全 文 ：武汉植物学研究 2001, 19 (4) : 317～ 322
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
悬浮培养玫瑰茄细胞的生长
行为及动力学方程的建立α
侯学文1　郑穗平2　郭　勇2
(1. 华南农业大学资源环境学院, 广州　510642; 2. 华南理工大学生物工程系, 广州　510641)
摘　要: 以培养多年的玫瑰茄 (H ibiscus sabd arif f a L. ) 白色细胞株为材料, 在以 3% 蔗糖为
碳源, 植物生长调节剂为 415 Λmo löL 2, 42D (2, 42二氯苯氧乙酸) , 213 Λmo löL K t (K inetin,
细胞激动素)的悬浮培养条件下, 研究了玫瑰茄细胞的生长及泛醌积累动态、培养液 pH 值的
变化以及培养过程中玫瑰茄细胞对碳源、氮源、磷源的消耗动态, 并以此数据建立了悬浮培养
玫瑰茄细胞的生长、蔗糖消耗、泛醌形成的非结构动力学模型。经验证表明, 模型与实际情况
有较高的拟合度。
关键词: 悬浮培养; 玫瑰茄细胞; 动力学模型
　　中图分类号: Q 943. 1　文献标识码: A 　文章编号: 10002470X (2001) 0420317206
The Cultur ing Process and K inetic M odel Con struction of
H ibiscus sabda r if f a Suspen sion Culture
HOU Xue2W en1, ZH EN G Su i2P ing2, GUO Yong2
(1. Colleg e of N a tu ra l R esou rces and E nv ironm en t, S ou th Ch ina A g ricu ltu ra l U n iversity ,
Guangzhou　510642, Ch ina; 2. B ioeng ineering D ep artm en t, S ou th Ch ina U n iversity
of T echnology , Guangzhou　510641, Ch ina)
Abstract: A tam ed Ro selle (H ibiscus sabd a rif f a L. ) ca llu s st ra in w as cu ltu red
in Gam bo rg B 5 liqu id m edium adding 3% sucro se, 415 Λmo löL 2, 42D and
213 Λmo löL K inet in (K t). T he grow th and ub iqu inone accum u lat ion of Ro selle
cell, the change of pH , nu trien t assim ila t ion in the m edium w ere studied. A
non2st ructu red k inet ic model w as con structed by u sing these data. V erif ica t ion
show ed that the p redict ion of cell grow th, to ta l sugar assump tion and
ub iqu inone accum u lat ion by these model had a very h igh co incidence w ith the
experim en ta l resu lts.
Key words: Su spen sion cu ltu re; Ro selle (H ibiscus sabd a rif f a) cell; N on2st ruc2
tu red k inet ic modelα 收稿日期: 2000211223, 修回日期: 2001205227。作者简介: 侯学文 (1969- ) , 男, 博士, 副教授, 从事植物细胞培养产生次生代谢产物的研究。
玫瑰茄 (H ibiscus sabd a rif f a L. ) 又名山茄 (Ro selle) , 是锦葵科木槿属一年生草本植
物。华南理工大学生物工程研究室多年前从玫瑰茄花萼中诱导出了两个细胞系: 一株呈红
色, 其主要次生代谢产物为花青素[1 ]; 另一株呈白色, 不产花青素, 但悬浮培养时细胞分散
度极高, 生长周期相对较短, 因而是研究细胞在悬浮培养条件下的生长行为的理想材
料[2, 3 ] , 植物细胞培养过程动力学研究的主要问题是生物反应的速率、各种基质组分消耗、
代谢产物的生成速率。细胞的生长是一个复杂的生物化学过程, 既包括各种细胞内的反
应、胞内与胞外的物质交换, 也包含有胞外的物质传递及生化反应, 因此这是一个多相、多
组分和非线形的体系。对于这样一个复杂体系进行精确的描述几乎是不可能, 必须作出适
当简化, 这样不仅建模相对容易, 而且已基本上能满足工程上优化控制的需求[4 ]。本研究
以白色玫瑰茄细胞株作为材料, 通过对其生长行为的研究, 建立起悬浮培养玫瑰茄细胞培
养过程的非结构动力学方程, 为其它植物细胞的大规模培养提供一定的参考价值。
1　材料与方法
1. 1　供试材料与培养条件
选用华南理工大学生物工程研究室驯化培养多年的玫瑰茄白色细胞株为实验材料。
先将固体培养基上的愈伤组织转入 1 000 mL 的三角瓶 (含 400 mL B 5 培养基) 制作种子
瓶, 再将其在液体培养基中继代 1～ 2 次, 以使细胞分散更佳, 保证供试材料的均匀一致。
试验全部采用 100 mL 的三角瓶, 装液量为 50 mL , 培养液灭菌前将 pH 值调至 518, 分装
后于 121℃灭菌 15 m in, 每瓶接种量为 115 g 鲜细胞。植物生长调节剂为 415 Λmo löL
2, 42D 与 213 Λmo löL K t, 蔗糖浓度为 3% , 摇床转速为 130 röm in, 培养周期为 14 d, 每
2 d 取样测定一次。每个实验均重复 3 次, 试验结果为 3 次试验的平均值, 以下试验的处
理与此相同。
1. 2　实验方法
培养液 pH 值的测定采用雷磁 pH S225 酸度计, 使用前经标准试剂校准; 生物量的测
定是取样后用布氏漏斗抽滤, 在 19 精度的光电分析天平上称重, 此定为鲜重; 取适量鲜
样于 60℃烘箱中烘 2 d 至恒重, 再折算成每瓶干重; 培养液中NO -3 的测定按照Cataldo
等的方法[5 ]进行; 培养液中N H +4 的测定按照U rsu la H 等的方法[6 ]进行; 培养液中残糖
的测定采用硫酸2蒽酮法[7 ]; 培养液中 PO 3-4 的测定采用抗坏血酸还原法[8 ]; 玫瑰茄细胞
中泛醌含量的测定按照C rane F L 等的方法[9 ]进行。
2　实验结果
2. 1　悬浮培养玫瑰茄细胞在实验条件下的生长曲线
在设定实验条件下, 悬浮培养玫瑰茄细胞以鲜重计与以干重计生长曲线的走势大致
相似, 都呈 S 形, 可以划分为迟滞期、对数生长期、减慢期、静止期和衰亡期。这与大蒜细
胞[10 ]、黄花蒿细胞[11 ]的生长走势曲线是相同的 (见图 1)。
2. 2　悬浮培养玫瑰茄细胞, 培养过程中培养液 pH 值的变化
培养基在灭菌前用稀碱液调至pH 518 , 经 15 m in 高压灭菌后 pH 值降至 512 左右,
当培养基中接入新鲜细胞后, 在迟滞期内由于生理酸性盐 (N H 4) 2SO 4 的迅速吸收, 导致
pH 值降至 417 左右; 此后随着生理碱性盐 KNO 3 的利用, pH 值逐渐上升, NO -3 耗尽时,
813 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　第 19 卷　　
最高 pH 值达到 518 左右, 此后培养细胞本身的微调功能发挥出来, 使培养液pH 值逐渐
下降并维持在 515 左右 (见图 2)。
T im e (d)
图 1　悬浮培养玫瑰茄细胞的生长曲线
F ig11　Grow th curve in Ro selle suspension
cu ltu re
　
　
　
T im e (d)
图 2　悬浮培养玫瑰茄细胞培养液 pH 值的动态变化
F ig12　T im e course of pH value in Ro selle
suspension cu ltu re
　
　2. 3　玫瑰茄细胞对培养液中残糖的消耗规律
在B 5 培养基中添加 3% 蔗糖作为惟一碳源, 由图 3 可以看出, 经高压灭菌, 有少部分
蔗糖发生了水解。此后培养基中的蔗糖是通过植物细胞壁上的转化酶, 在微酸性环境中被
迅速水解为等分子的葡萄糖和果糖, 然后再被植物细胞以不同的速度吸收利用; 葡萄糖的
吸收利用速度快于果糖, 在培养末期, 糖类基本被消耗完毕。
2. 4　玫瑰茄细胞对培养液中氮源的消耗
B 5 培养基中的氮源主要为硝态氮 (NO -3 , 25 mmo löL ) , 铵态氮仅占少部分 (N H +4 ,
2 mmo löL )。从利用难易上来说, 植物细胞一般优先利用N H +4 , 随后再利用NO -3 。本实验
的结果也清楚地表明了这一点 (见图 4)。
图 3　3% 蔗糖浓度下, 玫瑰茄细胞培养基中残糖的变化
F ig13　T im e course of sugar in the m edium of
suspension Ro selle cu ltu re under 3% sucro se
图 4　悬浮培养玫瑰茄细胞对NO -3 与 NH+4 的利用
F ig14　T im e course of NO -3 and N H +4 in
the m edium of suspension Ro selle cell
2. 5　玫瑰茄细胞对培养液中磷酸根的消耗规律
A sh ihara 等[12 ]研究了磷酸盐限制和非限制下, 长春花细胞的初级代谢, 发现磷酸盐
被快速吸收, 参与合成核苷酸、DNA、RNA、磷酸化糖及蛋白质, 24 h 后A T P、62磷酸葡萄
糖和 62磷酸果糖出现峰值, 而DNA、RNA、蛋白质在 72 h 出现合成高峰, 随后细胞快速
增殖。从图 5 可以看出, 玫瑰茄细胞对磷酸根的吸收是非常快速的, 利用方式也与长春花
细胞相类似。
913　第 4 期　　　　　　　　　侯学文等: 悬浮培养玫瑰茄细胞的生长行为及动力学方程的建立
2. 6　玫瑰茄细胞中泛醌含量的测定
泛醌是电子传递链上的重要成员之一, 它具有抗氧化、维持膜的流动性及线粒体上的
电子传递等多种生理功能; 笔者研究了悬浮培养过程中玫瑰茄细胞泛醌积累的规律 (图
6) , 结果表明, 泛醌的积累是与生物量密切相关的。
T im e (d)
图 5　悬浮培养玫瑰茄细胞对 PO 3-4 的消耗规律
F ig15　T im e course of PO 3-4 in the m edium
of suspension Ro selle cell
　
　
　
T im e (d)
图 6　悬浮培养玫瑰茄细胞的泛醌与生物量积累规律
F ig16　T im e course of UQ and b iom ass of
suspension Ro selle cell
　
　
　
　3　悬浮培养玫瑰茄细胞动力学模型的建立与验证
在引言中已经谈到, 非结构动力学模型不仅表述简单, 而且已能满足工程上的需要,
因此我们采用这种模型对悬浮培养玫瑰茄细胞的生长、碳源的消耗和产物合成进行了描
述。描述方程如下:
细胞生长: 　Λ= Λm 11+ K söCs+ CsöK I ,
底物消耗: 　qs= Λ 1YXöS + m + 1YPöS qp ,
产物合成: 　qp = ΑΛ+ Β。
上式中, Λ为比生长速率, Λm为最大比生长速率, KS 为底物饱和常数, K I 为底物抑制常
数, C s为底物浓度, qs为底物的比消耗速率, YXöS为底物消耗对细胞的得率系数,m 为细胞的
维持系数, YPöS为产物对底物消耗的得率系数, qp为产物的比生产速率, Α、Β为比例系数。
在上述培养条件下, 悬浮培养玫瑰茄细胞的生长、总糖消耗和产物泛醌形成过程的数
据列于表 1, 利用这些数据对上述动力学方程进行最优化求解, 得到方程参数如表 2。为了
验证所得模型的可信度与准确度, 将表 2 中所得模型参数分别代入动力学方程求取培养
过程的数值解, 以此数值解与实际实验结果作图对比。
表 1　在标准培养条件下, 玫瑰茄细胞生长、总糖消耗及产物生成数据
T able 1　T he grow th, sugar usage and UQ p roduction of Ro selle cell under standard condit ion
培养时间Cultu ring tim e (d) 0 2 4 6 8 10 12 14
生物量B iom ass (göL DW ) 1. 6 1. 63 2. 32 3. 16 5. 05 13. 9 17. 4 17. 6
总糖 To tal sugar (göL ) 33. 24 33. 00 27. 54 23. 21 17. 47 13. 52 3. 70 0. 66
泛醌UQ (m göL ) 0. 094 0. 208 0. 347 0. 790 1. 300 1. 550 1. 866 2. 048
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表 2　模型各参数值
T able 2　T he constan ts of k inetic model
动力学参数
Kinetic coefficien t
数值及单位
Amount & unit
动力学参数
Kinetic coefficien t
数值及单位
Amount & unitΛm 0. 415d- 1 YXöS 0. 556
KS 15. 5göL YPöS 0. 602
K I 65. 6göL Α 0. 009
m 0. 008 Β 0. 0185
　　从图 7 可以看出, 模型预测值与实验结果有较高的拟合度, 说明模型具有一定的合理
性、可信度; 但同时应注意到, 模型与实验结果存在一定的偏差, 这主要是在建模的过程中
作出了将细胞看成内部结构单一的均匀质点等简化假设的缘故。
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