全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(1): 86−92 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2009ZX08005-024B), 国家自然科学基金项目(30970222)和山东省现代农业产业
技术体系建设专项资金资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 亓宝秀, E-mail: qbx126@sdau.edu.cn, Tel: 0538-8246205; 李新征, E-mail: lxz@sdau.edu.cn, Tel:
0538-8246205
第一作者联系方式: E-mail: liujiang2582006@126.com ∗∗同等贡献(Contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2013-05-18; Accepted(接受日期): 2013-09-16; Published online(网络出版日期): 2013-10-23.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20131023.1303.002.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.00086
超长链多不饱和脂肪酸在棉花中的异源合成
刘 江 1,∗∗ 马燕斌 2,∗∗ 孙全喜 1,3 吴 霞 2 李雪滢 1 孙美红 1
李燕娥 2 李新征 1,* 亓宝秀 1,*
1作物生物学国家重点实验室 / 山东农业大学生命科学学院, 山东泰安 271018; 2山西省农业科学院棉花研究所, 山西运城 044000;
3山东省花生研究所, 山东青岛 266100
摘 要: 从球等鞭金藻、眼虫、高山被孢霉和拟南芥中分别克隆到 Δ9链延长酶、Δ8去饱和酶、Δ5去饱和酶和 Δ15
去饱和酶基因, 利用我们的多基因聚合方法, 将这 4个基因聚合到植物表达载体 pCambia2300上, 其中每个基因都含
有独立的 CaMV35S启动子和 Tnos终止子。利用农杆菌介导法将该表达载体转入棉花, 通过卡纳霉素和 PCR筛选获
得转基因阳性植株, 提取转基因阳性植株叶片总脂肪酸, 用气相色谱分析法检测到花生四烯酸(AA, 20:4Δ5,8,11,14)和
二十碳五烯酸(EPA, 20:5Δ5,8,11,14,17)含量分别达 1.0%和 5.0%。表明通过基因代谢工程在棉花中异源合成 EPA 是可行
的, 为进一步在棉籽中生产 VLCPUFAs奠定了基础。
关键词: 去饱和酶; 链延长酶; 转基因; EPA; 棉花
Production of Very Long Chain Polyunsaturated Fatty Acids in Cotton
LIU Jiang1,∗∗, MA Yan-Bin2,∗∗, SUN Quan-Xi1,3, WU Xia2, LI Xue-Ying1, SUN Mei-Hong1, LI Yan-E2, LI
Xin-Zheng1,∗, and QI Bao-Xiu1,∗
1 State Key Laboratory of Crop Biology, College of Life Sciences, Shandong Agricultural University, Tai’an 27101, China; 2 Cotton Research Institute,
Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Yuncheng 044000, China; 3 Shandong Peanut Research Institute, Qingdao 266100, China
Abstract: We have isolated four genes encoding a Δ9 elongase, a Δ8 desaturase, a Δ5 desaturase, and a Δ15 desaturase from
Isochrysis galbana, Euglena gracilis, Mortierella alpina, and Arabidopsis thaliana respectively. Using a multigene transfer tech-
nology that we developed, these genes were stacked together in the plant expression vector pCambia2300. Each gene contained its
own CaMV35S promoter and Tnos terminator. This plant expression vector was then transferred into cotton by Agrobacte-
rium-mediated transformation method. Transgenic cotton seedlings were first identified by screening them based on kanamy-
cin-containing media and followed by PCR with gene-specific primers of the four transgenes. Finally, these transgenic plants were
subjected to gas liquid chromatography analysis for their fatty acid composition and the results showed that the contents of ara-
chidonic acid (ARA, 20:4Δ5,8,11,14) and eicosapentaenoic acid (EPA, 20:5Δ5,8,11,14,17) were 1.0% and 5.0% respectively in the leaves
of the transgenic plants, indicating that the four genes were expressed in cotton. Therefore, our data clearly demonstrated the fea-
sibility for the heterologous production of EPA in cotton and this will lay a foundation for the production of VLCPUFAs, includ-
ing EPA and DHA in cotton seed through transgenic technology in the future.
Keywords: Desaturase; Elongase; Transgenes; Eicosapentaenoic acid; Cotton
超长链多不饱和脂肪酸 (very long chain poly
unsaturated fatty acids, VLCPUFAs)是指含有4~6个
双键且碳链长度大于等于20个碳原子的直链脂肪
酸 [1]。VLCPUFAs根据双键的位置通常分为 ω3脂肪
酸和 ω6脂肪酸。深海鱼油是公认的保健品, 其有效
成分为 EPA (20:5, eicosapentaenoic acid)和 DHA
(22:6, docosahexaenoic acid)等 ω3脂肪酸。EPA是哺
乳动物细胞膜的组分, 也是前列腺素、白三烯和血
第 1期 刘 江等: 超长链多不饱和脂肪酸在棉花中的异源合成 87


栓素等激素的前体, 对调节血压、炎症反应以及信
号转导有重要作用, 从而有效防止多种心血管疾病
和炎症的发生[2-3]。DHA对胎儿神经系统的形成至关
重要[4], 但人体内合成 EPA/DHA 的效率比较低, 因
此在日常饮食中补充足够的 EPA/DHA 对维持身体
健康极为重要。
VLCPUFAs的合成主要包括两条途径(图 1), 第
一条为经典的 Δ6 途径, 亚油酸(LA, 18:2Δ9,12)和 α-
亚麻酸(ALA, 18:3Δ9,12,15)在 Δ6去饱和酶作用下生成
γ-亚麻酸 (GLA, 18:3Δ6,9,12)和十八碳四烯酸 (SDA,
18:4Δ6,9,12,15), 然后经过 Δ6 链延长生成二高-γ-亚麻
酸 (DGLA, 20:3Δ8,11,14) 和 二 十 碳 四 烯 酸 (ETA,
20:4Δ8,11,14,17), 而后再经过 Δ5 去饱和生成 AA 和
EPA。EPA又可经 Δ5链延长和 Δ4去饱和生成 DHA,
并且 ω6脂肪酸可在 Δ15和 Δ17去饱和酶作用下生成
ω3脂肪酸。在某些微藻如球等鞭金藻中, VLCPUFAs
的合成还存在另一条“替代途径”, LA和ALA先经 Δ9
链延长生成二十碳二烯酸(EDA, 20:2Δ11,14)和二十碳
三烯酸(ETrA, 20:3Δ11,14,17), 然后经Δ8去饱和以及 Δ5
去饱和生成花生四烯酸(AA, 20:4Δ5, 8,11,14)和二十碳五
烯酸(EPA, 20:4Δ5,8,11,14,17) [1,5]。
高等植物由于缺乏 VLCPUFAs合成途径中的去
饱和酶以及链延长酶, 一般只能合成亚油酸和亚麻

图 1 超长链多不饱和脂肪酸合成途径
Fig. 1 VLCPUFA biosynthetic pathways
依据 Qi等[5]和 Abbadi等[1]。
According to Qi et al. [5] and Abbadi et al. [1].
酸 , 不能合成 VLCPUFAs, 通过转基因技术将
VLCPUFAs 合成相关酶转入高等植物 , 来生成
VLCPUFAs已成为研究热点[5-9]。2004年, Qi等[5]将
球等鞭金藻中的 Δ9链延长酶、眼虫的 Δ8去饱和酶
以及高山被孢霉的 Δ5去饱和酶转入拟南芥中, 在转
基因拟南芥叶片中生成 3.0%的 EPA, 首次证明了高
等植物通过基因代谢工程合成VLCPUFAs是可行的。
棉花是重要的纤维作物, 其副产品棉籽是食用
植物油脂的重要来源之一。精炼的棉籽油是一种优
质的食用植物油, 含有大量人体必需的脂肪酸, 如
亚油酸和亚麻酸, 其中亚油酸的含量可达 50%[10]。
与菜籽油和大豆油相比, 棉籽油虽然产量高, 但价
值相对较低 , 在不影响纤维产量和质量的条件下 ,
可以通过改良棉籽中的脂肪酸成分来提高其营养和
经济价值。本研究旨在探索棉花中合成 EPA 的可能
性, 为此构建了含有Δ9链延长酶[11]、Δ8去饱和酶[12]、
Δ5去饱和酶[13]和Δ15去饱和酶[14] 4个基因的植物表
达载体, 以农杆菌介导法转化棉花, 通过气相色谱
检测转基因棉花叶片中的脂肪酸成分, 研究在棉花
中异源合成 EPA 的可行性, 为进一步在棉籽中生产
VLCPUFAs奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料及试剂
大肠杆菌 XL10 (Stratagene)、植物表达载体
pCambia2300、辅助载体 pAUX2为实验室保存; Taq
酶、限制性内切酶、T4DNA连接酶和琼脂糖凝胶回
收试剂盒等均购自 TAKARA公司; 脂肪酸底物等购
自 Nuchek公司; PCR引物由上海生工生物工程技术
服务有限公司合成。
1.2 引物设计
根据 NCBI 上已经提交的 Δ9 链延长酶基因
(AF390174)、Δ8去饱和酶基因(AF139720)、Δ5去饱
和酶基因 (AF054824)、Δ15 去饱和酶基因 (AT3G
11170)设计 D9L (Xho I)-D9R (Xho I)、D8L (Xho
I)-D8R (Xho I)、MortD5L (Xho I)-MortD5R (Xho I)和
AtD15L-AtD15R (Xho I) 4对引物(两端分别引入适
宜的酶切位点)(表 1), 分别扩增 4个基因。
1.3 多基因表达载体的构建
我们分别克隆了 4个基因(Δ9链延长酶基因、Δ8
去饱和酶基因、Δ5去饱和酶基因、Δ15去饱和酶基
因)的 cDNA片段, 并亚克隆到辅助载体 pAUX2中。
首先以 D9L (Xho I)、D9R (Xho I)为引物, 以含有球
等鞭金藻 Δ9 链延长酶基因的质粒 pCR2.1-Δ9Elo 为
88 作 物 学 报 第 40卷


表 1 基因扩增与检测引物
Table 1 Primer for genes amplification detection
基因
Gene
引物序列
Primer sequence (5′–3′)
引入酶切位点
Enzyme cutting site
D9L: CTCGAGATGGCCCTCGCAAACGAC Xho I
D9R: CTCGAGTAAGGACATCCACAATCC Xho I
99JC-L: GGCTGGTGGATGAGAAGAA
Δ9
99JC-R: TTCCCTTTGTCCGAGTTGA
D8L: CTCGAGATGAAGTCAAAGCGCCAAG Xho I
D8R: CTCGAGTTATAGAGCCTTCCCCGCGG Xho I
8JC-L: GATGCCACTGATGCCTTC
Δ8
8JC-R: ATAGCGCAGCAGGATGACC
MortD5L: CTCGAGCAAGATGGGAACGGACCAAGG Xho I
MortD5R: CTCGAGCTACTCTTCCTTGGGACGGAG Xho I
MortD5JC-L: CAAGATGGGAACGGACCAAGG
Δ5
MortD5JC-R: CTACTCTTCCTTGGGACGGAG
AtD15L: ATGGCGAACTTGGTCTTATCAG Δ15
AtD15R: CTCGAGGCCTGCTTCATTTCAATCTGCTC Xho I

模板, PCR扩增出约0.8 kb的条带, 获得Δ9链延长酶
基因; 以 D8L (Xho I)、D8R (Xho I)为引物, 以含有
眼 虫 (Euglena gracilis) Δ8 去 饱 和 酶 基 因 的
pESC-TrpΔ8质粒为模板, PCR 扩增出大约1.3 kb 的
条带, 获得 Δ8去饱和酶基因; 以转基因拟南芥的基
因组DNA为模板, 用高山被孢霉(Mortierella alpine)
Δ5去饱和酶的引物 MortD5L (Xho I)和 MortD5R
(Xho I)进行 PCR扩增, 得到大约1.4 kb的条带, 获得
Δ5去饱和酶基因; 以反转录的野生型拟南芥第一链
cDNA 为模板 , 用拟南芥 Δ15去饱和酶基因引物
AtD15L和 AtD15R (Xho I)进行 PCR扩增, 得到大约
1.4 kb的条带, 获得 Δ15去饱和酶基因。利用多基因
载体构建的方法[15], 将5个基因表达盒串联起来; 用
Xba I将4个基因表达盒从 pAUX2-4EC上切下, 酶切
产物进行琼脂糖凝胶电泳纯化回收, 用 T4 DNA 连
接酶将线性化载体 pCambia2300与4个基因表达盒片
段按摩尔比1∶3~1∶9连接, 得到 pCambia2300-4EC
后转化大肠杆菌 XL10, 提取质粒, 经酶切及测序验
证后, 转化农杆菌 GV3101。
1.4 农杆菌转化及抗性植株再生
将质粒 pCambia2300-4EC 转入农杆菌菌株
GV3101, 挑取重组农杆菌 GV3101 单菌落于 YEP
(含 50 mg L–1利福平和 50 mg L–1卡那霉素)液体培
养基中, 28℃、180 转 min–1振荡培养过夜; 取过夜
活化后的菌液 5 mL加至 100 mL新鲜的 YEP液体
培养基中, 28℃、180 转 min–1 培养过夜, 至菌液
OD600为 0.6~0.8, 于 4℃、5000转 min–1离心 5 min
收集菌体 , 用 MS 液体培养基洗涤一次后悬浮于
MS液体培养基, 调节 OD600至 0.4~0.6。用农杆菌侵
染无菌的棉花子叶, 将侵染后的子叶置于共培养基
(MS+2,4-D 0.1 mg L–1+KT 0.1 mg L–1)中培养 3 d, 然
后将其转移到诱导培养基中 (MS+2,4-D 0.1 mg
L–1+KT 0.1 mg L–1+Km 100 mg L–1+Cef 500 mg L–1),
在黑暗条件下培养2个月后, 将诱导出的愈伤组织放
入增殖培养基(MS+MgCl2 0.9 g L–1+Celrit 2.0 g L–1+
葡萄糖 30 g L–1, pH 5.8)分化, 愈伤组织继代 3~5次
后转入分化培养基中 (MS+谷氨酰氨 1.0 g L–1+
MgCl2 0.9~1.5 g L–1+ Celrit 2.0~3.0 g L–1+葡萄糖
20~30 g L–1, pH 5.8), 分化成胚状体, 进一步长成小
苗, 将小苗嫁接到新的植株。
1.5 转基因棉花的筛选与鉴定
用 SDS 法提取转基因棉花基因组, 利用基因特
异性引物 99JC-L 和 99JC-R、8JC-L 和 8JC-R、
MortD5JC-L 和 MortD5JC-R、AtD15L 和 AtD15R
(Xho I)进行 PCR检测(表 1)。
1.6 脂肪酸提取及气相色谱分析
取转基因棉花叶片 0.5 g, 烘干并加液氮研磨,
置于 3 mL的玻璃瓶中, 添加 1 mL甲基化溶液(含甲
醇 0.85 mL, 2,2-二甲氧丙烷 0.05 mL, 盐酸 0.1 mL),
85℃甲基化反应 1 h; 冷却后, 添加 1%氯化钠 1 mL
和正己烷 0.5 mL, 漩涡振荡后于室温放置 10 min或
更长时间; 离心取上层液相, 进行气相色谱分析[5]。
第 1期 刘 江等: 超长链多不饱和脂肪酸在棉花中的异源合成 89


2 结果与分析
2.1 植物表达载体 pCambia2300-4EC的构建
将高等植物中丰富的油酸 LA或亚麻酸 ALA转
化成 EPA, 需要至少 3个酶催化, 即 Δ9链延长酶、
Δ8 去饱和酶和 Δ5 去饱和酶, 为了增加目的产物

EPA的最终产量, 还可以增加 ω3去饱和酶基因, 即
可将油酸转化成亚麻酸的 Δ15 去饱和酶。我们将这
4 个基因分别亚克隆到辅助载体 pAUX2 中, 经酶切
鉴定, 获得 1.9、2.3、2.5和 2.6 kb的目的片段(图 2),
分别含有 35s启动子、目的基因和终止子。

图 2 Δ9、Δ8、Δ5、Δ15基因辅助载体单酶切鉴定
Fig.2 Verification of vectors containing individual transgenes of Δ9, Δ8, Δ5, Δ15 with Xba I digestion
M: DNA分子量; 1~4: pAUX2-Δ9、pAUX2-Δ8、pAUX2-Δ5和 pAUX2-Δ15载体 Xba I单酶切; a~e: 线性化的 pAUX2片段, E9表达盒, D8
表达盒, D5表达盒, D15表达盒。
M: DNA marker; 1–4: pAUX2-Δ9, pAUX2-Δ8, pAUX2-Δ5 and pAUX2-Δ15 digested with Xba I, respectively; a–e: fragment of pAUX2,
fragment of E9 expression cassette, fragment of D8 expression cassette, fragment of D5 expression cassette, and fragment of D15 expression
cassette.

利用本实验室多基因表达载体构建专利技术[15],
构建由 Δ8去饱和途径中 Δ9链延长酶、Δ8去饱和酶、
Δ5去饱和酶及 Δ15去饱和酶4个基因组成的辅助表
达载体 pAUX2-Δ9Δ8Δ5Δ15 (图3), 首先将 pAUX2-
Δ8中的 Δ8基因的表达盒(35S/Δ8/Tnos) Xba I 切下,
连接到经限制性内切酶 Avr II 线性化的质粒
pAUX2-Δ9中 , 鉴定方向后 , 获得质粒 pAUX2-
Δ9Δ8。然后, 用 Xba I 将 Δ5基因的表达盒在质粒
pAUX2-Δ5上切下来, 连接到用 Avr II线性化的质粒
pAUX2-Δ9Δ8中 , 鉴 定 方 向 后 , 获 得 pAUX2-
Δ9Δ8Δ5。接着, 将 pAUX2-Δ9Δ8Δ5用 Avr II线性化,
来接受用 Xba I在 pAUX2-Δ15上切下的 Δ15基因的
表达盒 , 获得带有 4个基因表达盒的过渡质粒
pAUX2-Δ9Δ8Δ5Δ15。对各个中间质粒用 Xba I酶切
验证, 每个过渡载体除能切出3.9 kb 的辅助载体的
骨架片段外 , 还能分别切出带有1~4个基因表达盒
的片段 (图 4), 其中每个基因都含有独立的
CaMV35S启动子和 Tnos终止子, 最后将4个基因的
表达盒酶切连入植物表达载体 pCambia2300, 以抗
kan基因作为选择标记。
2.2 多基因载体的转化以及转基因棉花的筛选
与鉴定
利用农杆菌介导法 , 转化棉花珂201子叶 (图
5), 获得 46个再生克隆 , 嫁接 367棵再生苗 , 以
PCR 鉴定筛选到阳性植株37棵 , 其中12株收获棉
籽。SDS 法提取 T2代转基因株系叶片基因组 DNA,
利用基因特异性引物进行 PCR 检测 , 在琼脂糖凝
胶电泳图上有目的条带 (图6), 在大部分植株中能
检测到目的基因 , 初步确定这些株转基因株系为
阳性株系。

图 3 辅助载体 pAUX2-Δ9Δ8Δ5Δ15的构建
Fig. 3 Construction of the plant expression vector
pAUX2-Δ9Δ8Δ5Δ15
90 作 物 学 报 第 40卷



图 4 重组载体 pAUX2-Δ9、pAUX2-Δ9Δ8、pAUX2-Δ9Δ8Δ5和 pAUX2-Δ9Δ8Δ5Δ15的 Xba I酶切检测
Fig. 4 Recombinant plasmids pAUX2-Δ9, pAUX2-Δ9Δ8, pAUX2-Δ9Δ8Δ5, and pAUX2-Δ9Δ8Δ5Δ15 digested by Xba I
所有的质粒都用 Xba I酶切, 并在 0.8%的琼脂糖电泳上分离。a: pAUX3-E9D8D5载体的结构示意图; b: 中间载体的酶切检测, 红色箭
头所指是载体主干(3.9 kb); c: 各个独立表达盒的大小。
All the intermediate constructs were digested by Xba I and separated on a 0.8% agarose gel. a: diagram of pAUX2-Δ9Δ8Δ5Δ15, showing the
arrangement and linkage of individual cassette; b: restriction digestion of all intermediate vectors. Red arrow indicates the position of the
vector backbone (3.9 kb); c: sizes of individual inserts.


图 5 棉花的再生过程
Fig. 5 Regenerative process of transgenic cotton
A: 叶片诱导出初级愈伤组织; B: 分化中的愈伤组织;
C: 愈伤分化形成的小苗; D: 小苗嫁接到新的植株。
A: primary calli from the leaf; B: differentiating calli;
C: regenerated plantlets calli; D: new plant grafted.

2.3 转基因棉花叶片脂肪酸检测
分别提取上述 12株转基因棉花以及非转基因棉
花叶片的脂肪酸, 并利用气相色谱进行脂肪酸含量
分析(图 7)。其中 6 号和 10 号株转基因棉花叶片在
18 min左右产生了 2个明显的峰, 与标样对比, 鉴定
这 2 个峰分别为 AA 和 EPA, 平均含量分别为 1.0%
和 5.0% (表 2)。通过与非转基因棉花叶片比较可以
看出, 转基因棉花叶片中其他脂肪酸成分及含量也
发生了变化, 其 LA、ALA的含量明显下降, 其他脂
肪酸变化不大。表明转化的 EPA 合成途径中的这 4
个基因已经整合到棉花基因组中并成功表达, 其编
码产物即 4种酶在棉花中成功组建了 EPA的合成代
谢途径, 并以棉花内源 LA 和 ALA 为底物经过多步
连续酶促反应生成了 AA和 EPA。

图 6 转基因棉花的 PCR检测
Fig. 6 Detection of transgenic lines by PCR
M: marker; 1~12: 转基因植株。M: marker; 1–12: transgenic lines.
第 1期 刘 江等: 超长链多不饱和脂肪酸在棉花中的异源合成 91


表 2 转基因棉花叶片脂肪酸组成分析
Table 2 Total fatty acid composition of leaves from transgenic
cotton
植物源 Plant source 脂肪酸
Fatty acid (mol % of total) Wild type Transgenic plant
16:0 32.5 33.3±2.3
16:1Δ9 4.1 4.2±0.8
18:0 2.4 3.8±0.9
18:1Δ9 5.2 5.0±0.9
18:2Δ6,9 13.5 10.4±1.2
18:3Δ9,12,15 42.3 37.3±2.8
20:5Δ5,8,11,14(AA) 1.0±0.2
20:5Δ5,8,11,14,17 (EPA) 5.0±0.7

图 7 6号转基因棉花叶片脂肪酸气相色谱分析
Fig. 7 GC profiles of the sixth transgenic cotton leaf fatty acid
methyl esters
3 讨论
棉花是我国重要的农作物, 精炼的棉籽油是我
国重要的食用油来源之一, 其含有丰富的必需脂肪
酸, 为了进一步改良棉籽油, 可以通过转基因技术
改变棉籽油的成分, 培育出优质的棉花新品种, 理
论上所有外源基因都可以转入棉花[16]。目前, 向棉
花中转入的基因主要涉及抗虫、抗除草剂和耐盐等
基因。
在棉花中生产 EPA, 至少需要转化3个酶基因才
能实现, 目前常用的就是分次转化法 [17], 每次转化
都要一个新的筛选标记基因来筛选转基因植株, 同
时需要筛选纯合体, 来进行下一个基因的转化。由
于高等植物生长周期长、转化困难, 因此较难运用
于实践, 同时分次转化获得的植株后代容易发生基
因分离, 导致性状不稳定, 因此需要寻找更简单快
捷的转化方法。
本研究中, 为在高等植物中重组 EPA 合成代谢
途径, 我们分别从球等鞭金藻、眼虫、高山被孢霉
和拟南芥中克隆到 Δ9链延长酶、Δ8去饱和酶、Δ5
去饱和酶和 Δ15去饱和酶基因, 利用我们自己的多
基因表达载体构建专利技术, 将 EPA 合成途径中的
4个基因串联在一起, 一次性转化棉花, 通过卡那霉
素筛选, 获得12株转基因株系。提取转基因植株叶
片基因组, 利用基因特异性引物检测, 确定转基因
株系为阳性株系, 从图2可以看出, 在12株转基因株
系中, 均能扩增出 Δ8和 Δ5去饱和酶基因, 而 Δ9链
延长酶基因和 Δ15去饱和酶基因却只在部分植株中
扩增出来, 部分原因可能是这些基因都具有相同的
启动子与终止子, 且方向相同, 在基因整合到染色
体过程中发生重组而丢失掉了。提取12株转基因棉
花叶片脂肪酸进行气相色谱检测, 在转基因棉花叶
片中, 可以明显看出亚油酸和亚麻酸的含量比野生
型含量低, 其中有2株生成了 AA 和 EPA, 平均含量
达到1.0%和5.0%。在转基因棉花叶片中并没有检测
到中间产物的生成, 这可能是本研究将 EPA 合成途
径的4个基因表达盒串联在一个基因片段上 , 转入
棉花中, 由于基因之间紧密连锁, 相同的启动子使
其表达量也相同, 而且由于在 EPA 合成中, 催化第
一步反应的酶一般都是限速酶, 其他酶活性相对较
高, 因此不会造成中间产物积累, 所以在转基因棉
花叶片中检测不到中间产物是正常的; 这与一些富
含 EPA 的微藻和真菌中情况类似, 如马铃薯治病疫
霉, 含有丰富的 EPA, 占总脂肪酸的15.2%, 但 EPA
合成途径的中间产物含量却极低, 有的甚至检测不
到[18]。
转基因植物合成 VLCPUFAs 后, 需要将其转化
为三酰甘油(TAG)才能被利用, 种子是 TAG 储存的
主要部位, 因此选择强的种子特异性启动子来实现
外源基因在种子中的超表达, 是提高 VLCPUFAs 在
植物中含量的有效方法之一。2010 年, Cheng 等[19]
以含有 Napin 启动子的多基因载体转化埃塞俄比亚
芥(Brassica carinata), 在转基因种子中检测到 EPA,
含量达到总脂肪酸的 20%, 是迄今为止, 在转基因
植物中合成的 EPA 含量最高记录, 这与埃塞俄比亚
芥自身脂类代谢及 Napin 启动子的高效表达相关。
为了进一步提高棉花中 EPA 含量, 我们将克隆棉花
种子特异性启动子及高活性的酶, 从而促进 EPA 的
92 作 物 学 报 第 40卷


积累。EPA 可以通过 Δ5 链延长和 Δ4 去饱和生成
DHA, 因此在棉花中生产 DHA还需转入 Δ5链延长
酶基因和 Δ4去饱和酶基因, 我们将进一步克隆高催
化活性的 Δ5链延长酶基因和 Δ4去饱和酶基因以及
调控脂肪酸合成的转录因子WRI1和 LEC1等[20], 一
起转入可以高效合成 EPA 的转基因棉花中, 来促进
外源基因在棉花种子中的表达以及脂肪酸的合成 ,
从而提高 VLCPUFAs的产量。当棉籽油中 AA、EPA
和DHA的含量各占总脂肪酸的 5%, 10 g这样的油脂
就能满足 1个人 1天对 VLCPUFAs的需求量[21]; 转
基因植物就有可能作为鱼油的良好替代资源应用于
生产, 为更多的人提供廉价且高品质的食用油, 从
而大大增进人类健康。
4 结论
通过转基因技术, 将 Δ9 链延长酶、Δ8 去饱和
酶、Δ5去饱和酶和 Δ15去饱和酶 4个基因转化棉花,
在转基因棉花叶片中检测到 1.0%和 5.0%的 AA 和
EPA, 没有检测到其他非特异性脂肪酸 , 证明在棉
花中异源合成 EPA 是可行的, 为进一步在棉籽中生
产 VLCPUFAs奠定基础。
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