全 文 ：武汉植物学研究2007，25(1)：98—101
Jouma／of Wuhan Botanical Research
改进的 SDS．CTAB法提取濒危植物连香树总 DNA
黄绍辉，方炎明’
(南京林业大学，南京 210037)
摘 要：对珍稀濒危植物连香树(CercidiphyUumjaponicum)的6种总DNA提取方法进行了对比试验，结果表明改进
的SDS．CTAB法更适合于连香树总DNA提取。该方法提取的DNA经紫外消光值检测，其A260／A瑚为1．8532，优于
CTAB法(1．4872)、SDS法(1．3552)、PVP法(1．5079)、尿素法(1．1858)和高盐低pH法(1．4534)。琼脂糖凝胶电
泳和PCR扩增结果也得出同样的结论。
关键词：连香树(CercidiphyUum向，D，l 咖)；DNA提取；改进的SDS—CTAB
中图分类号：Q946．23-34 文献标识码：A 文章编号：1000-470X(2007)O1-0098-04
DNA Extraction of the Endangered tree Species CercidiphyUum japonicum
Based on the Modified Method of SDS．CTAB
HUANG Shao．Hui．FANG Yan．Ming
(Nanj／ng Forestry University，Nanjing 210037，China)
Abstract：S．Ⅸmethods of DNA extraction of endangered tree species Cercidiphyllum japonicum are ana-
lyzed an d compared in this article．The results showed that the mod ifed method of SDS．CTAB iS better
than the others in terms ofthe quality oftotal DNA extraction． e value ofA260／A280 is 1．8532 for DNA
extracted by t}Iis ofmod ifed SDS．CTAB method ．It’S higher than the others．such as 1．4872 for CTAB
method ，1．3552 for SDS method ，1。5079 for PVP method ，1。1858 folr urea method an d 1．4534 for low
pH medium with high salt metllod． I11e results of eleetrophoresis an d PCR axnplifeation alSO indieated
tllat the mod ifed method of SDS．CTAB iS better than the others．
Key words：Cercidiphylumjaponicum；DNA extraction；Modifed SDS-C rAB method
DNA的分离提取是进行植物分子生物学研究
工作的基础，DNA样品质量是分子生物学实验成败
的关键因素之一。不同的植物材料细胞中所含次生
代谢产物的种类、含量不同，适合的提取方法也不
同。小麦、玉米、水稻、大豆、棉花等细胞总 DNA提
取己有许多成熟技术方案u一’J。而对于一些珍稀濒
危植物总DNA的提取仍需不断摸索条件【8】。珍稀
濒危植物连香树(Cercidiphylum japonicum)组织中
含有较多的单宁、酚类、多糖及色素等成分。如果提
取方法不当，会使提出的基因组 DNA进入这种粘稠
胶状物中而难于溶解，使用如此质量的DNA会影响
PCR扩增反应的稳定性和重现性。本实验选取6种
常规提取植物基因组 DNA的方法，稍加改动，分别
用于提取连香树基因组 DNA，通过检测结果的比
较，筛选出一种更适合连香树 DNA提取的方法，为
进一步的遗传多样性研究提供基础。
1 材料与方法
1．1 材料来源
叶片来源于神农架南坡的湖北省巴东县堆子场
乡送子 园村瓦缸溪连香树 (Cercidiphylum japoni．
cum)天然居群，样木胸径22 cm，树高 13 m。样叶位
于样木的最下一个分枝，为落叶树种当年生新鲜嫩
叶。所采样叶无病虫危害和破损，采下后马上用变
色硅胶保存，带回实验室后保存于 一70％冰箱中。
居群的地理位置约为北纬 3l。20．080 左右，东经
110。25．209 左右，海拔高度 1450 m左右。
1．2 DNA提取方法
(1)改进的SDS-CTAB结合法：参照孙鑫等 l
的SDS—CTAB结合法并进行了改进。以变色硅胶干
燥的幼嫩叶片为实验材料。称取 0．05 g叶片，液氮
研 磨，在研磨的过程中加入2％ ～5％的PVP40(聚
收稿日期：20064)7~9，惨回日期 ：206．10-31。
基金项目：江苏省农业三项工程项目[sx(2002)073]资助。
作者简介：黄绍辉(1967一)，男，湖南蓝山人，在读博士研究生 ，主要从事发育生物学、生态学研究(E-mail：shlmjedu@sohu．corn)。
方炎明，教授，博士生导师。
· 通讯作者。
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第 1期 黄绍辉等：改进的SDS．CTAB法提取濒危植物连香树总DNA
乙烯吡咯烷酮)、少量的抗坏血酸钠和少量的石英
砂。预热提取 700 缓 冲液 [100 mmol／L rids-
HCI．pH 8．0；50 mmol／L EDTA(乙二胺四乙酸二钠
盐)，pH 8．0；I．0 mol／L NaCI；2％ SDS(十二烷基硫
酸钠)；2％ PVP40]，现用现加100 L p-Mercapto-
ethanol(B．巯基乙醇)。研磨成均匀粉状后加入到提
取缓冲液中，振荡混匀，于65~C水浴 1 h左右。加人
1／3体积的 5 mol／L KAC(pH 4．8)，一20℃ 冰浴
0．5一I h。4℃，12 000 r／min离 C,qo min。取上清，
加人 1／5体积的 2×CTAB(十六烷基．三甲基溴化
铵 )(100 mmol／L Tris-HC1，pH 8．0；20 mmol／L
EDTA；I．4 mol／L NaC1；2％CTAB)，充分混匀，65℃
水浴l0—20 min。冷却至室温后，加人等体积的氯
仿／异戊醇(24：1)抽提 3次，4℃，12000 r／min离心
10 min。取 上 清，加 人 1／2体 积 的 高 盐 溶 液
(0．8 mol／L柠檬酸钠、1．2 mol／L NaC1)和 1／2体积
预冷的异丙醇，充分混匀 ，一20℃放置 0．5—1 h，
12000 r／min 4℃离心 10 rain。去上清，用 70％乙醇
洗涤沉淀 2次。风干沉淀，加50o 灭菌水溶解。
然后加 1／10体积3 mol／L NaAC(pH 5．2)和2倍体
积无水乙醇，混匀。一20℃放置 10 rain。12 000 r／
min 4℃离心 10 rain。用 70％乙醇洗涤沉淀 2次，
100％乙醇洗涤沉淀 1次，自然风干，加适量 0．1×TE
(1．0 mmol／LTris-HC1，pH 8．0；0．1 mmol／L EDTA，
pH 8．0)溶解，4℃保存备用。
与孙鑫等实验设计不同的是：①研磨时没加
DICA(二乙二硫氨甲酸)，而是加 2％ 一5％ PVP40
和少量的抗坏血酸钠；②B．Mercaptoethanol的用量
增加了一倍；③加入2×CTAB，而不是10％的CTAB
Bufer(100 mmol／L Tris-HC1，pH 8．0；50 mmol／L
EDTA，pH 8．0；1．0 mol／L NaCI；10％ CTAB)；④在
沉淀DNA时加人了高盐溶液和NaAC溶液；⑤加异
丙醇后于 一20℃冰浴 0．5—1 h，之后是低温离心，而
不是室温放置和室温离心。
(2)CTAB法：参照邹瑜苹等[8】的方法进行。
(3)高盐低 pH值法：参照邹瑜苹等【9 的方法
进行。
(4)SDS法：参照傅荣昭等[1叫的方法进行。
(5)PVP法：参照杜道林等【1¨的方法并稍加改
进。取0．05 g植物材料，液氮研磨至粉末，转人
2 mL离心管中，加3倍体积提取缓冲液(250 mmol／L
NaCI；25 mmol／L EDTA：0．5％ SDS；20 mmol／L Tris．
HCI，pH 8．0)，轻轻混匀后，置室温 I h，再加 PVP40
至终浓度为 6％，混匀后加 0．5倍体积 7．5 mol／L
NH4AC，置冰上 30 rain，离心(12000 r／min，10 rain，
4℃)，取上清液，异丙醇沉淀 DNA，干燥后溶 于
200 含RNa~(RNA消化酶，20~g／mL)0．1×TE
(pH 8．0)中，37℃水浴 30 rain，氯仿 ：异戊醇(24：
1)抽提 2次，异丙醇沉淀 DNA，70％酒精洗 1次，
100％酒精洗 1次，自然干燥后溶于适量 0．1×TE
(pH 8．0)中，4℃保存备用。
(6)尿素法：参照Tan等u 的方法加以改进。
取0．05 g硅胶迅速处理的叶片，加人 700 提取
缓冲液(8 mol／L尿素；0．5 mol／L NaC1；50 mmol／L
Tris-HCI，pH 8．0；20 mmol／L EDTA；2％ p-Mercapto-
ethanol；5％ PVP40)，65℃水浴 30 min后，加人 1／5
体积的7．5 mol／L NH AC，颠倒混匀，冰浴 30 rain，
10000 r／min离心5 min，上清液吸人另一离心管，加
入等体积的酚 ：氯仿 ：异戊醇(25：24：1)，氯仿 ：
异戊醇(24：1)各抽提1次，然后用等体积的异丙醇
室温沉淀 1 h，15000 r／min离心 15 min，所得沉淀用
70％的乙醇和无水乙醇洗涤后用 500 高盐 TE
(1．0 mol／L NaC1；10 mmol／L"Iris-HC1，pH 8．0；
1 mmol／L EDTA，pH 8．0)溶解，加人 RNase，37℃水
浴30 min，再用等体积的氯仿 ：异戊醇(24：1)抽提
1次，用 2倍体积 预冷无水 乙醇于 一29℃沉 淀
30 min，用 70％的乙醇和无水乙醇洗涤沉淀 2次后，
用适量 0．1×TE溶解，4℃保存。
1．3 DNA样品的紫外消光值检测
在各种方法提取 DNA样品5 中加双蒸水混
匀后，用石英比色杯于DU(R)800分光光度计中测
定紫外消光值，根据其在 260 am和 280衄 波长处
的光吸收值计算DNA产率，根据A260／A瑚判断DNA
样品的纯度。DNA样 品的浓度 ( g／ L)为：在
260 nll的紫外消光值 ×核酸稀释倍数 ×50／1000。
纯 DNA样品 A260／A280紫外消光值应为 1．8，A260／
A瑚值应大于2．0。A ／A瑚值大于 1．9时，表明有
RNA污染，小于 1．6时，表明样品中存在蛋白质或
酚污染。A狮／A瑚值小于2．0时表明溶液中有残存
盐和小分子杂质，如核甘酸、氨基酸、酚等。
1．4 琼脂糖凝胶电泳检测
在1％琼脂糖(含0．5 p~g／mL溴化乙锭)凝胶
中，加入1×TBE缓冲液[由10×TBE(108 g Tris；
55 g硼酸；40 mL 0．5 mol／L EDTA，pH 8．0；加双蒸
水至1 L)稀释而成]，3—4 V／cm电压下电泳，比较
各种方法的 DNA得率。
1．5 PCR扩增检测
各种 DNA提取方法所得 DNA样品 1．4 ，引
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武 汉 植 物 学 研 究 第 25卷
物(引物代码为 13o8，碱基序列为 GTGTGCCCCA)
I．4 tL，镁离子 I．5 ，dNTPs 0．6 ，10 x Bufer
缓冲液 3 ，Taq酶 1 U，加水至 20 。扩增程序
为：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，38~C退火30 s，
72℃延伸 l_5 rain，40个循环．72T；最后延伸7 min，
4℃保存。PCR扩增产物在含 EB染色液(0．5 g／
mL)的 1 5％琼脂糖凝胶中电泳，电泳缓冲液为1×
TBE。3 5～4 V／cm电压下电泳2．5 h左右。在 Tan—
nonUV-2000紫外分析仪上观察并拍照。
2 结果分析
2．1 紫外消光值检测
各种提取方法的 DNA经紫外分光光度计测定
的紫外消光值结果见表1
各种方法所提取的DNA溶解于等量(100 L)
0．1×TE后，由于所含杂质的种类和数量的差异，它
们所表现出的颜色深浅不一。SDS—CTAB法所得
DNA不仅 A2砷／A2 在 1．8左右．A珊／A2加在 2．0左
右，其颜色也明显浅于其它方法所得 DNA。在其它
几种方法中，酚类、多糖等次生物质与核酸形成复合
物，使 DNA难于溶解或产生不同程度的褐变，影响
了所提 DKA含量和纯度。
2．2 琼脂糖凝胶电泳检测
从 6种方法提取 DNA的琼脂糖电泳凝胶成像
照片(图 1)可见，改进的SDS—CTAB法提取 DNA质
量较好．条带较强，残留杂质少 CTAB法和 PvP法
的条 带虽强。但点 样孔有 较 多残 留的糖类 等
杂质
l L3"AB法；2．高盐佩 pH法；3 SDS法；4 SDS·CTAB法；5．PVP
法；6．琢素法
1．CTAB method：2 pH medium wilh hi sah meshod；3．SDS
meihod 4 SDS—CTAB method；5．PVP me山· ；6．Urea md xt
圈 1 各种方法提取 DIqA的电泳
Fig 1 Ekctrophoresis of DNA for sorts
extraction[hethod
2．3 PCR扩增检测
从 PCR扩增反应后的电泳图谱看(圈2)，改进
的SDS—CTAB法提取的 DNA可用于 PCR扩增 ，扩
增产物有较清晰的电泳条带，且条带数较多，可用于
进一步的分子生物学研究。CTAB法和 PVP法扩增
结果类似，电泳条带较改进的SDS—CTAB法少，扩增
结果与 DNA纯度检测结果一致。
] 2 3 4 5 n
1 SD~CrAB法；2 SDS业；3．高盐低 洼；4 FAB法；5 PVP
法 ；6尿 素法
1．SDS-CI’AB methcd；2．SDS method；3 pH meditun 山 hi salt
口leEI d；4 C1AB m 小0d：5．PVP method：6 Urea method
图 2 各种提取方 法的 PcR扩增
Fig 2 PCR amplificatkm DNA for sorts
of extraction method
3 结论与讨论
植物基因组 DNA质量是其 RAPD扩增成功与
否的关键‘ 。因此，植物基因组 DNA提取 成为
RAPD实验的一个重要环节。不同植物材料含有不
同次生代谢产物种类和数量，从中提取 DNA的关键
是有效地除去这些杂质，需要有针对性地选择不同
的提取方法 特别是珍稀濒危物种，其 DNA提取方
法需要做更多的摸索。在连香树基因组 DNA的提
取中，加PVP40，可以与酚类物质结合形成鳌合物，
通过离心除去后可提高 DNA的得率和纯度。用
PVP40和抗坏血酸，是利用其“CO—N=”基随多酚化
台物中芳环羟基数量的增加而加强的结合多酚化合
物能力，其结合成复合物后，通过离心除去 加入
B—Mercaptoethanol主要是利用其“．SH”基打断多酚
氧化物酶的二硫键而使之失活，防止酚类化台物
表 1 6种 DNA提取方法的紫外消光值和产率
Table 1 The Y丑lue and extraction pe en1 嚣e of six DNA extraction meth~s
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第1期 黄绍辉等：改进的SDS．CTAB法提取濒危植物连香树总 DNA 101
被氧化而不被形成复合物，有利于离心除去酚类物
质。适当地提高 B．Mercaptoethanol含量能有效去除
多糖等次生物质n 。在沉淀 DNA时加入高盐溶液
和NaAC，可以有效去除糖类，防止其在 RAPD反应
中抑制 Taq酶活性。
RAPD技术是利用单一的 lO个碱基的寡聚核
苷酸作为引物，对基因组 DNA进行 PCR扩增，扩增
产物 DNA片段的多态性反映了基因组相应区域
DNA多态性。扩增产物是一个其侧翼为lO bp的引
物结合位点区域以正确方向延伸而产生的u引。
SDS—CTAB法提取的基因组 DNA不仅含有大片段。
而且有较多小片段 DNA，在相同扩增条件下扩增出
更多的条带数，同片段的扩增产物更多，条带更清
晰，因而更有利于遗传多样性分析。
实验结果表明，不论是纯度检测，还是 PCR扩
增效果检测，均反映出改进的 SDS．CTAB法更适合
于连香树基因组 DNA提取。
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