全 文 ：武汉植物学研究 2008，26(4)：325～328
Journal of Wuhan Botanical Research
云南小麦高分子量麦谷蛋白亚基基因1Dy12 的分离
代小华，房敬业，李宗瑾，刘 勇，邹 珂，汪越胜，常俊丽，何光源
(华中科技大学生命科学与技术学院，分子生物物理教育部重点实验室，武汉 430074)
摘 要：通过 SDS．PAGE分析，从云南小麦中鉴定出一个电泳迁移率比高分子量麦谷蛋白亚基 1Dyl2稍快的亚基
1Dyl2 。利用 Glu．Oy位点特异引物对 1Dyl2 基因编码区进行了克隆和序列测定。1Dy12 基因全长为 1980 bp，
编码 658个氨基酸。氨基酸序列比较结果表明：与亚基 1Dyl2相比有3个氨基酸的差异和 1个二肽(GQ)的缺失 ，
与亚基 1DylO相比有 15个氨基酸的差异、2个六肽(IGQGQQ)的插入以及 1个二肽(GQ)的缺失。这表明 1Dyl2
亚基是一个新型高分子麦谷蛋白亚基，其对小麦加工品质的影响正在评价中。
关键词：云南小麦；高分子量麦谷蛋白亚基；序列分析
中图分类号：Q946．1 文献标识码 ：A 文章编号：100o一470x(2008)04·0325—04
Isolation of High M olecular W eight Glutenin Subunit Gene 1Dy12
from Yunnan Wheat(Triticum aestivum subsp．yunnanense King)
DAI Xiao—Han，FANG Jing．Ye，LI Zong—Jin，LIU Yong，ZOU Ke，
WANG Yue．Sheng．CHANG Jun．Li．HE Guang．Yuan
(Key Laboratory ofMolecular Biophysics，Ministry ofEducation，Huazhong University ofScience and Technology(HUST)，Wuhan 430074，China)
Abstract：A novel y-type high molecular weight glutenin subunit(HMW—GS)possessing a slightly faster
mobility than that of subunit 1 Dyl 2 was identified through SDS．PAGE analysis．designated 1 Dyl 2 in
Yunnan wheat f Triticum aestivum subsp．yunnanense King)．The coding region of HMW—CS gene 1Dyl2
was isolated and sequenced with Glu—Oy locus specifc primers．The complete open reading frame(ORF)
of 1Dyl2 was 1980 bp．encoding 658 amino acids．Comparison of amino acid sequences showed there
were 3 amino acid differences between subunits 1 Dyl 2 and 1 Dyl 2 and a deletion of dipeptide(GO)in
subunit 1 Dyl 2 ．Also．there were fifteen amino acid differences between subunits 1 Dyl 2 and 1 Dyl 0．two
hexapeptides(IGQGQQ)insertions and a deletion of dipeptide(GQ)in subunit 1 Dyl 2 ．This showed
that subunit 1 Dyl 2 iS a novel HMW．GS．and it iS in process of evaluating subunit 1 Dvl 2 to effect
wheat processing quality．
Key words：Yunnan wheat；HMW．GS：Sequence analysis
小麦高分子量麦谷蛋白亚基(high molecular
weight glutenin subunit，HMW—GS)约占种子储存蛋
白的10％、谷蛋白的25％ ～35％。国内外大量研究
表明，普通小麦的 HMW—GS组成和面包烘烤品质之
间的相关性高达45％ ～78％ ，因此 HMW．GS是
小麦储存蛋白中决定小麦加工品质的重要组分 ]。
在普通小麦(Triticum aestivum L．)中，HMW—GS分别
位于第一同源群染色体 1A、1B和 1D染色体长臂
上，分别命名为 Glu．A1、Glu．B1和 Glu．D1。每个位
点可分别编码 1个分子量高的x型亚基和 1个分子
量较低的Y型亚基。由于受基因沉默的影响，普通
小麦品种通常只表达 3～5个 HMW．GS。Payne等
研究表明在小麦中 HMW—GS基因的变异与小麦的
加工品质有密切关系 ，因此从小麦及其近缘种鉴
定和分离新 型的 HMW—GS变异体对研 究小麦
HMW．GS基因进化和变异及其对小麦加工品质的
影响具有重要意义。迄今为止，国内外研究者在小
麦及其近缘种中已经分离出40多个HMW．GS基因。
云南小麦( aestivum subsp．yunnanense King，
2n=6x=42，AABBDD)又称云南铁壳麦，是云南省
独有的宝贵小麦种质资源和中国特有的普通小麦亚
种之一 J。云南小麦具明显不同于现有栽培普通小
麦品种的形态学特征，如脆穗、壳色、难脱粒等，并具
有抗旱、耐热、耐贫瘠、抗条锈病、抗穗发芽等优异农
艺性状，以及蛋白质含量高、品质好和面筋强度大等
优异品质性状L8]。魏育明等_9 和王海燕等Ll。。分别对
收稿日期：2008．03．10，修回日期：2008—05．07。
基金项目：国家973计划项目资助课题(2002CB111301)。
作者简介：代小华 、房敬业同为第一作者。代小华(1978一)，女，博士研究生；房敬业(1979一)，男，博士研究生，从事植物基因工程研
究；何光源(1958一)，男，华中科技大学特聘教授，博士生导师。
十 通讯作者(Author for corespondence．E-mail：hegy@hust．edu．cn)。
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326 武 汉 植 物 学 研 究 第 26 卷
云南小麦的 H M W ． G S 的组成和遗传多样性进行 了研
究 。 本文报道 了从 云 南小麦 中所鉴 定 的 一 个 y 型 高
分子量麦谷蛋 白新亚 基 ，该亚 基 比亚 基 1D yl2 的迁移
率稍快 ；并对其编码基 因进行了克隆与序列分析 。
1 材料与方法
1 ． 1 材 料与方法
云 南 小 麦 (T riticum aestivum subsp． yun na nense
K ing)材料
‘ Y N ll’ 由中国农业科学院作物科学研究
所李秀全 和杨欣 明提供 ， 以 ‘ 中国春 ’ (H M W — G S 组
成 ：null，7 + 8， 2 + 12 )作为 高分子 量 麦谷 蛋 白亚 基
标准对照材料 。
1 ． 2 种子 蛋 白提取 和 S D S - P A G E 分析
种子蛋 白提 取 和 S D S ． P A G E 分析 按 刘 勇等⋯ 0
的方法进行 。
1 ． 3 基 因组 总 D N A 提取 和 P C R 扩增
云 南小麦材料 ‘ Y N l1 ’ 基 因组 D N A 的提取 按 汪
越胜等 r1。0的方法进 行 。 根 据 已 发 表 1 D ylO 和 1 D yl2
基 因的序列 ¨L " j，设计 了 一 对用 于 扩增 1 D y 基 因完
整编码 区 的 一 对特异引物 (P 1 ：5 ’ 一 A T G G C T A A G C G —
G C T G C T C C T C l] r] rG C G G 一 3 ’ ． P 2 ：5
’
一 C T A T C T G G C T A —
G C C G A C A A T G C G T ． 3 ’ )。 引 物 由北 京 奥 科 生 物 技
术有限公 司合成 。 P C R 反应 混 合物包 括 25 斗L × G C
bu雎 r ，0． 2 m m o~ L dNT P ， 引 物 各 0． 5 Ixm ol， 2． 5 U
L A 细 D N A 聚合酶 (T aK aR a )， 100 ng模板 D NA ，加
双 蒸水 至 总 量 50 止 。 反 应 条 件 为 ：94 0C 预 变 性
5 m in ， 然后 94 ℃ 变性 4 5 S ， 62 0C 退 火 l m in ，72℃ 延
伸 2 m in ， 反应 35 个循环 ，最后 72~C 延 伸 10 m in 。
1 ． 4 目的基 因的克隆 、 测序 与序 列分析
P C R 产 物 用 1％ 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 分 离 ， 用
W atson D N A 胶 回收试剂盒 (上 海华舜生物工 程有限
公 司 )回收 目的 D N A 片段 ， 然后 将纯 化 的产物连接
到 pG E M — T 载 体 (P rom ega )上 ， 转 化 大 肠 杆 菌 D H ．
5 o【， 涂布于含有氨苄青霉素(A M P )的 L B 培养基 上 。
挑选 生长 良好 的单菌落 ，用 克隆引物进行扩增检测 ，
初步筛选 出重 组 子 阳性 克隆 。 经 质粒 酶切 鉴 定后 ，
将筛选 出的阳性 克隆进行测 序 ， 序列 测 定 由北 京奥
科生物技术有 限公司完成 。 序列 分析用 N C B I 网站
的相关软件和 C lustalW 完成 。
2 结果 与分析
2． 1 S D S - P A G E 分析
S D S - P A G E 分析表 明 ， 云 南小麦材料 ‘ Y N ll’ 表
达 4 个 H M W — G S ， 其 中在 G lu ． D 1 位点上 ， 有 一 个亚
基 比 ‘ 中国春 ’ 的1 D yl2亚 基稍快 (图l：泳道2)， 我们
将其命名为 1 D yl2
’
亚 基 ， 而 另外 一 个亚 基 是 1 D x2 ，
因此 它们 共 同组 成 了 一 对 新 的等 位 基 因 (1 D x2 +
1 D yl2
’
)。
1 ：
‘ 中国春 ’ ； 2 ：云 南小麦 ‘ Y N ll
’
1 ：
‘ C hinese spring
’
； 2 ：Y un n an w heat accession
‘ Y N ll’
图 1 云 南小麦 ‘ Y N ll’ 高分子量 麦谷蛋 白亚 基
S D S ． P A G E 的鉴定
F ig． 1 Identification ofH M W ． G S in Y u nn an
w heataccession ‘ Y N 】】
’
2． 2 P C R 扩增 与 1 D # 2
‘ 基 因的克隆
以云 南小麦材料 ‘ Y N ll’ 基 因组 D N A 为模板 ，
用 引物 P l和 P 2 进行 P C R 扩增 ， 在约 2． 0 kb处 出现
单 一 条带 (图 2)， 与预期 目标片段 大小 一 致 。 目标
片段 回收 、 纯化 ， 然后连接到 pG E M ． T 载体上 并转化
到大肠 杆菌 。 经 菌落 P C R 和质粒酶切 鉴 定后 ， 获得
阳性 克隆 plD yl2
’
。
2． 0 kb
1_2 kb
泳道 M ：M arker； 泳道 1 ：P C R 扩增产物
L an e M ：M olecular m ar ker ； L an e 1 ：P C R am plification product
图 2 云 南小 麦 1 D yl2
’ 编码 基 因的 P C R 扩增
F ig． 2 P C R am plification productof1D yl2
’
subunit
gen e from Y u n nan w heat
2． 3 核苷酸序 列分析与氨基 酸序 列 比较
核苷 酸 序列 测 定结果 表 明 ， plD yl2
’ 质粒 插 入
片段长度为 1980 bp。 该 片段 具 有完整 的开 放 阅读
框 (O R F )， 编 码 658 个 氨 基 酸 ， 分 子 量 大 小 约 为
68． 5 kD 。 由于 高分子量麦谷蛋 白亚 基没有 内含子 ，
因此可 以根据编码 序列推导 出氨基 酸序列 。 推导 的
1 D yl2
’
亚 基 的氨基 酸 序列 与其它 高分 子 量 麦 谷 蛋
白亚 基 一 样拥有共 同的特征 ：前 2l氨基 酸为高度保
守 的信号肽序列 ， 在蛋 白质合成后 穿过 内质 网膜进
入 内质网腔被切除从 而变成成熟 的蛋 白质 ；其成熟
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第 4期 代小华等：云南小麦高分子量麦谷蛋白亚基基因1Dyl2 的分离 327
蛋白含有 3个明显的结构域，首先是一个含有 104
个氨基酸的 N．末端保守区，然后是一个含有491个
氨基酸的中部重复区，最后是一个含有42个氨基酸
的C．末端保守区。中部重复区中含有 49个六肽
(PGQGQQ)、19个9肽(GYYPTSLQQ)，以及位于重
复区起始端的十一肽 (GYYPSVTSPRQ)、十二肽
(GSYYPGQASPQQ)和重复区末端的三肽(GYN)；
其中重复区起始端的十一肽和十二肽可能来自九肽
的分化，重复区末端的三肽可能来 自九肽的退化。
在中部重复区没发现 x型所特有的三肽(GQQ)类
型。1Dy12 亚基的氨基酸序列含有 7个半胱酸，5
个在N一末端区的31、43、65、66和76位，另外两个分
别在中部重复区的544位和C．末端区的636位。
将 1Dyl2 编码的氨基酸序列与亚基 1Dyl0和
1Dyl2的氨基酸序列进行了比较，结果表明(图3)，
1Dyl2 与1Dyl0和1Dyl2结构相似，在信号肽、N．末
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MAl(RL1I『LF从vvIALvALTTADGEASRQLQCEP~ OESSLEACRQVVDQQLAGRLPWSTG
MA~ VLFAAW lALVALTTAEGEASR QcER甩QESSLEACRQV~ OLAGRLPWSTG
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-．1
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十 c 区doma
图 3 亚基 1Dy12 与 1Dy12和 1DylO的氨基酸序列比较
Fig．3 Comparisons of the animo acid sequences of the subunits 1 Dyl2 ，1 Dyl2 and 1 Dyl0
协 协 协 协
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328 武 汉 植 物 学 研 究 第 26卷
端区和 c．末端区无论在氨基酸数 目还是在组成上
都完全一样，主要差异在中部重复区。与1Dyl2相
比，在 1Dyl2 的中部重复区有 3个氨基酸的替换和
1个二肽(GQ)的缺失；具体部位为156位的甘氨酸
(G)的替换为天冬氨酸(D)，415位的谷氨酸(E)替
换为甘氨酸(G)，617位的天冬氨酸(D)替换为天冬
酰氨(N)，以及475和 476位二肽(GQ)的缺失。与
1Dyl0相比，在 1Dyl2 的中部重复区有 15个氨基
酸的替换、2个六肽(皆为 IGQGQQ)的插入以及 1
个二肽(GQ)的缺失。这又一次说明了高分子量麦
谷蛋白亚基的大小主要由中部重复区的重复肽段的
数目多少造成的。因此 1Dyl2 是一个高分子量麦
谷蛋白亚基新基因。
3 讨论
在本研究中，我们从云南小麦中鉴定了一个新
的高分子量麦谷蛋白亚基 1Dyl2 ，对其编码的基因
进行了克隆，并对该亚基编码的氨基酸序列与普通
小麦D染色体组所编码的2个亚基 1Dyl0和 1Dyl2
的氨基酸序列进行了比较，结果表明亚基 1Dyl2 不
同于亚基 1Dyl0和 1Dyl2。在氨基酸序列上，亚基
1Dyl2 与亚基 1Dyl0和 1Dyl2在信号肽、N一末端区
和 c．末端区的氨基酸组成和数目分别是相等的，其
差异表现在中部重复区的氨基酸残基的替换和重复
肽段的数目。亚基 1Dyl2 与亚基 1Dyl2氨基酸序
列相似性达99．14％，只有3个氨基酸的差异以及 1
个二肽(GQ)的缺失。3个氨基酸的替换和 1个二
肽(GQ)的缺失可能是导致亚基 1Dyl2 在 SDS—
PAGE上电泳迁移率稍快于亚基 1Dyl2的原因。此
外，这 3个氨基酸的替换和 1个二肽(GQ)的缺失是
否影响其蛋白质结构，进而影响其表达，还有待进一
步研究。
虽然在基因和氨基酸序列上推断 1Dy12 是高
分子量麦谷蛋白亚基家族的一个新成员，但其在小
麦加工品质改 良的潜在利用价值仍有待进一步研
究，可以利用转基因技术和建立近等基因系来研究
亚基 1Dyl2 对小麦加工品质的影响，目前此研究正
在进行之中。 ’
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