全 文 ：第21卷 第4期
Vol.21 No.4
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2013年 7月
July 2013
doi:10.11733/j.issn.1007-0435.2013.04.021
苜蓿原生质体电融合适宜条件的筛选
张凌云,师尚礼*
(甘肃农业大学草业学院 草业生态系统教育部重点实验室 中-美草地畜牧业可持续发展研究中心,甘肃 兰州 730070)
摘要:为改良培育苜蓿(Medicago)新品种,拟建立苜蓿原生质体融合体系。通过电融合方法,使俄罗斯杂花苜蓿
(M.varia)原生质体和甘农4号紫花苜蓿(M.sativa‘GannongNo.4’)原生质体进行非对称融合,获得了杂交细
胞,研究不同失活处理条件、电场条件、原生质体密度对苜蓿原生质体融合的影响。结果表明:经过紫外灯辐射5
min的俄罗斯杂花苜蓿原生质体和6mmol·L-1IOA处理的甘农4号紫花苜蓿原生质体,密度调至3×105~5×
105个·mL-1,以交流电场强度15~20V·cm-1、交流频率2000~2500kHz,直流脉冲场强200~250V·cm-1、
脉冲宽幅40μs、脉冲个数为3的条件为最适电融合条件,此时一对一有效融合率最高可达13.8%。
关键字:苜蓿;原生质体;细胞融合;电融合;适宜条件
中图分类号:S336;Q813.2 文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2013)04-0769-07
SelectingtheElectrofusionConditionofAlfalfaProtoplast
ZHANGLing-yun,SHIShang-li*
(PrataculturalColege,GansuAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,Ministryof
Education/Sino-USCentersforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou,GansuProvince730070,China)
Abstract:ThesomatichybridizationofasymmetricfusionbetweenprotoplastsisolatedfromcalusofRus-
sianvariegatedalfalfaand ‘GannongNo.4’alfalfawasobtainedthroughelectrofusionmethod.The
effectsofdifferentinactivationpretreatments,electricfieldconditionsandprotoplastdensitiesonalfalfa
protoplastfusionwerestudied.Testresultsshowedthattheoptimuminactivationpretreatmentswerethat
Russianvariegatedalfalfaprotoplastwastreatedwithultravioletradiationby5minand‘GannongNo.4’
alfalfaprotoplastwastreatedwith6mmol·L-1iodoacetamide.Theoptimumelectrofusionparameters
wereACelectricfieldintensityfor15~20V·cm-1,frequencyfor2000~2500kHz,DCelectricfieldintensity
for200~250V·cm-1,pulsewidthfor40μsandpulse3times.Theoptimumprotoplastdensityis3×105~5×
105mL-1.Thehighestprotoplastbinaryfusionfrequencyreached13.8%withaboveconditions.
Keyword:Alfalfa;Protoplast;Celfusion;Electrofusion;Optimumcondition
体细胞杂交技术又称为原生质体融合[1-2],是原
生质体在化学或物理条件下进行融合而获得杂交体
细胞的过程,也是获得植物不同种、属、科之间杂交
体细胞,形成远缘遗传物质交流,实现优良品种之间
重组改良,克服有性杂交不亲和屏障的重要育种手
段[3-4]。
苜蓿(Medicago)是牧草生产和蛋白质饲料来
源的重要组成部分[5],对苜蓿的生物技术研究始于
20世纪60年代[6-7],并由离体组织培养和原生质体
再生植株培养[8-13]逐渐转向利用转基因和细胞融合
等技术来培养新品种[14-19]等方面。国外最早由
Téoulé[20]研究获得了紫花苜蓿(Medicagosativa
L.)和黄花苜蓿(M.falcataL.)体细胞杂种植株的
组合,而国内自徐子勤等[21]研究获得苜蓿和红豆草
(Onobrychisviciaefolia)的属间体细胞杂种植株
后,苜蓿体细胞杂交的研究蓬勃兴起。金红[16]以沙
打旺(Astragalusadsurgens)与紫花苜蓿进行属间
体细胞杂交,并获得杂种小苗;张改娜等[17]研究获
得骆驼刺(Alhagipseudal)和鹰嘴紫云英(Astrag-
aluscicer)属间体细胞杂种和3个杂种克隆再生植
收稿日期:2012-12-17;修回日期:2013-03-05
项目基金:牧区优质高效饲草生产利用技术研究与示范项目(201003023);国家牧草产业体系项目(CARS-35)资助
作者简介:张凌云(1987-),女,甘肃敦煌人,硕士研究生,研究方向为牧草种植资源与育种,E-mail:zlingyun0408@163.com;*通信作者
Authorforcorrespondence,E-mail:shisl@gsau.edu.cn
草 地 学 报 第21卷
株;贺辉[18]和李玉珠[19]通过PEG法分别获得紫花
苜蓿-草木樨(Mdlilotussuaveolen)的属间杂种细胞
和苜蓿-百脉根(Lotuscorniculatus)的属间杂种细
胞。上述研究中多采用PEG法对离体原生质体进
行融合,虽然PEG法的细胞融合率较高且成本较
低,但PEG中的化学促融剂对原生质体会产生较大
的毒性伤害,严重影响原生质体融合后的存活能
力[4],而以无毒害、融合效率高、易操作的电融合
法[1-2]代替可有效改善PEG法的弊端。
俄罗斯杂花苜蓿(M.varia)是从俄罗斯赤塔州
引进的具有抗寒、耐旱、较强适应性、返青早、越冬率
高、蛋白质含量丰富、产量高等特性的优质苜蓿种质
资源[22]。甘农4号紫花苜蓿(M.sativa‘Gannong
No.4’)的茎枝多,草层整齐,初期生长速度快,但
其抗逆性差、病虫害严重、木质素含量高,仅适宜灌
溉条件下生产[23]。因此本试验拟将甘农4号紫花
苜蓿原生质体作为受体,俄罗斯杂花苜蓿原生质体
为供体,并采用对细胞无毒害性的电融合法将二者
原生质体融合,以期确定适宜的电融合参数及条件,
为实现利用体细胞杂交技术对苜蓿品种进行改良奠
定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料为甘肃农业大学草业学院组培实验室
培养的生长旺盛的俄罗斯杂花苜蓿愈伤组织、甘农
4号紫花苜蓿愈伤组织,接种于经预试验所得培养
基上,即分别接种于 MS+1mg·L-12,4-D+0.5
mg·L-16-BA+0.5mg·L-1KT+2.5%蔗糖+
0.7%琼脂和MS+2mg·L-12,4-D+1.5mg·L-1
6-BA+1.5mg·L-1NAA+2.5%蔗糖+0.7%琼
脂培养基,每15d继代一次。
1.2 原生质体的制备和失活
取继代至12~14d的俄罗斯杂花苜蓿愈伤组
织1g放入10mL含有2%纤维素酶、0.5%果胶
酶、0.3%离析酶、0.55mol·L-1甘露醇,pH为5.8
~5.9的酶混合液中,在25℃摇床(50r·min-1)上
振荡12h。酶解产物经200目、400目尼龙网过滤
后,离心(500r·min-1)3min,用融合液(含有0.55
mol·L-1甘露醇、0.6mmol·L-1CaCl2·2H2O的
重蒸水溶液)收集原生质体,收集后备用。失活处理
时取5份体积为2mL且等密度的原生质体盛于小
培养皿中,并放置于超净工作台紫外灯管中心下垂
直15cm处进行1,3,5,7,9min不同时长的辐射
处理,紫外辐射后在25℃,暗培养条件下培养7d后
观察细胞增殖情况,试验以未经紫外照射的原生质
体培养为对照处理,以此筛选出钝化俄罗斯杂花苜
蓿原生质体细胞核[18,24-27]的最佳条件,并在原生质
体融合时以此条件进行俄罗斯杂花苜蓿原生质体细
胞核失活处理。
取继代至10~12d的甘农4号紫花苜蓿愈伤
组织1g放入10mL含有2%纤维素酶、0.5%果胶
酶、0.3%半纤维素、0.6mol·L-1甘露醇,pH 为
5.8~5.9的酶混合液中,在25℃摇床(50r·min-1)上
振荡12h。酶解产物经200目和400目尼龙网过滤
后,离心(500r·min-1)3min,用融合液收集原生
质体。失活处理时取5份体积为2mL且等密度的
原生质体盛于离心管中,分别用2.0,4.0,6.0,8.0,
10.0mmol·L-1碘乙酰胺(IOA)于室温下处理10
min,使其原生质体细胞质失活[24-28],之后离心(500
r·min-1×3min)漂洗2~3次,用 KM8P培养液
收集后在25℃,暗培养条件下培养7d后观察细胞
增殖情况,试验以未经碘乙酰胺处理的原生质体培
养为对照处理,以此筛选出使甘农4号紫花苜蓿原
生质体细胞质失活的最佳条件,并在原生质体融合
时以此条件进行甘农4号紫花苜蓿原生质体细胞质
失活处理。
1.3 原生质体融合
试验采用CRY-3型细胞融合仪,融合在两极间
距为1.5mm融合小室内进行。将失活处理后的2
亲本原生质体以1∶1等密度等体积混合均匀后加入
融合小室。分别对不同交流场强(10~30V·cm-1)、
交流频率(1000~3000kHz)、直流脉冲场强(50~
350V·cm-1)、幅宽(5~100μs)及脉冲次数(1~4
个)处理[29]进行试验,同时在倒置显微镜下观察统
计细胞成串及细胞融合情况,每个处理观察5个视
野。将融合完毕的细胞悬浮液静置15min后小心
吸出,收集于离心管中,在200r·min-1下离心3
min,去上清液后再用 KM8P原生质体培养基洗涤
离心一次,最终置于3.5cm培养皿中,在25℃暗培
养箱中进行液体浅层培养[30-31]。
1.4 数据处理
试验中每个处理重复3次,统计分析用SPSS
16.0软件进行分析,图表用Excel2003制作。多重
077
第4期 张凌云等:苜蓿原生质体电融合适宜条件的筛选
比较采用SSR法,比较各处理间差异性。其中:原
生质体总融合率=视野中融合的原生质体总数/视
野中原生质体的总数×100%;一对一融合率=视野
中一对一融合的原生质体数/视野中原生质体的总
数×100%。
2 结果与分析
2.1 失活处理对原生质体存活率和分裂能力的影响
2.1.1 紫外线预处理对俄罗斯杂花苜蓿原生质体
分裂的影响 试验用辐射量一致的紫外灯管进行不
同时长的照射处理,使俄罗斯杂花苜蓿原生质体细
胞核失活。由表1可知,在辐射量相同时,原生质体
的存活率随辐射时间的延长而下降。培养7d后,
辐射时间为9min处理的原生质体完全丧失细胞分
裂,未形成再生细胞团;辐射时间为7min处理的原
生质体的存活能力已经严重受损,几乎无法形成细
胞分裂;辐射处理时间为5min的原生质体存活率
仅为4.5%,且只有少数细胞能形成分裂,但分裂2
~3次后即停止,不能形成细胞团;辐射处理3min
的原生质体在培养20~25d后,仍能形成肉眼可见
的细胞团。因此,以紫外辐射5min为俄罗斯杂花
苜蓿原生质体失活预处理的适宜条件。
2.1.2 IOA预处理对甘农4号紫花苜蓿原生质体
分裂能力的影响 试验用2.0,4.0,6.0,8.0,10.0
mmol·L-1共5种浓度IOA分别对甘农4号紫花
苜蓿原生质体细胞质钝化处理10min,以未经IOA
处理的原生质体为对照处理。由表2可知,随着
IOA浓度的加大,原生质体的存活率逐渐下降。培
养7d后发现,经10.0mmol·L-1IOA处理的原
生质体完全丧失分离能力;经6.0mmol·L-1IOA
处理的原生质体存活率仅为7.6%,由于细胞质被
破坏大多数细胞不能分裂,继续培养时也未形成小
细胞团;当IOA浓度低于6.0mmol·L-1时,仍有
部分原生质体保持分裂能力,继续培养时部分原生
质体能形成肉眼可见的小细胞团。因此,甘农4号
紫花苜蓿原生质体失活预处理的适宜条件为6.0
mmol·L-1IOA处理10min。
表1 不同照射时间对俄罗斯杂花苜蓿原生质体活力的影响
Table1 EffectsofdifferentultravioletradiationtimesontheprotoplastviabilityofRussianvariegatedalfalfa
紫外辐射时间
Ultravioletradiationtime/min
0 1 3 5 7 9
培养7d后原生质体活力
Livabilityafter7-dayculture/%
74.1±1.39 42.8±2.08 20.1±2.13 4.5±0.62 1.3±0.51 0±0.00
形成细胞团的能力
Abilityofformingcalus
+++ + + - - -
注:“+”表示细胞分裂能进行,可以形成细胞团;“-”表示细胞不能持续分裂,不能形成细胞团,下同
Note:“+”:capabilityofformingsmalcelcolonies;“-”incapabilityofsmalcelcolonies,thesameasbelow
表2 不同IOA浓度对甘农4号紫花苜蓿原生质体活力的影响
Table2 EffectsofdifferentIOAconcentrationsontheprotoplastviabilityofGannongNo.4alfalfa
IOA浓度
IOAconcentration/mmol·L-1
0 2 4 6 8 10
培养7d后原生质体活力
Livabilityafter7-dayculture/%
78.3±0.67 50.4±1.41 24.6±1.45 7.6±1.11 2.7±0.80 0±0.00
形成细胞团的能力
Abilityofformingcalus
++ + + - - -
2.2 电场因素对原生质体融合的影响
2.2.1 交流电场场强和频率对原生质体融合的影
响 当融合亲本原生质体悬浮液处于交流电场的作
用时,悬浮液中的原生质体改变其原有的运动方向,
相互靠近并逐渐相连排列成串。由表3可知,随着
交流场强和交流频率的增大,原生质体成串所需时
间逐渐缩短,串珠长度逐渐增大;但交流场强过大
时,原生质体的质膜则发生不可逆的变化,甚至在施
加直流电场时,部分原生质体破裂而不能完成融合;
另外,交流频率的增加则未对原生质体形状变化产
生明显影响。试验结果表明,交流场强在15~20
V·cm-1范围内,易形成原生质体一对一成串(图
1-a),当低于此范围时,不能形成串珠,而场强过大
时形成较长的串珠(图1-b),施加直流电场后易发
生多核融合,因此15~20V·cm-1为最适的交流场
强。交流频率过小时,原生质体几乎无法成串,在
2000~2500kHz范围内,原生质体成串时间较短,
在施加直流脉冲后一对一原生质体融合较为稳
177
草 地 学 报 第21卷
定,而大于这一范围时,虽然成串时间会缩短,但
是也易形成较长的串珠,不利于原生质体一对一
融合,因此2000~2500kHz为原生体融合的最适
交流频率。
表3 不同交流场强和交流频率对原生质体融合的影响
Table3 EffectsofdifferentACelectricfieldintensitiesandfrequenciesonprotoplastsfusion
交流场强AC
Electricfieldintensity
/V·cm-1
成串时间
Timeforforming
protoplastbunch/s
串珠长度
Numberof
protoplastbunch
原生质体形状
Shapeof
protoplast
交流频率
ACfrequency
/kHz
成串时间
Timeforforming
protoplastbunch/s
串珠长度
Numberof
protoplastbunch
原生质体形状
Shapeof
protoplast
10 - 0 圆形Sphericity 1000 - 0 圆形Sphericity
15 <10 2~3 圆形Sphericity 1500 ﹤15 2~3 圆形Sphericity
20 <10 2~3 圆形Sphericity 2000 ﹤10 2~3 圆形Sphericity
25 <5 3~5 椭圆Elipsoid 2500 ﹤5 3~5 圆形Sphericity
30 <5 5~10 破裂Break 3000 ﹤5 5~10 圆形Sphericity
图1 俄罗斯杂花苜蓿与甘农4号紫花苜蓿融合过程
Fig.1 ElectrofusionprocessesofRussianvariegatedalfalfaandGannongNo.4alfalfa
注:a:2个原生质体形成串珠(10×40),b:多个原生质体成串(10×20),c:原生质体融合初期(10×40),d:原生质体融合后期(10×40)
Note:a:Binaryprotoplastsformedfusionbunch,b:Multipleprotoplastsformedfusion,
c:Twoprotoplastsbeginningtofuse,d:Twoprotoplastsformedfusion
2.2.2 直流脉冲场强对原生质体融合率的影响
由图2 可知,在保持 交 流 电 场 强 度 为 15~20
V·cm-1,交流频率为2000~2500kHz的条件下,
不同场强的直流脉冲对原生质体融合具有很大影
响。当施加直流电压时,彼此相邻的原生质体逐渐
开始融合(图1-c和1-d)。随着直流脉冲强度缓慢
增大,总融合率和一对一融合率也逐渐提高。当脉
冲增加到200V·cm-1和250V·cm-1时总融合率
分别达到20.4%和23.9%,且一对一融合率分别高
达10.9%和11.3%,此二者脉冲强度间的融合率及
一对一融合率的差异均不显著,但均显著高于其他
脉冲条件下的融合率(P<0.05);此后,若继续加大
脉冲强度,则对细胞膜形成较大的刺激,融合率逐渐
下降,不易形成有效细胞融合。因此,本试验认为直
流脉冲为200~25V·cm-1时是原生质体融合的适
宜脉冲强度。
图2 直流脉冲强度对融合的影响
Fig.2 EffectsofdifferentDCelectricfieldintensitiesontheprotoplastfusion
277
第4期 张凌云等:苜蓿原生质体电融合适宜条件的筛选
2.2.3 直流脉冲幅宽对原生质体融合率的影响
在15~20V·cm-1、2000~2500kHz交流电场,
200~250V·cm-1直流脉冲条件下比较不同直流
脉冲宽幅对原生质体融合的影响。由图3可知,随
着直流脉冲宽幅的增加,原生质体的总融合率和一
对一融合率先逐渐提高,然后明显降低。在脉冲幅
宽小于40μs时,总融合率及一对一融合率相对较
低,说明间隔较小的多个快速脉冲的融合效果不佳;
而脉冲宽幅达到40μs时,原生质体的总融合率及
一对一融合率达到最大,为23.8%和11.2%,显著
高于其他脉冲宽幅水平(P<0.05),说明40μs的脉
冲幅宽是原生质体有效融合的最佳直流脉冲宽幅。
图3 直流脉冲幅宽对融合的影响
Fig.3 EffectsofdifferentDCpulsewidthontheprotoplastfusion
2.2.4 直流脉冲次数对原生质体融合率的影响
在交流电场为15~20V·cm-1、2000~2500kHz,
直流脉冲电场强为200~250V·cm-1,脉冲宽幅
为40μs时,比较不同脉冲次数对原生质体融合的
影响。由图4可知,脉冲次数过少,则细胞融合不
充分,融合率较低;而脉冲次数过多时,导致细胞
膜不能承受过强的脉冲刺激,亦降低融合率。当
脉冲次数为2或3次时,原生质体总融合率相近,
分别为23.6%和24.3%,但差异未达显著水平。
一对一融合率分别为11.0%和13.2%,差异性达
显著水平(P<0.05),由于总融合率中包括了多核
融合,而真正有效的融合为原生质体一对一融合,
因此,综合考虑后认为3个脉冲次数是最适直流
脉冲个数。
图4 直流脉冲个数对融合的影响
Fig.4 EffectsofdifferentDCpulsenumbersontheprotoplastfusion
2.3 原生质体密度对原生质体成串的影响
用电融合液将俄罗斯杂花苜蓿和甘农4号紫花
苜蓿原生质体分别稀释至1×105,3×105,5×105,
10×105个·mL-1共4个不同密度,将相同密度的2
亲本原生质体 1∶1 等体积混合,在 15~20
V·cm-1、2000~2500kHz交流场,直流脉冲200~
250V·cm-1,脉冲宽幅40μs,脉冲3次条件下,研
究不同亲本原生质体密度对融合的影响。由表4可
知,原生质体密度较低时,由于融合液中的细胞总数
稀少,即实际参与细胞融合的原生质体数量较少,则
原生质体融合率相对较低;而密度过高时,原生质体
在融合室内互相重叠、拥挤,易形成多核融合,从而
377
草 地 学 报 第21卷
降低了原生质体一对一融合比率。因此亲本密度调
整至3×105~5×105 个·mL-1时融合率相对较
高,为最适宜的亲本原生质体融合密度条件。
表4 原生质体密度对融合的影响
Table4 Effectsofdifferentdensitiesonprotoplastfusion
原生质体密度
Protoplastdensity/个·mL-1
融合率
Fusionrate/%
一对一融合率
Binaryfusionrate/%
1×105 12.3±1.62c 3.3±2.02c
3×105 24.7±2.60a 13.8±2.17a
5×105 23.8±2.26a 13.0±3.25a
10×105 18.4±1.84b 7.40±0.72b
注:不同字母表示各处理之间差异显著(P<0.05)
Note:Differentlettersindicatesignificantdifference(P<0.05)
3 讨论
3.1 原生质体失活处理简化杂种细胞筛选
由于融合过程中无法控制2亲本原生质体相应
一一配对形成异源融合,因此在融合前对双亲本原
生质体均进行失活或钝化处理[19,24-27],破坏亲本原
生质体的细胞全能性,使其失去活性不能正常分裂,
而在经过细胞融合后,通过重建代谢支路或代谢互
补完成细胞分裂[32],因此融合后有分裂能力且形成
小细胞团的均为异源杂交细胞,从而简化细胞筛选
和杂交细胞的鉴定过程。本试验采用紫外辐射方
法[18]破坏俄罗斯杂花苜蓿细胞核活性,并打碎其染
色质,用IOA[17]钝化甘农4号紫花苜蓿原生质体细
胞质活性,使其均无法进行正常细胞分裂,只有在经
过异源融合后,杂交细胞即可包含正常的细胞质和
细胞核,经代谢互补后重新具有细胞分裂能力,如此
可以有效筛选杂种细胞,简化鉴定过程。本试验所
采用的方法与司家钢等[24]在胡萝卜(Daucuscaro-
ta)原生质体非对称融合研究、谭芳等[25]对芹菜
(Apiumgraveolens)与胡萝卜原生质体非对称融
合,以及贺辉[18]在紫花苜蓿和白花草木樨(Mdlilo-
tussuaveolen)细胞融合研究中的处理方法相似,本
试验结果与之相近。
3.2 原生质体电融合参数
电融合是一种高效安全,可操作性强的融合方
法。在电融合过程中细胞膜之间相互接触是彼此融
合的第一步,本试验发现,在15~20V·cm-1交流
电场强度下可形成2~3原生质体相连的串珠,且原
生质体形状完整,施加直流脉冲后能形成有效、稳定
的细胞融合,高于这一范围时部分原生质体的细胞
膜发生不可逆转变化,原生质体开始变形或者破裂。
这与侯喜林等[29]在不结球白菜(Brassicacampes-
trisssp.Chinensis)胞质杂种试验中的结果相似。
同时试验发现交流频率的大小对原生质体形状变化
无明显影响,但交流频率较低时,原生质体出现明显
的旋转现象[33],这种旋转阻碍了原生质体彼此相
连,导致其不能进行融合,当交流频率逐渐加大后,
这种现象得到改善,成串所需时间逐渐加快,串珠长
度也逐渐加大。这一结果与胡张华等[34]对水稻
(Oryzasativa)原生质体融合研究中的结果一致。
适宜的直流电场条件是提高融合率的关键,本
试验中给予3个直流脉冲,作用时长为40μs的200
~250V·cm-1直流电场时,一对一有效融合率较
高;低于这一范围时,由于电场强度不足,细胞膜受
到的脉冲刺激较弱,形成的有效融合率较低;高于这
个范围时,脉冲刺激作用过强,使细胞膜被击穿,甚
至细胞膜破裂,且不能被逆转,而无法形成细胞融
合。这一最适范围与胡家金等[35]在水稻与空心莲
子草(Alternantheraphiloxeroides)原生质体融合
条件研究中的范围条件不同,原因可能是电融合仪
的型号不同,以及试验所采用的材料不同。
由于亲本原生质体经过失活钝化处理,同源原
生质体融合后其细胞器不完整,无法进行正常的细
胞分裂,不能再生增殖。此外,总细胞总融合率中不
仅包括一对一细胞融合率,还包括多核细胞融合频
率,而多个细胞相互融合的结果并非本研究目的。
因此,在判断某一融合条件是否适宜原生质体融合
时,应考虑主要一对一原生质体融合的频率,从而实
现获得异核杂种细胞的目的。
4 结论
本研究对2种苜蓿原生质体进行了电融合试
验,摸索出了适宜的预处理措施和融合条件。经紫
外辐射5min俄罗斯杂花苜蓿原生质体和经6
mmol·L-1IOA钝化的甘农4号紫花苜蓿原生质
体均失去细胞活性而不能细胞分裂,将2亲本等体
积混合后调至最佳密度范围3×105~5×105
个·mL-1后,进行电融合。当达到最佳电场条件,
即交流电场强度15~20V·cm-1、交流频率2000
~2500kHz,直流脉冲场强200~250V·cm-1、脉
冲宽幅40μs、脉冲个数3个时,有效融合率可达
13.8%。
477
第4期 张凌云等:苜蓿原生质体电融合适宜条件的筛选
参考文献
[1] 刘庆昌,吴国良.植物细胞组织培养[M].北京:中国农业大学
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(责任编辑 李美娟)
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