定的大孔树脂分离苜蓿黄酮的工艺,进
行验证试验,结果如图8所示。
2.4.2　验证试验　结果表明,DM130对紫花苜蓿
黄酮的吸附性能最好,在pH为5.4上样吸附后,解
吸附所得提取物黄酮含量最高达到 27.16%;
海D101表现性能也相对较好,在pH为5.1时吸附
图6　大孔树脂分离乙醇提取物中紫花苜蓿黄酮含量
Fig.6　Differentmacroporousresinsseparatedflavonidsintheethanolsolutionextractive
图7　不同pH上样对大孔树脂吸附紫花苜蓿黄酮性能的影响
Fig.7　EffectofpHonflavonoidsseparationofmacroporousresins
图8　不同pH上样对大孔树脂吸附紫花苜蓿黄酮性能的影响
Fig.8　EffectofpHonflavonoidsseparationofmacroporousresins
后,解吸附所得提取物黄酮含量最高达到19.66%。
DS-17吸附性能最差,在pH为5.0时吸附后,解吸
附所得提取物黄酮最高含量只有4.01%。
863
第2期 王成章等:紫花苜蓿黄酮的提取与纯化工艺初探
3　讨论
3.1　不同乙醇浓度对紫花苜蓿黄酮提取和纯化效
果的影响
乙醇是一种很好的溶剂,既能溶解许多无机物,
又能溶解许多有机物,所以常用乙醇来溶解植物色
素或其中的药用成分。黄酮类化合物极性广泛,部
分黄酮类化合物的羟基糖苷化后,水溶性相应加大,
而在有机溶剂中的溶解度相应减少[10]。叶绿素等
脂溶性物质易溶于乙醇等有机溶剂,而不易溶于
水[11]。研究过程中发现,当乙醇浓度≤40%时,浸
提液颜色由淡黄转为深黄色,而乙醇浓度≥50%时,
浸提液颜色为墨绿色,从而导致叶绿素溶解度增加
而黄酮的溶解度降低[12];另外,当乙醇浓度为40%
时,水溶性和醇溶性黄酮能够最大限度的溶出[13]。
研究结果表明30%~40%的乙醇浓度对紫花苜蓿
的提取效果最好,这与张咏梅等[14]的研究结果接
近。本研究还采用了微波辅助提取,这也是影响试
验结果的一个重要因素。微波提取要考虑溶剂的极
性和介质的相溶性,研究表明40%乙醇对微波有较
好的吸收性[15]。
由于叶绿素等脂溶性物质对紫外光波的吸收有
干扰,使测定结果高于实际结果[16],因此在试验过
程中必须予以除去。目前人们在提取黄酮时,大多
采用石油醚预处理样品,以除去其脂溶性物质。刘
恒蔚[17]在石油醚对香菜(Coriandrumsativum L.)
总黄酮提取前的处理研究结果表明,石油醚处理后
黄酮提取率显著高于对照。黄酮浸出率还受样品粒
度大小的影响。粒度越小,则越有利于物质的析
出[18]。
3.2　碱溶酸沉法对紫花苜蓿黄酮提取和纯化效果
的影响
黄酮类化合物因分子中多有酚羟基而呈酸性,
在碱性条件下易于溶解,在酸性条件下难溶[10],故
可用碱性水溶液进行提取[19]。在槐(Sorphoraja-
ponicaL.)米中提取芦丁的工艺为:在50~60℃下,
每次需提取20~30min,用石灰水将pH调至8~
9,酸沉时pH在4以下,静置时间为6~8h[20]。酸
沉法是初分离黄酮类化合物的重要方法。不同的材
料其分离效果有差异。刘金香等[22]采用酸沉法提
取银杏(GinkogobilobaL.)叶黄酮,酸沉pH为3.5
时,提取效果最佳[21]。采用碱溶酸沉法分离艾
(PolinumartemisiaeArgyi.)叶黄酮,酸沉pH为2
~3。通过碱提取酸沉淀法从槐花米中提取芦丁,酸
沉pH为3时,提纯率可达18.1%[23]。本研究中,
采用碱性水溶液进行提取、pH为7.5时,提取效果
较好,而pH为9时,所得提取物黄酮含量最高,因
此在提取时pH选择9;另外,随着pH的升高,提取
率下降,主要是因为碱性过强时能使黄酮母环裂解
而导致提取率降低[24];采用酸沉法提取苜蓿黄酮
时,沉淀最佳pH 为2.2,在试验过程中,加酸酸化
时,酸性过强,导致黄酮类化合物生成可溶性物质,
从而降低提取物中黄酮含量[25],因此,当pH 低于
2.2时,酸沉所得提取物黄酮含量明显下降。
3.3　大孔树脂吸附对紫花苜蓿黄酮纯化效果的影
响
大孔树脂吸附法是分离纯化黄酮类化合物的普
遍方法,吸附效果的优劣受大孔树脂的极性、孔径及
比表面积等因素的影响。黄酮类化合物因含有较多
的羟基而呈弱酸性[10],因此要选择弱极性的大孔树
脂;大孔树脂吸附是通过分子间的范德华力及氢键
而进行[26],吸附质主要是通过树脂的孔径扩散到树
脂的内表面而被吸附的[27],因此,孔径大有利于吸
附。本研究中所选用的大孔树脂中DM130对苜蓿
黄酮具有较好的分离性能,主要是由于DM130具
有较大的孔径及较高的比表面积[28]。有研究表明,
DM130 对 紫 花 杜 鹃 (Rhododendron mariae
Hance.)中黄酮类化合物有较好的分离效果,所得
分离物中黄酮的含量为78.64%[29]。通过大孔树脂
对银杏叶黄酮类化合物吸附及解吸附的研究中发
现,DM130较其他型号的大孔树脂对银杏叶黄酮类
化合物有较好的吸附及解吸附性能[28]。
3.4　pH对大孔树脂分离紫花苜蓿黄酮的影响
pH 是影响树脂纯化效果的重要因素,酸性化
合物在酸性条件下的吸附作用较强,碱性化合物在
碱性条件下吸附作用较强,黄酮类化合物由于多含
有酚羟基而显酸性,因而要达到较好的吸附效果,必
须在弱酸或酸性条件下吸附[29]。应用大孔吸附树
脂分离纯化香椿(Toonasinensis)叶总黄酮的研究
中,当上样液pH为4.0~5.5时,对其总黄酮的吸
附率大,而在中性和微酸条件下吸附率急剧下
降[30]。在大孔树脂对野菊花(Chrysanthemumin-
dicum L.)总黄酮吸附分离特性的影响研究中,
XDA-1大孔树脂吸附野菊花总黄酮较适的pH 为
4~5[31]。在大孔树脂对槐花总黄酮的吸附分离性
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能研究中,在pH值4.5时达到最高点,之后吸附量
急剧下降[32]。随着pH的升高,黄酮类化合物有离
子化趋势[33],从而降低了大孔树脂对黄酮的吸附
性。本研究吸附最佳pH 为5.4,所得提取物黄酮
含量达到30%左右,而朱宇旌等[9]采用树脂吸附与
溶剂 萃 取 使 紫 花 苜 蓿 提 取 物 黄 酮 含 量 达 到
13.69%。总的来说,随着pH 值的变化,提取物中
黄酮含量也有较大波动。其原因可能是:① 溶液
pH变化可以改变有效成分在溶液中存在的形式;
② 溶液pH改变可以影响有效成分在溶液中的溶
解度,通常一种物质在某种溶剂中溶解度大,树脂对
其吸附力就弱,故应选用对被分离成分溶解度小的
溶剂作为吸附溶剂;③ 溶液pH值变化改变溶液极
性,影响有效成分和大孔吸附树脂间的分子间作用
力,从而影响大孔树脂的吸附性。
3.5　紫花苜蓿及其提取物中黄酮含量对其分离效
果的影响
黄酮类化合物含量较高的材料直接采用大孔树
脂对其进行分离纯化的研究较多,而且效果较好,但
采用酸沉分离法与大孔树脂结合分离纯化黄酮类化
合物的研究报道较少。本研究结果表明:采用大孔
树脂直接分离苜蓿醇或水提取物中黄酮效果不明
显,分离后所得提取物黄酮含量只有5.87%,而大
孔树脂结合碱溶酸沉法对分离苜蓿黄酮有较好的效
果,所得提取物黄酮含量能达到30%左右。这主要
是由于所要分离的提取物中黄酮含量不同而致。银
杏叶总黄酮含量为8.84mg·g-1[34],采用树脂吸
附分离时,其含量为24%[35]。红三叶(Trifolium
pratenseL.)干草中黄酮类化合物的含量为18.09
mg·g-1,用碱溶法浸提所得的提取物中黄酮含量
为5.13%,采用大孔吸附树脂对其纯化得到的红三
叶黄酮类化合物的纯度为25%[36]。张雪辉等测得
甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)中黄酮类化合
物的含量为4.2%~4.4%[37],采用大孔树脂对甘草
提取物中黄酮类化合物进行分离,所得分离物中黄
酮类化合物的含量达到21.9%[38]。用树脂吸附法
对芝麻(Sesamumindicum L.)叶总黄酮进行纯化
可得到纯度为31.6%的浸膏[39]。采用 HZ-806大
孔树脂对荷(NelumbonuciferaGatren.)叶黄酮进
行分离,分离后所得产物黄酮含量达到61.91%,分
离效果明显[40]。紫花苜蓿中黄酮含量约为 5
mg·g-1,40%乙醇提取时,所得提取物黄酮含量在
1.6%左右,大孔树脂吸附后,分离物黄酮含量最高
为5.87%,纯化分离效果不明显。
本研究比较系统地研究了紫花苜蓿黄酮提取与
纯化工艺,改善了研究工艺,较大幅度地提高了紫花
苜蓿提取物黄酮的含量,首次将碱溶酸沉法应用到
紫花苜蓿黄酮的提取与纯化研究中,且取得了较为
理想的工艺参数。
4　结论
采用乙醇溶液浸提紫花苜蓿黄酮最适乙醇浓度
为30%~40%;pH为7.5时,水浸提对紫花苜蓿黄
酮的浸出率最高;pH在9.0时,水浸提所得提取物
黄酮含量最高;pH 为2.2~2.4时,对紫花苜蓿黄
酮有较好的沉淀效果。所选用的大孔树脂中,DS-
17对乙醇提取物中紫花苜蓿黄酮有较好的分离效
果,DM130对酸沉提取物中黄酮的分离效果最好。
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(责任编辑　李美娟)
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