全 文 ：第 17 卷
第 4 期

Vol. 17
No . 4
草
地
学
报
ACTA AGRESTIA SINICA



2009 年
7 月

Jul.

2009
多花黑麦草种子外植体组织培养灭菌方法研究
刘占彬 , 袁庆华*
(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京
100193)
摘要 :针对多花黑麦草组织培养中的污染问题, 以多花黑麦草成熟种子为外植体,进行组织培养, 将组培过程中的
污染物进行纯化培养、鉴定, 并对组织培养中降低污染的措施进行研究。结果显示: 青霉菌、曲霉菌、木霉菌、毛霉
菌、根霉菌、肠杆菌、假单孢菌是引起多花黑麦草组织培养污染的主要微生物 ;效果最好的外植体灭菌方法是用洗
涤剂混合液浸泡种子 6 h, 然后 75%乙醇表面灭菌 2 min,再用 0. 1%次氯酸钠进行 1 h 浸泡灭菌;培养基中添加 70
mg/ L 制霉菌素, 10 mg/ L 氨苄西林钠和 0. 1%次氯酸钠, 可以很好地控制污染, 并且 2种方法对材料分化的影响都
很小。
关键词:多花黑麦草、组织培养、污染、抑菌、杀菌剂、种子、外植体
中图分类号: S330. 29




文献标识码: A




文章编号: 1007
0435( 2009) 04
0474
06
Study on the Sterilization Methods in Tissue Culture of Italian Ryegrass Seed Explant
LIU Zhan
bin, YUAN Qing
hua*
( Inst itute of Animal S cien ce, Chinese Academy of Agricultu ral Sciences, Beijin g 100193, China)
Abstract: According to the po llut ion pr oblems in tissue culture of Italian ryegr ass seed explants, tissue cul

ture w as carried out by this study using the mature seeds of Italian ry eg rass as explants. The po llutants
from tissue cultur e w ere purified and cultured and the methods of decreasing pol lut ion w ere studied. The
results show that P enicil l ium, A sp ergi l lus, T r ichoderma, Mucor, Rhiz op us, Enter obacter , and Pseudo

monas wer e the main microbes harassing the t issue culture of Italian ryegr ass. The best ster ilizat ion meth

od o f explants w as to immerse the seeds in soapsuds for 6 hours, and then sur face sterilizat ion for 2 m i

nutes by alcohol ( concentration 75% ) , and at last so ak in the sodium hypochlorite ( 0. 1%) for 1 hour.
The r esults also indicate that adding 70 mg/ L ny statin, 20 mg/ L ampicil lin sodium, and 0. 1% sodium hy

pochlorite to the culture medium could contr ol the po llut ion problem effect ively. T he tw o methods above
had lit t le inf luence on the different iat ion o f materials.
Key words: Italian ryegr ass; T issue culture; Pollution; Fungicide; Antibiot ic; Seed; Explant


多花黑麦草( L ol ium mult if lor um Lam. )又名
意大利黑麦草, 是禾本科黑麦属中具有重要栽培价
值的优良牧草之一, 其茎叶柔嫩,适口性好并且品质
优良[ 1] 。然而, 与许多其它禾草相比, 该草抗旱性
弱、抗病虫能力差 [ 2] , 为了提高多花黑麦草的抗旱、
抗病虫能力,将抗性基因转到多花黑麦体内, 需要进
行转基因工程研究,转基因工程的前提和基础是解
决多花黑麦草组织培养的技术问题。目前国内对多
花黑麦草组织培养的研究主要集中在外植体的筛选
及培养基的配比上 [ 3, 4] , 而对组织培养中污染率的
控制缺少研究。国外关于组织培养中污染控制的研
究集中在抗生素对微生物的控制上[ 5~ 8] , 而使用混
合灭菌剂控制污染的研究尚无报道。种子诱导愈伤
组织污染在植物组织培养过程中是一个很普遍的现
象,如何控制组培过程中的污染是关系到实验成败
的关键。本试验针对多花黑麦草种子愈伤组织培养
过程中经常遇到的污染问题,设计了不同的灭菌方
法,对引起污染的主要微生物和抑制微生物生长的
抑菌剂进行了初步研究, 以期能得到适合多花黑麦
草组织培养的灭菌方式,提高组织培养的成功率,为
多花黑麦草转基因工程奠定基础。
收稿日期: 2008
10
29;修回日期: 2009
04
23
基金项目:国家 863项目( 2006AA10Z126)
作者简介:刘占彬( 1984
) ,男,河北沧州人, 硕士研究生, 研究方向为牧草种质资源, E
mail : afen g541888@ yah oo. com. cn; * 通讯作者
Auth or for correspon dence, E
m ail : yuanqinghu a@ hotmail. com
第 4期 刘占彬等:多花黑麦草种子外植体组织培养灭菌方法研究
1
材料与方法
1. 1
试验材料
植物材料: 以多花黑麦草品种巴莫特拉 ( L .
mul t if lorum cv. Barmultr a, 1983, 原产地: 荷兰)的
成熟种子为外植体进行组织培养。
化学试剂: 制霉菌素 ( Nystat in )、灰黄霉素
( Griseofulv in)、氨苄西林钠( Ampicil lin)、新硫酸链
霉素( Str eptomycin Sulfate) (购于上海生物工程技
术服务有限公司)、次氯酸钠( Sodium hypochlor ite)
(液态分析纯,购于北京广达横益生物有限公司)。
1. 2
微生物的分离鉴定
细菌的分离鉴定:将污染材料中的细菌采用平
板划线分离法进行分离, 培养基采用牛肉膏蛋白胨
培养基, 28
的恒温培养箱中培养 2 d后, 选取单菌
落用划线法进行三次纯化 [ 9]。根据形态特征及菌落
特点,参照
伯杰氏细菌鉴定手册
和
常见细菌系统
鉴定手册
进行鉴定。
真菌的分离鉴定:从真菌菌落边缘挑取菌丝体
进行移植培养,培养基采用马铃薯葡萄糖培养基,然
后采用方中达标出引用参考文献的稀释纯化法进行
纯化,然后再移植到马铃薯葡萄糖培养基上培养,
28
的恒温培养箱中培养 2 d[ 9]。挑取纯化后单菌
落的菌丝体及孢子在显微镜下进行观察, 再结合菌
落形态,依据
真菌鉴定手册
对其进行鉴定。
1. 3
抑菌试验
对获得的 7 种菌进行抑菌试验。采用抑菌环
法[ 1 0]测定各种杀菌剂的抑菌效果。细菌取 0. 5 mL
对数期菌悬液, 真菌将孢子悬浮液稀释到 102
cfu/ mL,取 0. 5 mL 的悬浮液加入到 50
左右的培
养基中,混匀后倾到平板。
用无菌镊子取半径 0. 5 cm 的圆形无菌滤纸片,
分别浸泡在杀菌剂溶液中(表 1) ,然后将在制霉菌
素、灰黄霉素、次氯酸钠中浸泡过的滤纸置于混有真
菌孢子的培养基表面, 在氨苄西林钠、新硫酸链霉
素、次氯酸钠中浸泡过的滤纸置于细菌菌液的培养
基表面。每组设 3个重复,于 25
生长箱中培养5 d
后观察结果, 如有抑菌作用, 则滤纸片周围无菌生
长,形成抑菌环,根据抑菌环大小,判断抑菌效果。
表 1
杀菌剂的浓度水平
Table 1
Concent ration level of the fung icide
浓度水平
Concent ration level
制霉菌素 mg/ L
Nystat in
灰黄霉素 mg/ L
Griseofulvin
氨苄西林钠 mg/ L
Ampicil lin
新硫酸链霉素 mg/ L
St reptom ycin sulfate
次氯酸钠
S odium hypochlorite
1 20 20 10 10 0. 1%
2 50 50 20 20 0. 5%
3 70 70 50 50 2%
1. 4
外植体灭菌试验
将多花黑麦草外植体表面灭菌分成 3个步骤,
即洗涤剂混合液(普通家用洗涤剂与水以 1
50 混
合)处理、75%乙醇处理和 0. 1%次氯酸钠处理, 各
步骤又分成 3个不同处理时间, 按正交实验设计原
理 L 9 ( 34 ) [ 11] , 配成 9组不同的试验组合(表 2) , 每
组试验设置 3个重复。将灭菌后的外植体进行常规
培养, 30 d后统计污染率,分化培养后统计分化率。
表 2
外植体表面灭菌因素水平表
Table 2
Factor s and levels of the explant surface disinfect ion experiment
水平
Level
因素
Factor 洗涤剂混合液处理( h )
Detergen t mixtur e tr eatm ent
75%乙醇处理( min)
75% alcohol t reatment
0. 1%次氯酸钠处理( h )
0. 1% sodium hypoch lorite t reatment
1 0 0 0
2 6 1 1
3 12 2 2
1. 5
混合杀菌剂的组培试验
从抑菌试验中选出 3种抑菌效果好的杀菌剂,
组成混合杀菌剂, 试验采用 L9( 43 )的正交设计(表
3)。设置一对照组,每组试验 3个重复。接种 30 d
统计污染率,分化培养后,统计分化率。
2
结果与分析
2. 1
微生物的鉴定结果
通过对组织培养中污染杂菌的培养观察,并通
过纯化鉴定, 共获得5种真菌和2种细菌, 真菌有:
475
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报 第 17卷
表 3
混合杀菌剂因素水平表
T able 3
T he facto rs and levels of the mixed fungicide
水平
Level
因素 Factor
制霉菌素m g/ L
Nystat in
氨苄西林钠 mg/ L
Ampicil lin
次氯酸钠
Sodium hypochlorite
1 20 10 0. 1%
2 50 20 0. 5%
3 70 50 2%
青霉菌、曲霉菌、木霉菌、毛霉菌和根霉菌;细菌是肠
杆菌和假单孢菌。
2. 2
抑菌试验结果
从抑菌试验结果(表 4)可以看出除曲霉菌外,
制霉菌素对青霉菌、木霉菌、毛霉菌及根霉菌的抑制
效果显著高于灰黄霉素。氨苄西林钠对细菌的抑制
效果要好于新硫酸链霉素,次氯酸钠对细菌和真菌
都具有很好抑制作用。随着浓度的增加, 抑制效果
增强,但是选择杀菌剂浓度时应考虑对愈伤组织形
成的影响。不同抑菌剂具有不同抑菌谱, 任何一种
抑菌剂不可能对所有病菌都有效, 因此我们选择 3
种抑菌效果相对较好的抑菌剂: 制霉菌素、氨苄西林
钠和次氯酸钠组成混合抑菌剂, 并添加到培养基中
进行抑菌实验。
表 4
5 种抑菌剂抑菌效果
Table 4
Ant ibacter ial effect o f five kinds o f bacter iostats
抑菌剂
Bacteriostat
浓度
Concent rat ion
真菌 Fungus
青霉菌
Penicill ium
曲霉菌
A spergil lus
木霉菌
T richoderma
毛霉菌
Mucor
根霉菌
Rhiz opu s
细菌 Bacterium
肠杆菌
Enterob acter
假单孢菌
Pseudomonas
制霉菌素
Nystat in
20 mg/ L + - + + -
50 mg/ L + + - + + + -
70 mg/ L + + + + + + + + +
灰黄霉素
Gris eofulvin
20 mg/ L - + - - -
50 mg/ L + + + - - -
70 mg/ L + + + + - + -
氨苄西林钠
Ampicill in
10 mg/ L + + -
20 mg/ L + + +
50 mg/ L + + + + +
新硫酸链霉素
S t reptomycin S ulfate
10 mg/ L - -
20 mg/ L - +
50 mg/ L + + + +
次氯酸钠
S odium hypochlorite
0. 1% + + + + - - + +
0. 5% + + + + + + - + + +
2% + + + + + + + + + + - + + +


注:表中+ + + 代表培养皿中无菌生长, + + 代表抑菌环直径 3 cm 以上, + 表示抑菌环直径 1~ 3 cm, - 表示无抑菌效果
Note: + + + denotes no bacteria or fu ngi grow th; + + den otes in hibit ion z one diam eter is more than 3 cm; + denotes in hibit ion z on e di

ameter is 1~ 3 cm ; - den otes no ant ibacterial ef fect
2. 3
外植体灭菌试验结果分析
从多花黑麦草外植体表面灭菌不同处理因素及
试验组合中显然可以看出(表 5) , 未进行表面灭菌
处理的试验组合 1,外植体的污染率为 50. 4% ,达到
最高水平,其相应的分化率较低, 只有 11. 2%。通
过对 3个因素(洗涤剂混合液浸泡处理、75%乙醇处
理、0. 1%次氯酸钠处理)及每个因素的不同处理时
间的组合分析, 并根据 3个均值求其极差,分别得到
的极差是 6. 10、2. 40和 13. 00(表 5) ,说明0. 1%次
氯酸钠处理对外植体灭菌效果的影响最大, 其次是
洗涤剂混合液浸泡处理, 75%乙醇处理的极差只有
2. 4,比空列 2. 67 还小, 说明 75%乙醇处理的时间
长短对外植体的灭菌效果影响不大。外植体处理时
间的长短对污染率有不同的影响, 由于乙醇处理的
极差小于空列,因此对试验其他两个处理的污染率
结果进行方差分析(表 5) , 可以看出, 0. 1%次氯酸
钠处理中, 0 h处理与 1 h和 2 h 处理后的污染率差
异达到显著水平, 1 h与 2 h处理的污染率未达到显
著水平,说明次氯酸钠处理对减低污染率作用明显,
但处理一定时间( 1 h)后,污染率则不再变化。
476
第 4期 刘占彬等:多花黑麦草种子外植体组织培养灭菌方法研究
组织培养的最终目的是得到组培苗,因此分化
率是组培中很重要的一个考察指标, 从表 5的组培
分化率的极差值可以看出, 0. 1%次氯酸钠处理对外
植体分化率影响最大, 其次是洗涤剂混合液浸泡处
理,影响最小的是 75%乙醇处理。通过对均值的分
析可以看出,洗涤剂混合液浸泡处理中,浸泡 6 h 分
化率最高;乙醇处理中 2 min处理得到最高的分化
率;在次氯酸钠处理中, 1 h 杀菌得到最高的分化
率,从方差分析可以看出,次氯酸钠处理中 3个水平
间分化率结果的差异达到显著水平, 其中处理 1 h
与其他两个水平差异达到极显著水平, 说明 1 h 次
氯酸钠处理降低组培过程的污染率, 同时未对组织
内部结果造成太大损伤, 因此分化率要高于其他两
个水平。通过对各组合因素及不同处理时间污染率
和组培分化率的综合分析,得知最佳的外植体灭菌
组合是用洗涤剂混合液浸泡 6 h, 然后用 75%乙醇
表面灭菌 2 m in,再在 0. 1%次氯酸钠浸泡灭菌 1 h。
表 5
外植体表面杀菌试验结果
T able 5
Result o f explant surface disinfection experiment
试验组合
Experimental
comb inat ion
洗涤剂混合液浸泡处理
Detergent m ixture
t reatment
75%乙醇处理
75% Alcohol
t reatmen t
0. 1%次氯酸钠处理
0. 1% sodium
hypochlorite t reatm ent
空列
Empty
污染率%
Pollu tion rate
分化率%
Differ ent iation
rate
1 1( 0 h) 1( 0 m in) 1( 0 h) 1 50. 4 11. 2
2 1 2( 1 m in) 2( 1 h) 2 32. 5 25. 4
3 1 3( 2 m in) 3( 2 h) 3 37. 7 21. 7
4 2( 6 h) 1 2 3 28. 3 22. 9
5 2 2 3 1 32. 2 19. 1
6 2 3 1 2 41. 8 20. 2
7 3( 12 h) 1 3 2 32. 7 13. 5
8 3 2 1 1 42. 4 8. 3
9 3 3 2 3 34. 8 17. 4
污染率
Pollut ion rate
均值 1
M ean 1
40. 20 37. 13 44. 87a 39. 13
均值 2
M ean 2
34. 10 35. 70 31. 87 b 35. 67
均值 3
M ean 3
36. 63 38. 10 34. 20 b 36. 13
极差
Range
6. 10 2. 40 13. 00 3. 00
分化率
Dif ferent iat ion rate
均值 1
M ean 1
19. 43 15. 87 13. 23Aa 15. 90
均值 2
M ean 2
20. 73 17. 60 21. 90Bc 19. 70
均值 3
M ean 3
13. 07 19. 77 18. 10Ab 17. 63
极差
Range
7. 67 3. 90 8. 67 3. 80


注:小写字母不同者差异显著( P< 0. 05) ,大写字母不同者表示差异极显著( P< 0. 01)
Note: Mean s w ith diff er ent small or capital letters are sign ificant ly diff erent at th e 0. 05 level or ex t reme
s ignif ican tly dif feren t at the 0. 01
level, respect ively
2. 4
混合杀菌剂试验结果分析
表 6中列出了 10组试验的污染率和分化率数
据,从表中显然可以看出对照(不填加任何杀菌剂)
的污染率明显高于添加杀菌剂的其它 9个试验组
合,其分化率也最低, 只有 2. 3%, 说明杀菌剂的添
加对组织培养过程中的污染具有良好的控制作用。
从污染率的 3组均值可以看出, 随着杀菌剂浓度的
增加, 污染率下降。但不同杀菌剂组合对外植体的
分化率影响不同(表 6) , 从分化率的极差值可以看
出次氯酸钠对分化率的影响最大,极差值为 13. 23,
而制霉菌素和氨苄西林钠的影响则较小, 极差值分
别为 5. 17和 0. 70, 由于氨苄西林钠的污染率和分
化率的两个极差都小于空列,说明氨苄西林钠的填
加对外植体的影响极小, 做为试验误差可以忽略不
计,因此只对制霉菌素及次氯酸钠两组数据进行方
差分析。从表 6 中可以看出, 制霉菌素浓度为 70
mg/ L 时污染率显著( P< 0. 05)低于其他两个浓度,
而分化率则没有显著差异。次氯酸钠浓度水平的改
477
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变对外植体污染率的影响达到显著水平 ( P <
0. 05) ,次氯酸钠不同浓度水平对多花黑麦草分化率
的影响达到了极显著水平 ( P< 0. 01) , 所以在选择
杀菌剂浓度时次氯酸钠对分化率的影响也是很重要
的,虽然 0. 1%的次氯酸钠的污染率显然高于其他
两个浓度( 0. 5%、2% ) ,但是分化率也明显高于其他
两个浓度,因此本试验选择 0. 1%的次氯酸钠浓度,
同样可以起到很好的抑菌作用, 又不至于过高浓度
对组织造成很大损伤。综合考虑各方面因素的影
响,最终杀菌剂组合方案为: 在培养基中添加 70
mg/ L 的制霉菌素、10 mg/ L 氨苄西林钠和 0. 1%次
氯酸钠。
表 6
混合杀菌剂组培试验结果
Table 6
The result o f the mixed sterilization experiment
杀菌剂试验
Bacter icide ex perim ent
制霉菌素
Ny stat in mg/ L
氨苄西林钠
Am picillin mg/ L
次氯酸钠
Sodium hypochlorite
空列
Empty
污染率
Pollu tion rate %
分化率
Differ ent iation rate %
CK 0 0 0 85 2. 3
1 1( 20 m g/ L) 1( 10 mg/ L) 1( 0. 1% ) 1 40. 3 20. 1
2 1 2( 20 mg/ L) 2( 0. 5% ) 2 38. 5 15. 4
3 1 3( 50 mg/ L) 3( 2% ) 3 19. 8 4. 9
4 2( 50 m g/ L) 1 2 3 28. 5 13. 5
5 2 2 3 1 17. 4 7. 3
6 2 3 1 2 39. 6 24. 7
7 3( 70 m g/ L) 1 3 2 17. 7 15. 5
8 3 2 1 1 32. 5 22. 6
9 3 3 2 3 24. 9 17. 8
污染率
Pollut ion rate
均值 1
M ean 1
32. 87a 28. 83 37. 47a 27. 53
均值 2
M ean 2
28. 50a 29. 47 30. 63b 31. 93
均值 3
M ean 3
25. 03b 28. 10 18. 3
26. 93
极差
Range
7. 83 1. 37 19. 17 5. 00
分化率
Dif ferent iat ion rate
均值 1
M ean 1
13. 47a 16. 37 22. 47A 15. 07
均值 2
M ean 2
15. 17a 15. 10 15. 57B 18. 53
均值 3
M ean 3
18. 63a 15. 80 9. 23C 13. 67
极差
Range
5. 17 0. 70 13. 23 4. 87


注:小写字母不同者差异显著( P< 0. 05) ,大写字母不同者表示差异极显著( P< 0. 01)
Note: Mean s w ith diff er ent small or capital letters are sign ificant ly diff erent at th e 0. 05 level or ex t reme
s ignif ican tly dif feren t at the 0. 01
level, respect ively
3
讨论
3. 1
试验结果表明,组织培养中的污染物主要来自
以下几个途径: 空气中污染物(肠杆菌、芽孢杆菌、曲
霉菌)、试验器具上的污染物(曲霉菌、根霉菌、毛霉
菌)、外植体表面污染物以及内生真菌(木霉菌、假单
胞菌等) , 对于前两种污染可以通过加强无菌意识,
提高无菌操作各环节的技术规程,同时注重无菌操
作训练,提高操作水平达到减少污染的目的。而第
三种则必须采取特定的杀菌和抑菌措施才能达到减
少和抑制微生物污染的效果[ 12, 13] 。
3. 2
由于各种杀菌剂都有一定的抑菌谱,任何一种
杀菌剂不可能对所有的病菌都有效, 如本试验中选
用的 5种杀菌剂多数只对真菌和细菌中的一种有效
果,而且对不同种的真菌和细菌的抑制作用也不尽
相同,因此采用混合杀菌剂来控制外植体的污染,是
非常有效的方法, 这与刘静等 [ 14] 的试验结果一致。
杀菌剂种类及配比浓度因植物材料不同或外植体的
部位不同杀菌效果不同,可根据具体情况进行研究,
来确定最佳的杀菌剂组合。
3. 3
外植体的表面灭菌是组织培养的第一步, 也是
至关重要的一步, 灭菌过程中因药液直接接触材料,
478
第 4期 刘占彬等:多花黑麦草种子外植体组织培养灭菌方法研究
药液对材料的刺激是短时间的,副作用相对较小, 并
且方法简单,灭菌效果也来得直接,所以表面灭菌是
非常好的方法; 同时,在进行表面灭菌的过程中因未
给病菌提供良好的生长条件也限制了微生物的繁殖
与生长,抑菌效果好。Reust le等在葡萄的组织培养
的研究中得到相同的结论[ 15]。当然, 在表面杀菌剂
的选择过程中, 杀菌剂对材料的伤害是不可忽视的,
升汞虽然有很强的杀菌效果但由于其毒性过大, 在
灭菌过程损坏了种子的内部结构,残留的汞会抑制
IAA 对细胞壁的影响和幼苗生长 [ 16] ,同时也会对实
验员和环境产生影响, 因此本试验采用了毒性较小
的次氯酸钠,同样有很好的效果。
4. 4
在培养基中添加杀菌剂是组织培养中很常用
的抑菌手段,但是因其杀菌剂的作用时间较长,因此
对植物组织的影响也较为复杂, 应该通过反复的试
验来确定杀菌剂的最佳组合, 杀菌剂对外植体产生
最小的影响。Poulsen在苹果砧 M26分裂组织培养
过程中微生物消除污染时, 在培养基中加入氨中噻
肟和头孢菌素可以消除革蓝氏阳性菌 [ 5] ; F isse等用
头孢菌素和链霉素消除观赏的毒性植物外植体中内
生菌也非常有效 [ 6] ;本试验中值得注意的是制霉菌
素随着浓度的增大分化率却增大,这似乎与上面提
到的分化率下降相矛盾, 可能的原因是制霉菌素对
组织没有产生很大的伤害, 但同时却很好的控制了
污染,所以使分化率有所提高,当然试验误差也可能
是产生这种结果的原因。最终本试验得到的一整套
灭菌方法,经过多次试验后,证明完全适用于多花黑
麦草的组织培养,同时也为类似植物组织培养提供
了参考依据。
4
结论
适合于多花黑麦草的灭菌方式是: 用洗涤剂混
合液浸泡种子 6 h,然后 75%乙醇表面灭菌 2 m in,
再用 0. 1%次氯酸钠进行 1 h 浸泡灭菌;培养基中添
加 70 mg/ L 制霉菌素, 10 mg/ L 氨苄西林钠和 0.
1%次氯酸钠。
参考文献
[ 1]
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