全 文 ：武汉植物学研究 2006，24(6)：583～586
Youma／of Wuhan Botanical Research
坛紫菜中别藻蓝蛋白的纯化及洗脱组分光谱研究
董宏坡 ，左正宏 ，陈奕欣
(1．茂名学院生物食品系，广东茂名 525000；2．厦门大学生命科学学院，厦门 361005)
摘 要：以福建省平潭县坛紫菜(Porphyra hai．t,anena1．s)为材料，采用硫酸铵分级分离和柱层析法纯化别藻蓝蛋白
(APC)，并对纯化的条件进行了详细的探讨。研究结果表明：采用 30％ ～35％饱和硫酸铵沉淀、Tris·HC1(pH=
8．0)作为洗脱缓冲液、DEAE．Sephadex．A-50作为层析介质，所获得的APC的纯度和回收率分别为3．50和70．2％；
SDS．PAGE表明APC有仪和B两个亚基，分子量分别为 18．9 kD和 17．7 l【D。因此该方法对于从坛紫菜中快速纯
化APC是适合的。采用光谱分析研究柱洗脱组分，结果表明：坛紫菜中含有分子结构为( ) 的“双峰型”R—PE，
含有结构为(仪B)3的 R·PC，含有结构为(仪B)3的APC·I。
关键词：坛紫菜(Porphyra haitanenais)；别藻蓝蛋白；柱层析；光谱
中图分类号：Q949．29 文献标识码 ：A 文章编号：1000—470X(2006)06—0583—04
Allophycocyanin Purification from Porphyra haitanensis and
Studies on Spectrum of Eluting Fractions
DONG Hong—Po ，ZUO Zheng—Hong ，CHEN Yi—Xin
(1．J】If∞ cc ，Maomlng，Guangdong 525000，China；2．&hool of Sc／ences，X／amen 如∞ ，Xiamen 361005，China)
Abstract：Alophyeocyanin from Porphyra haitanensis colected in Pingtan County of Fujian Province was
purifed using aflnloniufl sulfate precipitation and column chromatography．Meanwhile，factors of purifi—
cation were studied in detail．The results showed that using 30％ 一35％ of the saturation ammonium sul—
fate precipitation，Tris—HC1(pH=8．0)as eluting bufering and DEAE—Sephadex—A-50 as chromatogra—
phie adsorbent；the purlt)，and rate of recovery of aUophyeocyanin obtained were 3．50 and 70．2％ ，
respectively．SDS—PAGE demonstrated the presence of two subunits， and B，with Mr 18．9 kD and
l7．7 kD．respectively．Th erefore the method was suitable for quick purification of aUophyeocyan in from
P．haitanensis．At the same time．the fractions colected from column were researched by analysis of
spectrum．Th e findings indicated that P．ha／tanens／s contained the R—phyeoerythrin with two absorption
peaks which had the polypeptide compositon( p)6 ，the R—phyeocyanin which had the polypeptide
compositon( p)3 and aUophyeocyanin—I1 which had the polypeptide compositon( p)3．
Key words：Porphyra haitanensis；Alophyeocyan in；Column chromatography；Spectrum
藻胆蛋白在藻类的叶绿体中凝集成排列规则的
小粒体，即藻胆体 (phyeobilisomes)，连接在 内囊体
的膜上。别藻蓝蛋白(APC)在藻胆体的中心，靠近
光合作用膜，其外包裹着藻蓝蛋白(PC)，最外层为
藻红蛋白(PE)⋯。别藻蓝蛋白作为藻胆蛋 白的一
种，在科学研究、医学、工业中具有广泛的应用前景。
事实证明，别藻蓝蛋白作为荧光探针优于其它的藻
胆蛋白，因为别藻蓝蛋白的最大激发峰和发射峰位
于红光区，而大多数的生物材料在红光区无发射峰，
这样就避免了相互之间的干扰l2 J。同时，别藻蓝蛋
白还可以作为食品中的色素添加剂以及医学中的光
敏剂和抗肿瘤物质 J。目前，国内外多是从蓝藻中
纯化别藻蓝蛋白，由于坛紫菜(Porphyra hahanensis)
的细胞壁厚，别藻蓝蛋白含量少，因此，高效地从坛
紫菜中纯化别藻蓝蛋白并对洗脱组分进行光谱学研
究还未见报道。本文对从坛紫菜中纯化别藻蓝蛋白
的条件、程序进行了详细的探讨，建立了一个快速、
高效地从坛紫菜中纯化别藻蓝蛋白的方法，并对坛
紫菜中藻胆蛋白的光谱学性质进行了初步研究。
1 材料与方法
1．1 实验材料
野生坛紫菜(Porphyra haitanensis)采 自福建省
平潭县南海、将军山、北冰岛、硫酸岛等沿岸。
收稿日期：20064)5—17，修回日期：2006-09—11。
基金项目：国家海洋863项 目(2002A603023)资助。
作者简介：董宏坡(1978一)，男，硕士，主要从事海藻的分子遗传育种研究。
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584 武 汉 植 物 学 研 究 第 24卷
取坛紫菜的叶状体阴干后，一20~C保存备用。
1．2 主要仪器
主要仪器有：Thermospectronic Unicam UV300
紫外分光光度计、Virsonic 475型超声波破碎仪、
Beckman Avanti J-25型冷冻离心机、DYY一1 1 124D小
型双重垂直电泳槽、Bio—Rad Biology LP蛋白质纯化
系统、LABCONCO freezone 18升立式冻干机。
1．3 主要试剂
藻胆蛋白抽提液 E：0．05 mol／L磷酸钠缓冲液
(pH ：6．8)，其 中含 0．2 mol／L NaC1，1 mmol／L
EDTA，1 mmol／L巯基乙醇，0．01％ NaN3。
DEAE—Sephadex—A-50柱 的下 相 洗 脱 液 A：
0．01 mol／L Tfis—HC1缓冲液 pH=8．O(含0．1 mol／L
NaC1，1 mmol／L EDTA，1 mmol／L巯基乙醇，0．01％
NaN3)。
DEAE—Sephadex—A-50柱 的 上 相 洗 脱 液 B：
0．01 moL／L Tris—HC1缓冲液 pH=8．0(含0．8 mol／L
NaC1，1 mmol／L EDTA，1 mmol／L巯基乙醇，0．01％
NaN3)。
1．4 实验方法
(1)藻胆蛋白的粗提 取阴干坛紫菜 6．25 g
用蒸馏水洗涤3次，吹干，在液氮下将其磨成粉末，
悬浮于抽提液 E中，4~C过夜，次 日用超声波发生器
超声破碎细胞 15 min(每 3 min间歇 1 min)用 300
目筛网过滤，滤液离心(17 000 g，4~C，30 min)除去
细胞碎屑，获上清液，将溶液体积定容到 250 mL，得
藻胆蛋白粗提液 S1。
(2)藻胆蛋白的硫酸铵分级纯化 向粗提的坛
紫菜藻胆蛋白 S1中加人 25％饱和度的硫酸铵。得
沉淀 C1和上清液 s2；向S2中加人硫酸铵达40％饱
和度，得沉淀 C2和上清液 S3；向 S3中加人硫酸铵
达 6o％饱和度，得沉淀 C3和上清液 s4。用抽提液
E溶解c2，加人硫酸铵达30％饱和度，得沉淀C4和
上清液 s5；向 s5中加入硫酸铵达35％饱和度，得沉
淀 C5和上清液 S6；向S6中加人硫酸铵达40％饱和
度，得沉淀 C6和上清液 s7；向 s7中加人硫酸铵达
60％饱和度，得沉淀 C7和上清液 S8。每一步的上
清液均调 pH至6．8。
(3)DEAE-Sephadex-A-50柱层析 装柱体积
为2．5×22 cm，柱子装好后，要用洗脱液 A平衡
2～3个柱体积。样品为沉淀 C5，先用洗脱液 A透
析过夜，上柱前 17 000 g 4℃离心30 min。用洗脱液
A和洗脱液 B(pH=8．0)进行梯度洗脱，流速为
30 mI／h，先用洗脱液 A洗脱 1个柱体积，以后每过
一 个柱体积 NaC1浓度增加0．07 moL／L，分别收集不
同的洗脱峰。
(4)SDS-PAGE样品加入 1×SDS上样缓冲
液 100~C加热5 min，短暂离心后即可加样，分离胶
12％，浓缩胶5％。室温下电泳。电泳结束后，将凝
胶放人染色液染色至少 4 h以上。然后取出，用脱
色液脱色，直至底色变白。
(5)藻胆蛋白的光谱分析 在 Thermospectronic
Unicam UV300分光光度计上进行吸收光谱扫描，所
有样品的吸收光谱都是在室温下 s—HC1(pH=
8．O)缓冲液中进行测量的。
2 结果与分析
2．1 藻胆蛋白初始纯化组分的组成和纯度
藻红蛋白、藻蓝蛋 白、别藻蓝蛋白的纯度常用
A ／A2舳，A ，／A：∞，A鲫／A：8D的吸收比值来作为指
标，比值愈大，表示该蛋白质纯度愈高 J。我们采
用硫酸铵对藻胆蛋白粗提液 S1进行分级分离实验，
并测定了每一步的 PE、PC、APC的纯度(见表 1)。
从表中可看到以5％饱和度为间隔来分级 ，对于
表 1 硫酸铵分级纯化过程中各步藻胆聋白的纯度
Table 1 Purity of phycobiliproteins in purifcation process using solid(NH4)2 SO4
Notes：PE- phycoerythrin；PC- phyeoey~ n；APC- alophycocyanin．
35％ ～4O％之间的 C5来说，此组分 APC纯度在几 2．2 DEAE-Sephadex-A-50柱层析
个组分中是最高的，溶液颜色为深蓝色。可见在 C5 2．2．1 洗脱液pH值和离子强度的选择
中，虽然没有将 3种藻胆蛋白分开，但 APC的组成 采用 pH为7．0、8．0,9．0的 s—HC1缓冲液分
比例大大提高了。 别过柱，研究发现在缓冲液 pH为8．0时，柱子上呈
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第 6期 董宏坡等：坛紫菜中别藻蓝蛋白的纯化及洗脱组分光谱研究
现出清晰的红、蓝、淡蓝带，此时获得的APC纯度最
高，达3．50。
对于离子强度，一般缓冲液中盐浓度范围在
0～L mol／L 】 我们先选择了这个范围进行预试
验．结果显示藻红蛋白在0．3l mol／L NaCI浓度下开
始被洗脱下来；藻蓝蛋白在0．45 moVL NaCI处被洗
脱；别藻蓝蛋白在0．52 moVL处被洗脱。可见采用
0．1～0，8 mol／L的梯度洗脱是合适的。
2．2．2 上样量对 APC回收率的影响
在装柱体积为2．5×22 cm和流速为 0．5 mL／
rnin的条件下，进行了上样量对 APc的回收率影响
研究，结果表 明在 上样量 从 1O．6o mB增加到
33．52 mg这一过程中，APc的回收率基本保持恒
定，约在70％左右。当大于33．52 nag时，APC的回
收率下降(见圈 1)。这表明在2．5×22 cm柱体积
时+当上样量为33．52 mg．树脂达到饱和，超过这个
值，别藻蓝蛋白将随未吸附的样品一起流失，从而导
致回收率下降。
上样量 (ms)
2ae l loB曲
圈1 上样量对APc回收卓的影响(样品为c5
Fig．1 Efect ofloading 0n APC recovery
2．2．3 样品c5的 DEAE-S~plmdex·A-50柱分离
对于样品 C5的柱分离，UV检测到5个闯隔很
明显的峰．柱上有清晰的红、蓝、淡蓝3条带。我们
收集了这 5个峰，分别为 cFI，CF2．cn，cF4，c巧
(见圈2)，我们对每一个组分进行了鉴定
组分CF1、CF2和cF3颜色为粉红色。从 图3
图 2 DEAE柱分离样品c5的洗脱曲线
Fig,2 Elu6on cu弭e of the{ 自nion3 collected
from DEAE eofumn using sample C5
可知，CFI、CF2和 CF3的吸收光谱在 498 rtm和
565 nm有吸收峰，在 545 r一有吸收肩峰，与报道的
R．PE的吸收光谱相同 。CF1的吸收光谱已发生
明显改变，其 565 nm的吸收峰向短波长偏移了4～
5／lm，且A ／A ，i Ⅲ明显减少，可见 CF1中藻
红蛋白六聚体已经解聚。
Wavelength⋯
圉3 DEAE柱洗脱组分(RPE1的吸收光谱
Fig,3 ．absorption spectrum of fractions
from DEAE colunm
根据报道．R·PE由“ 8、 3个亚基组成，C／．和
B分子量在 20 kD左右， 在 30 kD左右 ，但组分
CFI的SDS—PAGE电泳只见一条清晰的带，在55 kD
处(见图4的泳道 2)。我1订推测55 kD的带可能由
a或 13、 和连接肽组成，因为有报道认为 亚基在藻
红蛋白中是与 或 B结台的，这种结台很牢固．能起
到稳定( B) 六聚体的作用 j。CF2和 CF3除具
有 55 kD这条带，它们在20 kD有一条很粗的带．推
测为PE的(It和B亚基(觅图4的3和4泳道)
■■ ．．
- - ■ 一 ”
舅 ● 。
⋯
图 4 DEAE柱 洗脱 组分 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
Fig,4 SDS—PAGE characterization 0f the fractions
colected from DEAE column
对于组 分 CF4，其 颜色深蓝色，吸收光谱在
555 ilm和6l5 nl3fl处有最大吸收峰．具有典型的RPC
特征 (见图5)。从吸收光谱和电泳图4上看，它
的APC已完全去除(光谱中无 650 n2rl吸收和电泳
中无 APC的亚基带)。
组分 CF5为淡蓝色，其 ^。／^ =3．5>3．
^／A 口=1．48>1．4。它的吸收光谱在650nm有
最大吸收峰，在620 rm 有肩峰，具有典型的 APC三
聚体的吸收光谱特征 (见图6)。SDS。聚丙烯酰胺
黝 加∞ 柏柏 #i 0 西羹 雒
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D
O 25
0．20
七0．15
0
舅 0．10
《 O∞
0 oo
∞ 0300 350 400 450 500 550 60O 66O 700
Wavelength(nrn)
图 5 DEAE柱洗脱组分 CF4的吸收光谱【RPC)
Fig．5 Absorption spectrum from CF4 of DEAE column
凝胶电泳只有两条带，分别对应 APC的 ot和 B亚基
(图4的6和7泳道)。这些结果表明纯化的 APC已
经达到电泳纯。通过和标准蛋白分子量的比较，我们
计算了ot和B亚基的分子量为 18．9 kD和17．7 kD。
0 45
0柏
0 35
8 0 30
~
8。
0．
2
2
。
5
墨 o15
《 0lO
o 05
o 00
图6 DEAE柱洗脱组分 CF5的吸收光谱【APC)
Fig．6 Ab sorption spectrum from CF5 of DEAE column
3 讨论
红藻坛紫菜中别藻蓝蛋 白的含量非常低，只有
0．5—0．8 g／100 g 。至今在国外只有从蓝藻中分
离别藻蓝蛋白的报道，且分离的工序复杂，时间长。
如 Ruperto等 报道通过 Sephadex G．100和 DEAE—
ceUulose DE-52两支柱子从螺旋藻(Spirulina platen-
sU)中分离出纯的 APC，纯度达到 3．5。国内多数也
是从蓝藻中分离出纯的 APC。如胡一兵等[1训先用
硫酸铵分级分离，然后过羟基磷灰石从螺旋藻中得
到APC的纯度为3．7，但他没有给出得率和明确的
纯度鉴定。我们采用 30％ 一35％饱和硫酸铵沉淀、
DEAE—Sephadex—A-50作为层析介质，所获得的 APC
的纯度和回收率分别达到3．50％和 70．2％。
根据吸收光谱的不同，藻红蛋白可分为 R．藻红
蛋白、B一藻红蛋白、C一藻红蛋白(蓝藻中)，以后又发
现了藻红蛋 白566(隐藻中)¨ 。¨由藻红蛋 白的吸
收光谱知，我们从红藻坛紫菜中分离出的为“双峰
型”R一藻红蛋白，其特征是在 498 n／n和 565 nm处
有吸收峰，在 545 Bil处有吸收肩峰。
藻蓝蛋白可分为 C一藻蓝蛋 白和 R一藻蓝蛋 白。
张建平等 从多管藻中分离出 R．藻蓝蛋白三聚体
在可见光范围有两个明显的吸收峰，分别为 555 nm
和615 nm。由吸收光谱可看出，坛紫菜中藻蓝蛋白
为 R—PC型，且在 pH=8．0时是以三聚体( p)，的
形式存在的。
现已知别藻蓝蛋白有 APC一1I、APC—I、APC—B、
APC．LCM 4种形式，主要区别在于其多聚体是有2
个或2个以上分子量不同的带色亚基组成及其是否
带无色多肽 ¨。我们从坛紫菜中分离的APC其结
构为( B)，，不带无色多肽，且凝胶电泳只有 ot和 p
两个亚基；最大吸收峰在 650 n／n，吸收光谱中A伽／
A62o=1．48，这与文献[8]报道的相同，证明应为念
珠藻(Noctoc sp．)的APC—lI。
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