全 文 ：武汉植物学研究2007，25(1)：93～97
Journal of Wuhan Botanical Research
蜡梅 AFLP分子标记技术体系的建立
赵冰，张启翔
(北京林业大学园林学院，北京 100083)
摘 要：利用简易 CTAB法、改良的CTAB法和SDS法提取蜡梅[Chimonanthus praecox(L_)Link]成熟叶和嫩叶的
基因组，并进行了检测比较。结果显示，改 良的 CrAB法更适合蜡梅基因组 DNA的提取，蜡梅叶片的年龄并不影响
蜡梅基因组 DNA的提取；同时利用AFLP分子标记技术，采用MseI一 R I酶切组合，从 168对引物中筛选出 10
对带型分布均匀、多态性高且分辨能力强的引物，分别为：M23FA6、M24FA6、M25FA6、M23FA7、M24FA7、M41FA7、
M41E94、M64E94、M64E66和M24E75，并确定了适用于蜡梅AFLP反应的最佳酶切连接、预扩和选扩体系，从而为
今后利用 AFLP分子标记技术研究蜡梅的品种分类和野生居群的遗传多样性分析打下坚实的基础。
关键词：蜡梅[Chimonanthuspraecox(L．)Link]品种；DNA提取；AFLP反应体系
中图分类号： 86；$685．99 文献标识码：A 文章编号：1000—470X(2007)01—0093—05
The Establishment of AFLP M olecule Labeling Technique
System of the W intersweet Cultivars
ZHAO Bing，ZHANG Qi—Xiang
(Colege ofLandscapeArchitecture，&扣 Forestry University，Beijing 100083，China)
Abstract：The methods of CTAB，improved CTAB and SDS were used for genomic DNA isolation of
climax leaves and young leaves of Wintersweet eultivars．Th e results indicated that the method s of CTAB
was useful in W intersweet eultivars genomic DNA isolation，and the leaf age doesn’t afect genomic DNA
isolation of Wintersweet eultivars．By the amplifed fragment length polymorphisms(AFt )technique，
using MseI-EcoR I enzyme—cut combination，ten pairs of primers(i．e．M23E46，M24E46，M25E46，
M23~7，M24E47，M41E47，M41E94，M~E94，M~E66 and M24E75)with high polymorphism and
powerful distinctiveness were selected from 168 pairs of primer，and the best pre—expan ding an d selective
expan ding system were determined．Our results tentatively established the basis for the research of the
euhivar classifcation an d gentic diversity an alysis．
Key words：Wintersweet cultivars(Chimonanthus praecox(L_)Link)；DNA extraction；AFLP reaction
system
蜡梅[Chimonanthus praecox(L．)Link]指蜡梅
科蜡梅属的落叶丛生灌木，是我国特产的传统名花
和特有经济树种，在我国已有一千多年的栽培历史，
因其花色鲜艳，花香浓郁，现已广泛应用于我国的园
林绿化中⋯。AFLP(限制性 内切酶片断长度多态
性)是荷兰科学家 Zabeau和 Vos【2 于 1993年建立
的一种 DNA多态性的分子标记技术。它结合 了
RFLP和PCR的优点，具有带纹丰富、灵敏度高、稳
定性好等优点，该技术现已被广泛地应用于观赏植
物的亲缘关系及遗传多样性研究中，如梅花(Prunus
mum．) 、菊花 (Dendranthema grandiflorum) J、山
茶(Cam．Iliajaponica) 等，但是有关蜡梅的 AFLP
分析却鲜见报道。因此，本研究以河南鄢陵的14个
蜡梅品种为试材，旨在探讨出适合蜡梅基因组 DNA
提取的方法和建立起蜡梅 AFLP反应的最佳体系，
从而为下一步的蜡梅品种鉴定及野生居群的遗传多
样性分析等研究奠定基础。
1 材料与方法
1．1 材料
蜡梅[Chimonanthus praecox(L．)Link]14个供
试样品采自河南省鄢陵县园艺场，每一品种采 自5
个株系，分别于 2005年4月和2005年 1O月取其幼
嫩和成熟叶片放于5倍于其体积的硅胶中，干燥后
收稿13期：2006-05-31，修回13期：2006-08-31。
基金项目：国家十五攻关项目(2004BA525B11)资助。
作者简介：赵冰(1980一)，女，博士研究生，主要研究方向为园林植物种质资源的调查和核心种质的构建(E—mail：bingbing2003915@
163．com)。
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武 汉 植 物 学 研 究 第 25卷
室温保存，备用。
1．2 方法
1．2．1 模板 DNA的制备
本实验采用 3种方法提取蜡梅基 因组 DNA，
CTAB法和 SDS法参照文献[6]和[7]的方法，改 良
CTAB法的具体操作步骤如下：在2 mL圆头离心管
中加人 I～2片干燥后的叶片，放人液氮用尖头玻棒
迅速研磨成粉末状，加入 700 CTAB缓冲液和
7 的巯基乙醇混匀。65℃水浴 1 h后置于4℃冰
箱冷却至l5℃以下，然后加入250 24：1氯仿／异
戊醇，上下混匀，13 000 r／rain离心10 min，取上清液
300 IxL，再次加人250 24：1氯仿／异戊醇，上下
混匀，13 000 r／rain离心 10 rain，取上清液 200 IxL
加人1．5 mL离 心管 中，并加 人预 冷 的异 丙 醇
200 IxL，轻轻上下颠倒混匀。4℃冰箱静置30 min以
上，沉淀 DNA。13000 r／min离心 10 min，弃上清
液 ，用无水乙醇洗涤沉淀 2次，吹干 DNA，让异丙醇
和乙醇挥发干净。加人 100 IxL dd H20(含 1 IxL
10 mg／mL的Rnase)溶解 DNA。37℃水浴 1 h去除
RNA。再次加人 100 24：l氯仿／异戊醇以去除未
除尽的蛋白和 RNA酶，13000 r／rain离心 10 rain，取
上清液8O 加人 1．5 mL离心管中，并加人预冷的
异丙醇 100 ，轻轻上下颠倒混匀。4℃冰箱静置
30 min以上，沉淀 DNA。13000 r／min离心 10 min，
弃上清液，用无水乙醇洗涤沉淀 2次，吹干 DNA，让
异丙醇和乙醇挥发干净。加入 50 dd H：0溶解
DNA，经检测后将其放人一20℃储存或放人4℃待用。
1．2．2 DNA浓度与质量测定
用 Bio·RAD SmartspecMT3000紫外分光光 度
仪测定样品的 OD值，以 1％琼脂糖凝胶检测 DNA
主带质量：5 DNA样品 +1 溴酚兰上样缓冲
液，加样于含溴化乙锭(EB)的凝胶上，在 8O V恒压
下电泳 3O～40 min，在紫外凝胶成像系统下观察
摄像。
1．2．3 酶切连接
本实验采用 MseI和EcoR I两种限制性内切酶
进行双酶切 ，然后用 T4 DNA连接酶，将 MseI和
EcoR I接头与酶切片断连接起来，酶切连接一步完
成，在 PCR仪上 37℃反应 3 h。构建成预扩增模板
DNA，该模板 DNA可用于扩增反应，该实验采用 4
种酶切连接体系，每个酶切连接反应体系为5O 。
酶切连接体系见表1。
表 1 酶切连接体系
Table 1 Systems of restriction-ligase reaction ( )
试剂 体系I 体系2 体系3 体系4
Reagent System I System 2 aII 3 System 4
基因组模板DNA(100-500 ng)
EcoR I(10 U／ )
Msd(10 U／ )
EcoR I adaptor(5 pmoL／ )
Msel adaptor(50 pm0L／ 工)
ATPf 10 mmol／L)
10×NEB bufer 2缓冲液
T．DNA连接酶(1 u)
BSA(10 ms／mL)
5 5 5 5
O．5 O．25 U O．5 U O．25 U
0．5 0．25 U O．5 U O．25 U
1．O 1．O 1．O 1．O
1．O 1．O 1．O 1．O
1．0 1．O 1．O 1．O
5．O 5．O 5．O 5．O
1．O 1．O O．5 O．5
O．25 O．25 O．25 O．25
补足 dd H20到总体积为 5O
1．2．4 预扩增
由于MS 能与 dNTP结合而影响PCR反应液中
游离 的Mg2 浓度，因而 MgCI：的浓度在不同的反应
体系中应适当调整，优化浓度。一般反应 中Mg2 浓
度至少应比dNTP总浓度高0．5～1．0 mmol／L。为了
探讨蜡梅的最佳预扩增体系，本实验的预扩体系
(每个预扩增反应体系为2O )有4种方案(见
表2)。预扩增 PCR反应程序为：94~C 30 s、56oC
30 S、72oC 60 S，共 24个循环。
表 2 预扩体系方案
Table 2 Systems of prcamplification ( )
试剂 体系 l 体系2 体系3 体系4
Reagent System l System2 System 3 System 4
酶切连接后模板
Eco-primer(50 rig／ )
Mse-primer(50 ng／p．L)
dNTPs(10 mmol／L)
Mg2 (25 mmol／L)
10×PCR buf er
Taq-pdym~ e(SU)
5．0 5．0 5．0 5．0
O．6 O．6 O．6 0．6
O．6 O．6 O．6 0．6
0．4 0．4 0．4 0．4
1．O 1．1 1．2 1．3
2．O 2．O 2．O 2．O
O．2 O．2 O．2 O．2
补足 dd H20到总体积为 20 L
1．2．5 选择性扩增
本实验的选扩体系(每个选扩反应体系为
20 )也采用4种方案(见表3)。选择性扩增PCR
反应程序为：90oC 30 s．65～56oC 30 S，每个循环降
低 0．7℃；72℃ 60 S，共 l2个循环。然后 94℃ 30 S、
56℃ 3O s、72℃ 60 S，共 24个循环。
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第 1期 赵 冰等：蜡梅AFLP分子标记技术体系的建立
表 3 选扩体系方案
Table 3 SyNems of Iecdve amplificatiou (“L)
预扩lO倍稀释后模板
Mse-primer(50-~／ )
Eoo-p~mer(50 n lLI．)
dNTP~(10 mmo]YL)
Mg2‘(25 mmol／L)
10×PCR bufex
r却-p0bm⋯ (5uj
5．D 5 0 5．0 5．0
1．0 1．0 1．0 I o
1．0 1 0 1 0 1 0
0．4 0 4 0．4 0．4
1．D i．1 1．2 l 3
2．D 2．0 2．0 2 0
0．2 0 2 0 2 0 2
补足dd H2O到总体职为2O
I．2．6 聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测
反应结束后在20 反应体系中加人 5 加
样缓冲液，95~C 8 min后迅速将 PCR管放到冰上进
行变性，然后置于 一20℃冰箱用于电泳检测。本实
验采用聚丙烯酰胺凝胶 电泳和银染的方法进行检
测 银染后的板晾干后在 x线胶片观察灯下观察．
选择那些具有清晰、电泳带易计数的引物怍为 AFLP
反应的最佳引物。
2 结果与分析
2．1 基因组DNA提取结果与检测
本实验采用 3种方法均能提取蜡梅基因组
DNA，但是采用改良的 CTAB法提取的蜡梅基因组
DNA，其OD ／OD 比值在 1．8左右(见表4)，表明
蛋白质等杂质去除较干净，DNA纯度较高；用 1％琼
脂糖凝胶检测，提取的 DNA不含 RNA，无降解，点
样孔干净。纯度符台 AFLP要求(见图 1)。SDS法
和CTAB法 所获得 的DNA，OD ／OD2 偏低 (见
表 4 不同提取方法所得 DNA 的检 圊4结果
Table 4 The detective result of wintersweet cultivars]caves by diferent isolalion method s
表4)，DNA样品受蛋白污染较严重，电泳结果点样
孔发亮，而且简易 CTAB法提取的 DNA有稍微的降
解(见图1)。实验证明改良的CTAB法最适台蜡梅
基因组的提取。采用改良的 CT?d~法对 14个品种的
成熟叶和嫩叶进行 DNA的提取，琼脂糖凝胶结果表
明．二者所提取的 DNA并没有明显的区别(见图2)。
A： I姆 法 It：改 良 CTAB浊 ；C：ClAB法
A：SDS n~th!tls；B：Imp~ ed CTAB method．~；C：CTAB mdh0d
图 1 不同提取方法提取DNA的琼脂糖凝殷电泳结果
F／g．1 DNA electropheragran~ of difemnt isolation methods
top： J he I)N^ 【l climax J⋯ ；[~,ttom：J he N¨A of -,ung】ea
图2 不同年龄叶片提取DNA的琼脂糖凝殷电泳结果
Fig．2 DNA electropherograms of diferent age．1eaves
2．2 蜡梅AFLP最佳反应体系的建立
酶切连接是否完全直接影响到实验结果的正确
性。非完全酶切，必然造成相应的指纹片断的缺失+
得出不完整的片断信息而失真。同时也会使大片段
增多不便于数带(见图 3：A) 酶叨时间也不能过
长 否则会出现 DNA部分降解，造成小片段过多，如
图3：B。对 4种酶切反应体系的酶 切连接产物进行
预扩后进行凝胶电泳检测可知，体系 j的效果较好，
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其在凝胶上呈现均匀的弥散状
预扩增这一步扩增所用引物不带选择性碱基，
通过扩增达到富集 DNA的目的，同时通过对预扩增
产物的检测，了解酶切和连接的效果，如果前几步反
应完全．则预扩增后 DNA片断多．在胶上可以看到
较长而均匀的宽带，相反若扩增片断少，且集中分布
于较小的bp值范围内．则说明双酶切不完全 这样
的预扩增产物是不适合进行下一步反应的。对4种
^
B
：^酶功不完垒；I{：晦加时 l过K
A：lneomplele rese ction-ligase：B：Too long restriction一[iga．se time
图 3 不同酶切时间的指纹片断结果
Fig．3 耵1e fingerprint snippet res【IltB of
diferent陀8t c 帆 ．]iSase time
蜡梅预扩增反应体系的预扩产物进行凝胶电泳检测
发现：体系3的效果较好(见图4)。
图4 预扩产物凝胶电泳检测结果
Fig．4 Faectrophem~ams of preamplhqeatlon pr(K]uct
选择性扩增这一步反应与预扩增一样．所不同
的是选用的引物带有 1～3个选择碱基+该步的影响
因子均与一般的PCR反应相同，其 中Mg2 的浓度
和Taq酶的质量和浓度是最主要的影响因子，本实
验对最适于蜡梅扩增的Mg“的浓度进行了摸索，发
现 Mg“的浓度为 1．2 nqg／mL时扩增效果较好
2．3 AFLP 1物筛选分析
AFLP技术与 R4PD一样．用的是通用型引物，
但不是所有的引物组合都能很好的扩增并且多态性
高，不同的引物组台对扩增条带有明显的影响。所
以，具体到某一材料 应根据其基因组的具体情况筛
选引物组合。
由于缺乏有关蜡梅的基因组信息的资料以及相
关的蜡梅AFIlP文献报道．所 以选用 了如下引物筛
选策略：“2+2”、“2+3”、“3+2”和“3+3”的引物
组合都选择若干对(见表5)．选择2个样品‘黄卷素
表 5 引物筛选
Table 5 Table 5 Primer p且ir sdecfion
Ed ! 竺
I1 12 13 14 I5 23 24 25 26 36 41 46 47 57 62 63 64 68
注：带‘+’的表示本实验进行筛选的168十引物组合；带‘+·’蚋表示所筛选出的10对扩增较整齐、多志性高的引物组含
№ tes：M er‘+’⋯ s 168 filtered rTIer eomkfinmlon；Marker +·’⋯ 日10 primer comblnatian with orderly amplifieafi~
， h gh polymnr-
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¨ n H 粥 拍 ＆{ 如 他
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第 1期 赵 冰等：蜡梅 AFLP分子标记技术体系的建立
心’和‘黄卷紫心’为试材筛选引物，共筛选引物组
合 168对以确定合适的引物。从 168对 AFLP引物
中筛选出了1O对多态性较高、带型质量较好、分辨
率较 高 的 引物。其 引物 序号 分别 为：M23E46、
M24E46、M25E46、M23E47 M24E47、M41E47、
M41E94、M64E94、M64E66和 M24E75，10对引物的
扩增结果见表 6。由表 6可以看出，选出的 lO对引
物的多态位点比例均在 50％以上。由引物筛选结
果可知，“2+2”的引物组合条带较少，多态性不丰
富。“3+3”和“3+2”的引物组合产生的条带较多，
不利于统计 ；而“2+3”的引物组合产生的条带粗细
适中，多态性强分辨率高，且条带分布均匀。因此本
实验主要选取具有2个选择性核苷酸与3个选择性
核苷酸的引物组合。由引物筛选实验还可以知道，
预扩产物稀释的倍数(本实验设置了0倍、5倍、lO
倍、20倍共4个稀释梯度)对选择性扩增没有大的
影响。
表 6 弓l物序列和扩增结果
Table 6 SeqIlenceB and amplifcation results oftwenty primers
3 讨论
AFLP技术结合了RFLP和 RAPD技术的优点，
它即有 RFLP的高度稳定性，又具有 RAPD的多态
性高的特点，本实验中这两个特点得到了充分验证。
但AFLP操作过程繁琐，所用药品和仪器较多。每一
步反应都密切相关。其中DNA的提取这一步是整
个实验的关键所在。蜡梅叶片含糖成分比起紫薇、
芍药等植物相对较少，这在某种程度上降低了蜡梅
叶片DNA的提取难度。但由于北京现在还没有蜡
梅品种资源圃，因此从外地采样再带回北京的叶片
其 DNA提取的质量则稍差于新鲜叶片提取 出的
DNA。因此采用何种方法提取 DNA从而把这种差别
降到最小，是蜡梅 DNA提取的关键。本实验在提取
DNA的过程中，采用两次抽提来充分去除直接影响
扩增中 Tat／酶活性的氯仿、异戊醇等物质。同时在
去除RNA后。又增加一次抽提过程，以去除残存的
RNA酶蛋白，保证 DNA的高纯度。
多态性和稳定性好的引物是进行全部基因组扩
增的成败关键，尤其是种内的扩增 ，因为种内的个体
除自然变异外，其基因型没有太大的差异，所以没有
多态性强、稳定性好的引物很难区别个体内的差异，
故需要在大量的引物中筛选才能得到理想的结果。
本实验采用了 168对引物作为初选引物。筛选出了
1O对适合蜡梅基因组扩增的引物，同时又摸索出了
适宜蜡梅基因组扩增的最佳酶切、预扩和选扩体系，
所有这些工作都为今后进行蜡梅品种的分子鉴定和
蜡梅野生居群的遗传多样性分析提供了很有益的
资料。
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