全 文 ：武汉植物学研究 2008，26(3)：245～250
Journal of Wuhan Botanical Research
突托蜡梅 ISSR引物反应条件的优化与筛选
李艳 ，江玉梅 ，鲁顺保 ，彭九生 ，朱笃
(1．江西师范大学生命科学学院／江西省亚热带植物资源保护与利用重点实验室，南昌 330022；2．江西省林业科学院，南昌 330032)
摘 要 ：为从突托蜡梅(Chimonanthus grammatus)叶片中提取高质量的总 DNA，比较了 CTAB法、改良的 CTAB法、
SDS法、高盐低 PH值法 、SDS—CTAB法 、SDS一蛋白酶 K法。结果表明：改良的 CTAB是提取突托蜡梅基因组 DNA的
有效方法。以 U811(Ga)8C为引物 ，确立 了适合 突托蜡梅的 ISSR反应体系：在 20 txL反应体系(50 ng DNA、
0．6 moL／L引物、1．5 mmoI／L Mg 、0．15 mmol／L dNTPs、2．0 U Taq DNA聚合酶)中，反应程序为：94~C预变性
5 min．94~C变性1 min 57．2℃退火45 s、72℃延伸2 min，循环40次，最后于72℃延伸5 min。用来自不同居群的7
个个体 ，以100个 ISSR引物进行 PCR扩增 ，筛选出了扩增效果较好的10个引物，得到了74个位点，其中39个为多
态位点，多态性位点比例为 52．7％。
关键词：突托蜡梅；DNA提取 ；ISSR；引物筛选
中图分类号：Q75 文献标识码 ：A 文章编号：1000—470x(2008)03—0245—06
Optimization of Experiment Conditions and Primer Screening with
ISSR M arkers for Chimonanthus grammatus
LI Yan ，JIANG Yu—Mei ，LU Shun—Bao ，PENG Jiu—Sheng ，ZHU Du
(1．College C Li~e Sciences Jiangxi Normal University／Jiangxi Provincal Key Lab of Protection and Utilization of Subtropical
P10nt ResoHrces．Nanchang 330022．China；2．Jiangxi Academy of Forestry，Nanchang 330032，China)
Abstract：The methods of CTAB，modified CTAB，SDS，High salt low pH ，SDS—CTAB and SDS—Proteinase
K were used t0 be c0mpared in order to isolate high—quality genomic DNA from leaves of Chimonanthus
grammatus．The results showed that the modified CTAB was the best one．By applying the single factor
experiment with ptimer U8 11，a suitable ISSR reaction system for the analysis of genetic diversity of
C．grammatus was established，namely 20 L reaction system containing 1 x PCR buffer，50 ng template
DNA，0．6 ixmol／L primer，1．5 mmol／L Mg“
，
0．15 mmol／L dNTPs and 2．0 U Taq DNA polymerase．
The reaction program was devised for 5 minutes of predenaturalizati0n at 94 oc，1 min of denaturalization
at 94℃ ．45 seconds of anneal at 57．2℃ ，2 minutes of extension at 72。C，40 cycles，and 5 minutes of
extension at 72 oC in the final cycle．OHe hundred ISSR primers were used to screen the suitable primers
with 7 samples from different populations for assessing the genetic diversity of C．grammatus．of which
10 ISSR primers with high resolution and muhiple polymorphic bands were screened．The total 74 ISSR
bands were amplified with 10 primers，and produced 39 polymorphie bands．The percentage of polym—
orphic bands was 52．7％ ．
Key words：Chimonanthus grammatus：DNA extraction：ISSR：Primer screening
蜡梅属(Chimonanthus)植物起源古老，花粉形
态独特，为被子植物少见类型 。突托蜡梅为该属
蜡梅组与新蜡梅组的过渡类群，在蜡梅属植物系统
演化中有特殊位置 J。突托蜡梅属江西特有的一
种常绿树种 ，是我国特有的古老植物种类 ，在 20
世纪90年代初才被发现。突托蜡梅叶型优雅、花黄
香浓、果型奇特，含有丰富的药用、芳香油成分，在园
林美化和医药、香料、油脂等轻化工业上有重要用
途 J，是一种具有很高经济和科研价值的珍贵稀有
种质资源。但由于其种子萌芽困难，自然繁衍能力
弱，更受环境影响及过度滥伐所致，目前种群分布范
围十分狭窄，现仅存于江西赣南的安远、会昌和龙南
等地，已到濒临灭绝的境地。利用分子标记技术进
行突托蜡梅的遗传多样性水平和遗传分化程度等研
收稿 日期：2007—10—12，修回日期 ：2007—12—27。
基金项 目：江西省自然基金资助项目(0430014)；江西师范大学青年成长基金资助项 目(1740)。
作者简介：李艳(1983一)，女，硕士研究生，研究方向为植物生态学。
通讯作者(Author for co~espondence．E—mail：zhudu12@163．tom)。
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246 武 汉 植 物 学 研 究 第 26卷
究，对于合理和有效的保护这一濒危种质资源显得
尤为迫切。
ISSR(Inter—simple sequence report)标记方法是
一 种基于微卫星序列发展起来的分子标记技术 。
由于 ISSR技术不仅可以快速、高效和灵敏地检测出
基因组 DNA的多态性，有很好的重复性，而且操作
简单、成本较低，适合大样本的检测，在种群遗传学、
种质资源、分类学与种系发生学等方面得到迅速应
用 -s]。ISSR技术原理虽简单，但其扩增结果易受
Mg 、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶、模板 DNA等
因子的影响 。因此，在将该技术应用于一个新的
植物材料之前，都应先建立一个合适的 ISSR反应体
系，以期获得可靠的结果。本研究以濒危植物突托
蜡梅的 DNA为模板，对其 ISSR反应条件进行了优
化，建立了重复性好、结果清晰稳定的 ISSR反应条
件，在此基础上对 100个 ISSR引物进行筛选，为深
入研究突托蜡梅的遗传多样性奠定了良好的基础。
1 材料和方法
1．1 材料
实验所用突托蜡梅(Chimonanthus grammatus)
材料来自江西省林业科学院、江西省赣州市安远县、
会昌县。共采 到 275个样本，带 回实验室置 于
～ 70℃ 冰箱保存备用。Taq DNA聚合酶、dNTPs购
于上海 Promega公司，分子标准量 (Lambda DNA／
EcoR I+HindⅢ、100 bp DNA Ladder marker)购于
TIANGEN公司，随机引物序列由加拿大哥伦比亚大
学(University of British Columbia，Set No．801—900)
设计，上海生工公司合成。
1．2 DNA的提取与检测
用常规的CTAB法 、SDS法 、高盐低 pH
值法 ]、SDS—CTAB法 ¨]、SDS一蛋白酶 K法 “ 和改
良的 CTAB法 提取突托蜡梅基因组 DNA后，用
紫外分光光度计(PE公司)测定 DNA纯度和含量。
在 1％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)上电泳(50 V电压
60 min)，检测所提取 DNA的质量。
1．3 ISSR扩增及最佳反应体系的建立
1．3．1 ISSR原初扩增条件及 PCR扩增程序 原
初的扩增反应条件为20 PCR反应体积，1 X PCR
Bufer、100 ng DNA、0．75 p~mol／L引物、2．0 mmol／L
Mg“
、0．15 mmol／L dNTPs、2．0 U Taq DNA聚合酶。
初步确定ISSR扩增程序 纠¨为：94c(=预变性 5 min、
94℃变性 1 min、52℃退火45 S、72~C延伸2 min、循
环 45次；最后 72℃延伸 5 min，4℃保存。
1．3．2 退火温度梯度检测 引物的退火温度 极
大地影响着 ISSR反应的进行，随引物的不同，退火
温度亦不一样，因而确定一个合适的退火温度非常
必要。采用梯度 PCR模式，自动设定温度范围为
50．0～59．8~C，生成的温度梯度 为：50．0、50．8、
52．1、53．7、55．6、57．2、58．3、59．2、59．8 。其
余 PCR扩增程序 同 1．3．1，以确定最合适 的退火
温度。
1．3．3 PCR扩增反应体系的优化 ISSR扩增反应
体系的优化按常规采用单因素试验 埔 ，本实验先
根据原初的 PCR反应条件进行引物的初筛，选择能
看到清晰条带的引物，再对该引物进行最佳退火温
度的确定，然后设定参与 PCR反应的 DNA模板浓
度、Mg 、dNTPs、Taq DNA聚合酶等几个关键因子
的变化梯度进行条件优化试验，各参数优化设计梯
度见表 1，除反应程序中的退火温度为 1．3．2所优
化的最佳温度外，其余条件同1．3．1。
表 1 ISSR反应体系优化设计
Table 1 Design for the factors and levels of ISSR reaction
影响因素 试验梯度
The factors Concentration grades
DNA模板 (ng)
DNA template
Mg 浓度 (mmoUL)
Mg concentrations
dNTPs浓度 (mmoUL)
dNTPs concentrations
引物浓度 (pmmUL)
Primer concentrations
Taq DNA聚合酶 (u)
Taq DNA polymerase
12．5、25．0、50．0、100．0
1．5、2．0、2．5、3．0
0．10、0．15、0．20、0．25
0．40、0．50、0．60、0．75
1．0、1．5、2．0
1．3．4 PCR扩增程序循环数的优化 在反应体系
基础上对循环次数进行 3个水平(35次、40次、45
次)单因素试验。
1．3．5 引物筛选 用来自不同居群的7个模板，在
优化好的反应体系中进行扩增筛选。
2 结果与分析
2．1 不同方法提取 DNA质量和产量比较
本实验电泳结果(图 1)表明，6种方法提取的
DNA均能保存较好的完整性，SDS一蛋白酶 K法所提
取的 DNA有一定的拖尾现象，说明用该法在提取
DNA的过程中 DNA有所降解，这可能是因为前 5
种方法是用液氮研磨的，快速低温条件下处理，而
SDS一蛋白酶 K法是在室内用 STES缓冲液研磨成糊
状。后者在空气中暴露的时间较长，DNA难免被降
解。从图1中还可看出改良CTAB法所提取的DNA
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