全 文 ：植物科学学报 ２０１５ꎬ ３３(１): １２６~１３１
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
ＤＯＩ:１０ １１９１３ / ＰＳＪ ２０９５－０８３７ ２０１５ １０１２６
流式细胞仪检测高等植物细胞核
ＤＮＡ含量的方法
汪 艳∗ꎬ 肖 媛ꎬ 刘 伟ꎬ 李婷婷ꎬ 胡 锐ꎬ 乔志仙
(中国科学院水生生物研究所分析测试中心ꎬ 武汉 ４３００７０)
摘 要: 相对于动物和微生物而言ꎬ 流式细胞术在植物科学上的应用会因植物组织与细胞(如细胞壁、 中央液
泡、 特殊细胞器等)的特殊结构以及次生代谢产物等特殊成分ꎬ 造成样品在前期处理、 染色及测试等方面的困
难ꎬ 甚至导致检测失败或结果不准确ꎮ 笔者在长期运用流式细胞仪测试工作中ꎬ 积累了大量的植物样本检测经
验ꎬ 并参考国内外相关文献ꎬ 总结出从植物取材、 样品制备到植物细胞核 ＤＮＡ流式检测的方法和技巧ꎬ 可为植
物科学研究者及从事流式细胞检测的技术人员提供实验参考ꎮ
关键词: 流式细胞术ꎻ 高等植物ꎻ 细胞核 ＤＮＡ含量ꎻ ＤＮＡ解离液
中图分类号: Ｑ３４３ꎻ Ｏ６５ 文献标识码: Ａ 文章编号: ２０９５￣０８３７(２０１５)０１￣０１２６￣０６
收稿日期: ２０１４￣０３￣１９ꎬ 退修日期: ２０１４￣０４￣２４ꎮ
作者简介: 汪艳(１９６９－)ꎬ 女ꎬ 硕士ꎬ 主要从事细胞生物学研究ꎮ
∗通讯作者(Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｗａｎｇｙａｎ＠ｉｈｂ ａｃ ｃｎ)ꎮ
Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｓｋｉｌｌｓ ｏｆ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ
Ｎｕｃｌｅａｒ ＤＮＡ Ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｉｎ Ｈｉｇｈｅｒ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌｓ
ＷＡＮＧ Ｙａｎ∗ꎬ ＸＩＡＯ Ｙｕａｎꎬ ＬＩＵ Ｗｅｉꎬ ＬＩ Ｔｉｎｇ￣Ｔｉｎｇꎬ ＨＵ Ｒｕｉꎬ Ｑｉａｏ Ｚｈｉ￣Ｘｉａｎ
(Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒꎬ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｗｕｈａｎ ４３００７０ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ａｎｉｍａｌｓ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓꎬ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｆｏｒ
ｐｌａｎｔ ｓｃｉｅｎｃｅ ｉｓ ｑｕｉｔｅ ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ ｉｎ ｒｅｇａｒｄｓ ｔｏ ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎꎬ ｄｙｅｉｎｇ ａｎｄ ｔｅｓｔｉｎｇꎬ ｗｈｉｃｈ ｃａｎ
ｌｅａｄ ｔｏ ｆａｉｌｕｒｅ ｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｒ ｉｎａｃｃｕｒａｔｅ ｒｅｓｕｌｔｓꎬ ｄｕｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ
ｏｆ ｐｌａｎｔ ｍａｔｅｒｉａｌ ( ｅ.ｇ.ꎬ ｃｅｌｌ ｗａｌｌｓꎬ ｃｅｎｔｒａｌ ｖａｃｕｏｌｅｓꎬ ｍｕｌｔｉｆａｒｉｏｕｓ ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ ａｎｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ
ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ) . Ｔｈｒｏｕｇｈ ｌｏｎｇ￣ｔｅｒｍ ｕｓｅ ｏｆ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｔｏ ｒｅｌａｔｅｄ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅꎬ ｗｅ
ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｓｃｉｅｎｃｅꎬ ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｉｎ ｓｐｅｃｉｍｅｎ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎꎬ
ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ ＤＮＡ ｃｏｎｔｅｎｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ. Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｌｙꎬ ｔｈｉｓ ｒｅｐｏｒｔ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａ
ｖａｌｕａｂｌｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｐｅｒｓｏｎｎｅｌ ｅｎｇａｇｅｄ ｉｎ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｔｅｓｔｉｎｇ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ (ＦＣＭ)ꎻ Ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔꎻ Ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ＤＮＡ ｃｏｎｔｅｎｔꎻ ＤＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
ｂｕｆｆｅｒ
流式细胞仪( ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ)的诞生标志着在
单细胞水平上定性、 定量分析及分选检测技能的快
速发展ꎬ 并在血液学、 免疫学、 肿瘤学、 分子生物
学和细胞生物学等学科的基础研究及临床检验中得
到了广泛应用ꎮ 但在植物学研究领域中ꎬ 由于植物
组织与细胞结构复杂ꎬ 使流式细胞仪在植物科学中
的应用滞后于其它学科ꎮ 近 ３０ 年来ꎬ 随着流式细
胞仪多功能开发、 多参数流式分析与分选技术建
立、 流式样品制备技术的不断更新ꎬ 流式细胞术在
植物科学领域如植物遗传育种、 植物染色体分析与
文库构建、 逆境植物学、 植物分类学、 植物病理学
等各个学科中显示出广阔的应用前景[１]ꎮ
大多数生物体遗传信息编码的 ＤＮＡ 定位于细
胞核ꎬ ＤＮＡ含量的检测技术是开发最早、 应用最
广泛、 最基本的流式细胞术之一[２ꎬ３]ꎮ Ｇａｌｂｒａｉｔｈ
等[２]和 Ｈａｒｅ等[４]研究开发了流式细胞仪检测植物
细胞核 ＤＮＡ含量的方法ꎬ 从而促进了植物学前所
未有的发展ꎮ 流式细胞仪检测 ＤＮＡ 含量的原理是
利用特殊的荧光染料(ＰＩ、 ＤＡＰＩ、 ＡＯ等)与细胞内
ＤＮＡ碱基结合ꎬ 在一定的压力下染色细胞进入流
式细胞仪的流动室ꎬ 经激光照射后发射出荧光ꎬ 通
过滤片可收集到每个细胞相应的荧光强度ꎬ 再根据
染色细胞的荧光强度即可推算出细胞的 ＤＮＡ 含
量ꎮ 流式细胞术不仅能对植物细胞计数、 检测基因
组大小、 ＤＮＡ含量及其倍性水平、 物种入侵能力ꎬ
还能分选出不同周期不同时期的细胞、 染色体及构
建文库等ꎬ 这为植物细胞生物学研究提供了有力的
工具及检测手段ꎮ
利用流式细胞术检测植物细胞核 ＤＮＡ 含量和
倍性ꎬ 对描述物种特征、 分类及遗传学研究都十分
重要ꎮ 我们在检测植物样品时经常会遇到大量
ＤＮＡ碎片的干扰ꎬ 主要原因是植物细胞结构(如细
胞壁、 中央液泡)及成分(次生代谢产物等)的特殊
性和复杂性ꎮ 笔者在长期运用流式细胞仪进行测试
的工作中ꎬ 积累了丰富的植物样本检测经验ꎬ 同时
参考大量的国内外文献ꎬ 对植物样品检测中的关键
环节ꎬ 如植物样品制备、 提取 ＤＮＡ 的缓冲液选
择、 标准品选择和流式细胞检测方法等方面进行归
纳ꎬ 总结出了植物细胞核 ＤＮＡ 流式检测的方法和
技巧ꎬ 可为植物科学研究者和从事流式细胞仪操作
的技术人员提供参考ꎮ
１ 植物细胞核 ＤＮＡ制备
１ １ 植物材料选择
测试前对植物材料进行选择和样本制备是关系
到流式细胞仪检测细胞核 ＤＮＡ 成功与否的关键ꎬ
若检测中样本出现大量细胞碎片则会遮掩细胞核
ＤＮＡ信息ꎬ 影响流式细胞仪检测样本细胞核的成
峰效果和检测结果的准确性ꎮ 一般植物取材需要考
虑样品易获性、 细胞核型的稳定性和保存性等一系
列问题ꎮ 植物样品最好选取新鲜的叶片或者幼嫩叶
片ꎬ 因其较易获得合适的单细胞悬液ꎬ 但也有研究
者选取植物的根、 茎等其它部位ꎮ 例如ꎬ Ｄｏｌｅｚｅｌ
等[３]利用植物根尖分生组织制备染色体细胞悬液ꎬ
对植物组织和细胞进行了 ＤＮＡ 含量、 倍性研究ꎻ
Ｓａｉｔｏ等[５]利用流式细胞仪对萱草属植物物种和栽
培品种的叶、 根、 根状茎、 花梗进行了倍性分析ꎬ
发现叶基部组织是最合适的材料ꎮ 在野外采集中由
于受条件限制ꎬ 研究者经常采用湿滤纸包裹植物样
本并装入密封塑料袋中置于冰盒保存ꎬ 带回实验室
后再置于－７０℃冰箱中保鲜ꎻ 还有使用自然风干和
快速干燥等方法保存样品的ꎮ Ｓｕｄａ 等[６]对新鲜、
冻存、 干燥的维管束植物样本进行了流式细胞核
ＤＮＡ含量测定可行性的比较研究ꎬ 发现利用维管
束植物快速脱水干燥方法保存的样品进行流式细胞
核 ＤＮＡ测定是可行的ꎬ 这使那些难以得到新鲜材
料的稀有物种或不便及时处理的样品也能够利用流
式细胞仪进行检测成为了现实ꎬ 促进了植物系统
学、 生态学和种群生物学的研究和发展ꎮ
１ ２ ＤＮＡ核解离液的选择
流式细胞仪要求被检测的植物样本必须是完整
的单细胞或细胞核悬液ꎮ 在制备植物单细胞悬液时
会产生大量的碎片ꎬ 干扰细胞核 ＤＮＡ 含量的检
测ꎮ 目前还未发现能适合于所有物种的通用解离
液ꎮ Ｌｏｕｒｅｉｒｏ等[７]以芦苇作为材料比较了 ４种解离
液(Ｇａｌｂｒａｉｔｈｓ / ＬＢ０１ / ＯＴＴＯ / ＴｒｉｓＭｇＣｌ２ )的测试
效果ꎬ 发现 ＬＢ０１和 ＯＴＴＯ解离液的效果最好ꎬ 且
ＯＴＴＯ对一些 ＤＮＡ 含量较低的物种也能得到较好
结果ꎮ 根据不同植物的组成特性ꎬ 选择合适的植物
细胞核解离液将有助于细胞核的完全游离ꎮ 如一些
植物(臭椿、 拟南芥、 猕猴桃等)体内含有较高浓
度的淀粉、 多糖、 磷酸钙等新陈代谢类的黏性物
质ꎬ 为了消除酚类黏性物质的影响ꎬ 在提取细胞核
悬液时需加入体积浓度为 １％的聚乙烯吡咯烷酮
(ＰＶＰ)ꎮ Ｌｉ等[８]采用 Ｈｅｐｅｓ 缓冲液分析发现了迄
今为止最高倍性(１０ 倍体)的猕猴桃ꎮ Ｃｈｅｎ 等[９]
采用 ＷＰＢ 缓冲液分析得到枸杞物种基因组的大
小ꎬ 枸杞果实含有许多胞浆化合物(如酚酸类化合
物和黄酮类化合物)ꎬ 会干扰细胞核 ＤＮＡ 荧光染
色ꎬ 加入偏亚硫酸氢钠和黏合剂 ＰＶＰ￣１０ 可以防止
酚和次级代谢产物等的干扰ꎮ 笔者参考国外文
献[１０ꎬ１１]并结合对来自深圳市仙湖植物园 １２０ 份蕨
类和苔藓植物样本的实验发现ꎬ ＬＢ０１ 解离液比其
它种类解离液更适合该类植物的细胞核裂解ꎮ 表 １
中列出了实验中常用的 ８种植物细胞核解离液及其
配方ꎬ 以供大家参考ꎮ
７２１ 第 １期 汪 艳等: 流式细胞仪检测高等植物细胞核 ＤＮＡ含量的方法
１ ３ 参照样本的选择原则
流式细胞仪可以通过内标和外标法进行细胞核
ＤＮＡ含量测定ꎮ 常规的倍性分析多采用外标法ꎬ
而更精确的倍性分析建议采用内标法ꎬ 如检测异倍
体ꎮ 内标法可参照样本已知的染色体倍性ꎬ 推算测
试样品细胞核 ＤＮＡ 的绝对含量ꎬ 以避免因待测样
品的变异和机器工作状态不稳定带来的误差ꎮ 内标
法的参照样本应满足以下条件: 参照样本细胞核
ＤＮＡ含量已知且稳定ꎬ 同目标样本细胞核 ＤＮＡ含
量相近ꎻ 参照样本与目标样本的基因组大小范围相
近ꎻ 标准样本峰不能同目标样本峰重叠ꎬ 最好与目
标样本的 Ｇ２或 Ｍ期峰值不重叠ꎮ
目前在植物细胞核 ＤＮＡ 含量的研究中仍采用
鸡血红细胞用作植物材料的内参标准ꎬ 鸡血红细胞
来源多ꎬ 测定结果稳定ꎮ 如 Ｒｏｕｘ 等[１２]以鸡血红
细胞作为内参对照ꎬ 用流式细胞仪检测了香蕉细胞
核 ＤＮＡ 含量和染色体数目ꎻ Ｐｈｉｖｎｉｌ 等[１３]用已知
的大麦品种细胞核 ＤＮＡ 含量作为对照鉴定了多个
猕猴桃品种的倍性ꎮ 常用参照样本的倍性和细胞核
ＤＮＡ含量可见参考文献[１４ꎬ１５]ꎮ
１ ４ 荧光核酸染料的选择
不同荧光探针的选择对检测植物细胞核 ＤＮＡ
含量至关重要ꎬ 细胞核染料主要分 ２种ꎬ 特异标记
和非特异标记染料ꎮ 特异标记 ＤＮＡ 荧光染料是非
嵌入染色ꎬ 主要与 ＤＮＡ 的 Ａ￣Ｔ 碱基结合ꎬ 忽略了
ＤＮＡ还有很多 Ｇ￣Ｃ 碱基ꎬ 会造成检测基因组值偏
小ꎮ 因此最常用是非特异染料(如 ＰＩ)ꎬ 但此方法
操作时会使 ＤＮＡ和 ＲＮＡ也同时被染上色ꎬ 需要降
解 ＲＮＡ的干扰ꎮ 现将流式细胞仪常用荧光核酸染
料及其检测波长和特性列于表 ２ꎮ
１ ５ 植物样本优化
制备好的植物样品最好采用过滤方法和离心方
法进一步去除细胞碎片和黏连细胞ꎬ 这非常有利于
流式细胞仪上机检测和成峰效果ꎮＬｅｅ等[１６]通过
表 １ 常用解离液种类及组分
Ｔａｂｌｅ １ Ｍｏｓｔ ｐｏｐｕｌａｒ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ
序号
Ｎｏ.
解离液
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ
组分
Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ
１ Ｇａｌｂｒａｉｔｈ ４５ ｍｍｏｌ / Ｌ ＭｇＣｌ２ꎬ ３０ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅꎬ ２０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＭＯＰＳꎬ ０.１％(Ｖ / Ｖ) ＴｒｉｔｏｎＸ￣１００ꎬ ｐＨ ７.０
２ ＴｒｉｓＭｇＣｌ２ ２００ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｔｒｉｓꎬ ４ ｍｍｏｌ / Ｌ ＭｇＣｌ２６Ｈ２Ｏꎬ ０.５％ (Ｖ / Ｖ) ＴｒｉｔｏｎＸ￣１００ꎬ ｐＨ ７.５
３ Ｈｅｐｅｓ １０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏꎬ ５０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＫＣｌꎬ ５ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｈｅｐｅｓ (ｐＨ ８)ꎬ ６.５ ｍｍｏｌ / Ｌ ＤＴＴꎬ ０.２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ￣１００
４ ＷＰＢ
０.２ ｍｍｏｌ / Ｌ ＴｒｉｓＨＣｌꎬ ４ ｍｍｏｌ / Ｌ ＭｇＣｌ２６Ｈ２Ｏꎬ ２ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｎａ２ＥＤＴＡ２Ｈ２Ｏꎬ ８６ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮａＣｌꎬ
１０ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｎａ２Ｓ２Ｏ５ꎬ １％ ＰＶＰ￣１０ꎬ １％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ￣１００ꎬ ｐＨ ７.５
５ ＬＢ０１
１５ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｔｒｉｓꎬ ２ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｎａ２ＥＤＴＡꎬ ０.５ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｓｐｅｒｍｉｎｅ４ＨＣｌꎬ ８０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＫＣｌꎬ ２０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮａＣｌꎬ
０.１％ (Ｖ / Ｖ) ＴｒｉｔｏｎＸ￣１００ꎬ １５ ｍｍｏｌ / Ｌ β￣巯基乙醇ꎬ ｐＨ ８.０
６ ｍＧｂ
４５ ｍｍｏｌ / Ｌ ＭｇＣｌ２ꎬ ２０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＭＯＰＳꎬ ３０ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅꎬ １％ (Ｗ / Ｖ) ＰＶＰ￣４０ꎬ ０.２％ (Ｖ / Ｖ) ＴｒｉｔｏｎＸ￣１００ꎬ
１０ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｎａ２ＥＤＴＡꎬ ２０ ｍｍｏｌ / Ｌ β￣巯基乙醇ꎬ ｐＨ ７.０
７ ＧＰＢ ０.５ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｓｐｅｒｍｉｎｅ４ＨＣｌꎬ ３０ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅꎬ ２０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＭＯＰＳꎬ ８０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＫＣｌꎬ２０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮａＣｌꎬ ０.５％ (Ｖ / Ｖ) Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ￣１００ꎬ ｐＨ ７.０
８ ＯＴＴＯ
ＯＴＴＯ Ⅰ: １００ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄꎬ ０.５％ (Ｖ / Ｖ) Ｔｗｅｅｎ２０ꎬ ｐＨ ２.０ ~ ３.０
ＯＴＴＯ Ⅱ: ４００ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４１２Ｈ２Ｏꎬ ｐＨ ８.０ ~ ９.０
表 ２ 常用的荧光核酸染料
Ｔａｂｌｅ ２ Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ ｄｙｅｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｌａｂｅｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ
染料
Ｄｙｅ
激发 /发射波长
Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ / Ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ
特性
Ｆｅａｔｕｒｅ
Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２ ３４０ / ４５０ ｎｍ非嵌入 Ｎｏｎ￣ｅｍｂｅｄｄｅｄ 特异与 ＡＴ结合 Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄ ｗｉｔｈ ＡＴ
ＤＡＰＩ ３５０ / ４５０ ｎｍ非嵌入 Ｎｏｎ￣ｅｍｂｅｄｄｅｄ 特异与 ＡＴ结合 Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄ ｗｉｔｈ ＡＴ
７￣ＡＡＤ ５４０ / ６５０ ｎｍ嵌入 Ｅｍｂｅｄｄｅｄ 特异与 ＧＣ结合 Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄ ｗｉｔｈ ＧＣ
ＣＡ３ ４４５ / ５７５ ｎｍ 非嵌入 Ｎｏｎ￣ｅｍｂｅｄｄｅｄ 特异与 ＧＣ结合 Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄ ｗｉｔｈ ＧＣ
ＰＩ ５３５ / ６４０ ｎｍ嵌入 Ｅｍｂｅｄｄｅｄ 非特异性与碱基结合 Ｎｏｎ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｗｉｔｈ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ＥＢ ５２０ / ６２０ ｎｍ嵌入式 Ｅｍｂｅｄｄｅｄ 非特异性与碱基结合 Ｎｏｎ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｗｉｔｈ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
８２１ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷
比较 ＰＶＰ设计的棉花滤管过滤法与尼龙网过滤法
对提取液的过滤效果ꎬ 结果显示用棉花滤管过滤的
提取液能够去除多醣体ꎬ 效果优于尼龙网ꎻ 于红梅
等[１７]利用流式细胞仪检测草莓染色体倍性时ꎬ 以
匍匐茎尖或根尖的细胞为材料ꎬ 在常规提取液中添
加巯基乙醇ꎬ 采用细胞核 ＤＮＡ 悬浮液离心漂洗 ３
次后再经 ３００ 目尼龙网过滤的方法ꎬ 得到了理想
的结果ꎮ 裸子植物有较厚的角质层ꎬ 细胞内次生代
谢物质多ꎬ 需要较长时间解离细胞核 ＤＮＡꎬ 比被
子植物更难制备出完整的细胞核悬浮液ꎮ 因此ꎬ 制
备的新鲜样品如果当天检测细胞核 ＤＮＡ 的信号不
佳ꎬ 可将样品放置冰箱避光 １~ ２ ｄ后再上机检测ꎬ
效果也许会更好ꎮ
２ 流式细胞仪检测植物样本
２ １ 建立流式检测的方案
植物种类繁多ꎬ 染色体倍性复杂、 多样ꎮ 植
物细胞普遍存在内复制现象ꎬ 往往以多倍体的形
式存在ꎬ 造成细胞核 ＤＮＡ 含量的变化范围较大ꎬ
从 ２Ｃ到 １６Ｃꎬ 甚至到 １２８Ｃꎬ 因此对这类植物多
倍体宜采用动态范围宽的对数形式ꎮ 有些情况下植
物细胞核 ＤＮＡ倍性变化范围很窄ꎬ 可以参照动物
和人细胞动态范围小的线性关系ꎬ 则能更清楚地显
示不同物种间的变化ꎮ
植物物种众多ꎬ 细胞大小差异较大ꎬ 有些植物
细胞较小ꎬ 容易与碎片混淆ꎮ 实际操作中ꎬ 如果流
式细胞仪的 ＦＳＣ 阈值调得太高ꎬ 细胞与碎片会被
一起去掉ꎬ 反之细胞与碎片则无法分开ꎮ 我们的经
验是ꎬ 首先根据植物细胞大小ꎬ 确定植物细胞群位
置ꎬ 排除其它杂质、 背景噪音的干扰ꎬ 即确定合适
前向散射光(ＦＳＣ)阈值ꎻ 其次是去除黏连细胞ꎬ
其目的是避免假阳性结果ꎬ 保证多倍体细胞与黏连
细胞不被混淆ꎮ 流式细胞仪去除黏连细胞的方案有
许多ꎬ 常规方法是根据细胞面积和宽度来设计去除
黏连细胞ꎮ 然而ꎬ 在实际应用中也发现一些样品的
检测效果不好ꎬ 可换成采用侧向散射光(ＳＳＣ)和
ＰＩ荧光染料的通道去除黏连细胞以获得较理想的
结果ꎬ 这主要是 ＳＳＣ 参数能够更好地反映细胞核
聚集ꎮ 因此ꎬ 建立最佳流式细胞仪检测方案、 调节
合适电压也是流式细胞仪检测植物细胞核 ＤＮＡ 含
量的关键步骤ꎮ
２ ２ 应用实例
流式细胞术是一种简单、 快速、 高通量检测植
物倍性水平、 种内杂交、 单性生殖ꎬ 以及基因组的
大小、 多倍体和性染色体的方法ꎮ Ｃｏｕｓｉｎ 等[１８]在
６ ｈ 内对 １９２ 例芸苔属植物采用 ９６ 孔板 Ｂｅａｄ￣
Ｂｅａｔｉｎｇ制备方法ꎬ 通过流式细胞仪进行了细胞核
ＤＮＡ含量测定ꎬ 摸索出大规模高通量检测的方法ꎬ
且保证了数据和样品的可重复性ꎬ 是非常值得借鉴
的一种制备植物样品的方法ꎮ Ｄｏｌｅｚｅｌ等[１９]通过比
较 ４个实验室不同的操作人员、 不同方法、 不同仪
器估计细胞核 ＤＮＡ 基因组的大小ꎬ 结果显示各实
验室间差异较小ꎻ 使用 Ｇａｌｂｒａｉｔｈ ｂｕｆｆｅｒ 和 ＰＩ 能够
测定大多数植物种类的绝对基因组大小ꎬ ＰＩ 比
ＤＡＰＩ更可靠、 更适合用于评估植物基因组的大小ꎻ
当基因组差异较小时ꎬ 应该在同一实验室使用相同
的仪器来消除系统性误差ꎮ 在长期实验过程中我们
发现制备植物细胞核 ＤＮＡ 样本最关键的是选择合
适的细胞核解离液ꎮ 采用烟草和油菜为材料对 ８种
ＤＮＡ缓冲液进行比较ꎬ 我们发现 Ｈｅｐｅｓ 缓冲液适
合于大多数植物ꎬ 变异系数最小ꎻ 其次是 Ｔｒｉｓ
ＭｇＣｌ２和 ＬＢ０１(图 １)ꎮ 对于倍性相对复杂的植物ꎬ
因倍性越高ꎬ 变异系数也越大ꎬ 应选择与之相近的
物种标准品作内参ꎬ 以避免或减小误差ꎮ 笔者在此
将本实验室近期使用流式细胞仪(ＢＤ公司ꎬ ＡｒｉａⅢ
型)检测植物细胞核 ＤＮＡ 含量样本的使用方法归
纳列于表 ３ꎬ 供大家参考ꎮ
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n
8 DNA
Eight kinds of DNA buffer
) *+,
图 １ ８种 ＤＮＡ解离液测定烟草和油菜
细胞核 ＤＮＡ含量差异的比较
Ｆｉｇ １ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｅｉｇｈｔ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ
ｕｓｅｄ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｏｆ ＤＮＡ ｃｏｎｔｅｎｔ
ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ ａｎｄ ｒａｐｅ ｓｅｅｄ
９２１ 第 １期 汪 艳等: 流式细胞仪检测高等植物细胞核 ＤＮＡ含量的方法
表 ３ 流式细胞仪检测植物细胞核 ＤＮＡ含量的方法实例
Ｔａｂｌｅ ３ Ｅｘａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｕｎｃｌｅａｒ ＤＮＡ ｃｏｎｔｅｎｔ ａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ
物种
Ｓｐｅｃｉｅｓ
例数
Ｎｕｍｂｅｒ
标准品
Ｓｔａｎｄａｒｄ
解离液
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ
染料
Ｄｙｅ
蕨类 Ｐｔｅｒｉｄｏｐｈｙｔａ １２０ 烟草 Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ. ＬＢ０１ ＰＩ
软枣猕猴桃 Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ａｒｇｕｔａ (Ｓｉｅｂｏｌｄ ＆
Ｚｕｃｃ.) Ｐｌａｎｃｈ. ｅｘ Ｍｉｑ. １６７ 白杨 Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ Ｌ. Ｈｅｐｅｓ ＰＩ
高羊茅 Ｆｅｓｔｕｃａ ｅｌａｔａ Ｋｅｎｇ ｅｘ Ｅ. Ａｌｅｘｅｅｖ １２５ 黑麦草 Ｌｏｌｉｕｍ ｐｅｒｅｎｎｅ Ｌ. Ｈｅｐｅｓ ＰＩ
狗牙根 Ｃｙｎｏｄｏｎ ｄａｃｔｙｌｏｎ Ｌ. １４２ 狗牙根 Ｃｙｎｏｄｏｎ ｄａｃｔｙｌｏｎ ‘ＹＵＫＯＮ’ Ｈｅｐｅｓ ＰＩ
枸杞 Ｌｙｃｉｕｍ ｂａｒｂａｒｕｍ Ｌ. ２０ 烟草 Ｎ. ｔａｂａｃｕｍ Ｌ. ＷＰＳ ＰＩ
甘草 Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｕｒａｌｅｎｓｉｓ Ｆｉｓｃｈ. ｅｘ ＤＣ １３ 番茄 Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ Ｍｉｌｌ. ＷＰＳ ＰＩ
紫茎泽兰 Ｅｕｐａｔｏｒｉｕｍ ａｄｅｎｏｐｈｏｒｕｍ Ｓｐｒｅｎｇ ２ 小麦 Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ. ＴｒｉｓＭｇＣｌ２ ＰＩ
二穗短柄草 Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ (Ｌ.)
Ｐ. Ｂｅａｕｖ. ３ 小麦 Ｔ.ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ.
ＴｒｉｓＭｇＣｌ２ ＰＩ
东方狐尾藻 Ｍｙｒｉｏｐｈｙｌｌｕｍ ｏｇｕｒａｅｎｓｅ Ｍｉｋｉ ２ 穗状狐尾藻 Ｍｙｒｉｏｐｈｙｌｌｕｍ ｓｐｉｃａｔｕｍ Ｌ. Ｇａｌｂｒａｉｔｈ ＰＩ
金鱼藻 Ｃｅｒａｔｏｐｈｙｌｌｕｍ ｄｅｍｅｒｓｕｍ Ｌ. ８ 拟南芥 Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｌ. ＬＢ０１ ＰＩ
眼子菜 Ｐｏｔａｍｏｇｅｔｏｎ ｃｒｉｓｐｕｓ Ｌ. １５ 玉米 Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ. ＬＢ０１ ＰＩ
总之ꎬ 针对不同植物种类需要根据物种特性采
用不同的制备细胞核 ＤＮＡ 方法ꎮ 我们也将在今后
的实验中不断地探索ꎬ 以期总结出更好的方法ꎮ
参考文献:
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ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｅａｓｔ ｏｆ Ｄａｂａ Ｍｏｕｎｔａｉｎ ｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ
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ｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ ａｃ￣ｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ＤＮＡ: ｃｏｎｓｅ￣
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０３１ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷
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ｓｉｚｅ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ: ｉｎｔｅｒ￣ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
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(责任编辑: 张 平)
１３１ 第 １期 汪 艳等: 流式细胞仪检测高等植物细胞核 ＤＮＡ含量的方法
致谢 ２０１４年审稿专家(按汉语拼音排序)
２０１４年共有 ３９４位专家为«植物科学学报»审稿并及时返回意见ꎬ 使本刊论文的审稿、 出版工作顺利进行ꎮ 在此ꎬ 衷
心感谢诸位审稿专家的支持与辛勤付出ꎬ 向你们致以诚挚的谢意! 值此新年到来之际ꎬ 祝各位专家身体健康! 工作顺利!
新年快乐!
安调过 白岗栓 白文明 白学良 白中科 包维楷 毕润成 卜崇峰 卜兆君 蔡得田 蔡红梅 蔡士宾
蔡 霞 苍 晶 曹洪麟 曹坤芳 柴团耀 柴 岩 产祝龙 常朝阳 车代弟 陈本建 陈常颂 陈发兴
陈飞鹏 陈伏生 陈 阜 陈家春 陈金印 陈 清 陈清西 陈随清 陈 彤 陈文俐 陈小勇 陈学好
陈耀锋 陈媛媛 陈之端 程方民 程红焱 程中平 淳长品 崔大方 崔 林 达良俊 戴思兰 戴廷波
刀志灵 邓光兵 邓 馨 丁炳扬 丁兰平 丁小余 丁 毅 董学会 董银卯 杜长霞 杜智渊 樊大勇
范世香 范志伟 方保停 方 伟 方炎明 房敏峰 冯玉龙 傅金民 高捍东 高 健 高江云 高连明
高微微 高贤明 高照全 葛 刚 葛继稳 葛学军 耿宇鹏 龚 宁 龚燕兵 龚自明 谷 超 郭友好
郭宝林 郭明全 郭巧生 郭泉水 郭守玉 郭水良 郭忠升 韩明玉 韩文炎 韩永华 韩月彭 韩振海
郝占庆 何 东 何祖华 和兆荣 呼天明 胡征宇 胡海波 胡 晋 华 燕 黄丽清 黄荣峰 黄 伟
黄 湘 黄学林 黄友谊 季春峰 季梦成 贾克功 贾 渝 江 东 江明喜 蒋继宏 金泰松 康 明
康向阳 孔建强 匡延凤 赖广辉 黎 裕 李爱芬 李承森 李德全 李法曾 李佛琳 李国怀 李 恒
李家儒 李建强 李立家 李良俊 李 灵 李仁辉 李荣生 李韶山 李世晋 李 伟 李西林 李锡文
李先琨 李旭光 李夜光 李意德 李银心 李永春 李余良 李兆华 李振基 李志能 李作洲 栗茂腾
梁国鲁 梁建萍 梁 威 梁炫强 梁宗锁 廖海民 廖文波 林宏辉 林金星 林顺权 刘传和 刘春明
刘冬碧 刘娥娥 刘贵华 刘好宝 刘侯俊 刘华杰 刘继红 刘建全 刘孟军 刘 鹏 刘琪璟 刘 青
刘青林 刘 庆 刘全儒 刘素青 刘 伟 刘文治 刘昱辉 刘振稳 龙春林 卢新民 卢志军 陆静梅
吕金印 吕世友 吕一河 罗世孝 罗毅波 马国华 马金双 马守才 孟宪军 孟昭东 孟昭福 宁 珏
宁熙平 牛吉山 潘青华 裴雁曦 彭方仁 彭 华 彭建营 彭抒昂 彭霞薇 彭玉兰 邱明华 钱虎君
任 海 阮建云 上官周平 尚占环 邵小明 佘冬立 申晓辉 沈海龙 沈生荣 沈永宝 施季森 石福臣
石 磊 史刚荣 司马永康 宋 杰 宋经元 宋文芹 苏建荣 苏志尧 隋 春 孙崇德 孙广玉 孙 航
孙 坤 孙蒙祥 孙同兴 孙涌栋 孙振元 孙志虎 田长彦 汪贵斌 汪 洪 汪李平 汪俏梅 汪阳东
王青锋 王德群 王冬梅 王根绪 王恒昌 王 红 王 红２ 王华田 王家保 王建波 王 坤 王立松
王 鲁 王明奎 王 沫 王乔春 王仁卿 王瑞江 王三根 王树森 王 艇 王文和 王孝安 王秀娥
王彦昌 王 瑛 王有为 王幼芳 王峥峰 王子成 魏江春 魏钦平 魏新增 魏印心 文晓鹏 吴炳方
吴承祯 吴 俊 吴鹏程 吴鹏飞 吴耀生 吴永波 吴振海 吴 震 吴自明 夏光敏 夏建国 向凤宁
向增旭 肖华山 谢国文 谢海辉 谢树莲 熊高明 徐芳森 徐凤霞 徐 进 徐克学 徐旭东 徐志宏
许 敏 薛建华 闫 明 杨德奎 杨光耀 杨汉奇 杨虹琦 杨九艳 杨丽涛 杨 美 杨平仿 杨亲二
杨淑华 杨献光 杨亚军 杨 永 杨 勇 杨宇明 杨玉义 杨允菲 杨珍平 姚小洪 叶华谷 叶建农
叶庆生 叶万辉 尹林克 尤江峰 于 强 喻 敏 原作强 袁 琼 苑兆和 臧润国 曾凡坤 詹亚光
张全发 张成武 张椿雨 张大明 张奠湘 张恩让 张 峰 张 峰２ 张 钢 张桂莲 张建锋 张金屯
张克荣 张 磊 张 蕾 张 力 张丽霞 张 利 张木清 张荣京 张绍铃 张石宝 张宪春 张一平
张元明 张 媛 张跃进 张增艳 章焰生 赵 斌 赵长崎 赵德修 赵建成 赵井泉 赵 平 赵政阳
赵遵田 郑成淑 郑海雷 钟 扬 周 涛 周铜水 朱 华 朱俊义 朱瑞良 朱兴一
«植物科学学报»编辑部
２０１５年 ２月
２３１ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷