全 文 ：武汉植物学研究 1999, 17( 4) : 314～318
Journal of Wuhan Botanical Research
蒲圻贝母组织培养鳞茎
形成过程中生理生化变化研究

蔡朝晖　李　萍　李会军　高山林
(中国药科大学中药学院　南京　210038)
董婷霞　詹华强
(香港科技大学生物系、生物技术研究所　香港九龙)
提　要　对蒲圻贝母鳞茎的组织培养进行了研究 ,筛选出了较佳的激素配比,并对鳞茎生长
过程中的可溶性糖、淀粉含量、淀粉酶活性、PAL 酶活性以及生物碱含量变化之间的关系进
行了探讨。
关键词　鳞茎培养, 糖含量,淀粉酶, 苯丙氨酸裂解酶,生物碱
贝母 Bulbus f ritillar iae 是著名的止咳化痰之要药, 应用历史悠久, 目前资源渐趋紧缺。蒲圻贝母
Fr itillar ia puqiensis是近年来发现的新的资源植物。蒲圻贝母为贝母属一种,多为野生, 有清热散结,化
痰止咳之功效, 在湖北省的使用历史有数百年之久, 蒲贝抗病力强,有效成份总生物碱含量高。蒲贝中的
主要生物碱蒲贝酮碱,对小鼠氨水引咳和豚鼠枸橼酸引咳具有显著的镇咳作用, 静脉注射 3 mg/ kg, 1 h
后即产生明显的镇咳效果, 作用持续超过 4 h, 其作用与 30～60 mg / kg 的可待因相似, 具有用量小的特
点, 是一种很有开发前途的纯天然高效止咳药〔1, 2〕,但野生资源渐少。为了保护和扩大资源, 我们对蒲圻
贝母进行了组织培养, 并对其鳞茎形成过程中的生理生化指标进行了测定。试图通过对糖含量及有关酶
活性的研究, 探讨贝母鳞茎的器官发生与苯丙氨酸裂解酶活性及糖代谢之间的协调关系, 为深入研究器
官发生的机理及提高培养物有效成分含量提供一些基础资料。
1　材料和方法
1. 1　材料
蒲圻贝母 Fr itillar ia p uq iensis 取自湖北省蒲圻市,并经中国药科大学李萍博士鉴定。
1. 2　方法
( 1) 无菌材料的获得: 新鲜的蒲圻贝母鳞茎流水冲洗 3 h, 0. 1%氯化汞表面消毒 20 min 后 ,无菌水
冲洗 5 次;切成 0. 5 cm×0. 5 cm×0. 2 cm 的小块 ,接种于 MS 附加 BA 2 mg·L - 1, IAA 1mg·L - 1的培
养基上, 在 25℃的黑暗条件下培养,获得无菌材料。每 50 d 继代 1 次,作为实验材料。同一批材料在培养
的不同时间随机取样, 用于贝母鳞茎生长率、糖含量、酶活性和生物碱含量的测定。
( 2) 激素配比试验: 将贝母鳞茎切成小块接种在预先称重的含有 MS, 并附加不同配比激素培养基
的 100 mL 三角瓶内( 40 mL 培养基/瓶 ) ,培养 50 d 后收获。按文献〔3〕的方法计算收获量、生长率、每升
培养基增加鲜重及干重, 并测定生物碱含量及每升培养基增加生物碱数量。


收稿日: 1998-10-12,修回日: 1998-12-14。第一作者:女, 1964年出生,副研究员(硕士) ,从事植物生物技术研
究。
国家新药基金资助项目。
( 3) 糖含量的测定: 贝母鳞茎粉末用 80%乙醇提取,提取液用于测定可溶性总糖含量。残渣烘干,加
蒸馏水, 沸水浴中加热 15 min。过氯酸酸解后,上清液用于测定淀粉含量。样品溶液按文献〔4, 5〕的方法
测定, 即取样品溶液 2. 5 mL , 加入蒽酮-硫酸试剂 6. 5 mL ,显色 10～15 m in,在 640 nm 处比色, 测定可
溶性总糖和淀粉含量。总糖提取液中加入 NaOH 溶液, 沸水浴中煮沸 5 min 后,再按上述方法测定蔗糖
含量。还原糖= 可溶性总糖- 蔗糖/ 0. 95
( 4) 淀粉酶活力测定按文献〔6〕方法进行。
( 5) 苯丙氨酸裂解酶( PAL ) 活性的测定按文献〔7〕方法进行。
( 6) 生物碱含量测定按文献〔8〕方法进行。
2　结果
2. 1　蒲贝鳞茎的生长
在培养的前 2周, 鳞茎没有明显的生长。22 d 左右从切片边缘长出 4、5 个白色的芽点, 芽点逐渐长
大成为小鳞茎(图 1)。45 d 后小鳞茎的生长逐渐停止,在第 30～35 d 鳞茎的生长最快。不同培养时期鳞
茎的生长情况见图 2。
A. 第 22 d时有小鳞茎长出( Bulbs formed at th e 22th d ay) ; B. 培养 50 d时的鳞茎( Bulbs af ter 50 days)
图 1　在 MS 培养基上生长的 F. puqiensis鳞茎
Fig . 1　Bulbs of F . pu qiensi s cu ltured on MS medium
　　▲- ▲ 生长率增量( Raising of gr ow th rate) ;
　　●- ● 生长率( Grow th rate)
图 2　不同培养时间鳞茎生长率的变化
Fig. 2　Th e changes of grow th rate at
dif feren t cu lture t ime
315　第 4期　　　　　　　　　蔡朝晖等:蒲圻贝母组织培养鳞茎形成过程中生理生化变化研究
2. 2　激素配比试验
试验结果见表 1。较高的 BA 浓度有利于贝母鳞茎的生长,在相同的 IAA 浓度下,提高 BA 的浓度,
可以使生长率增长 19. 1%。在相同浓度下, NAA 促进鳞茎生长和提高生物碱含量的效果好于 IAA。培
养基中 IAA 浓度较低时生物碱含量较高。在本实验范围内, 虽然第
组的生长率较高, 但第组最适合
于生物碱的生产。
表 1　不同激素配比对鳞茎生长率和生物碱含量的影响
Table 1　The effects o f differ ent combinations of
hormones on g row th rat e and content o f alkaloid ( unit of hormone: mg·L - 1)
项目　Item
激素　Hormone

BA2+ IAA1 BA1+ IAA1 ! BA1+ IAA 0. 5 BA1+ NAA0. 5
接种量 Inoculated w eight ( g) 1. 458±0. 043 1. 458±0. 025 1. 448±0. 038 1. 355±0. 040
收获量 Harvested w eight ( g) 5. 118±0. 179 4. 141±0. 087 3. 866±0. 126 4. 173±0. 137
生长率 Growth rate 3. 51±0. 061 2. 840±0. 042 2. 67±0. 079 3. 08±0. 092
可增鲜重 Yield of FW ( g·L- 1) 91. 5 67. 08 60. 45 70. 45
可增干重 Yield of DW ( g·L- 1) 11. 79 8. 64 7. 79 9. 07
生物碱含量 Conten t of alkaloid( % ) 0. 206 2 0. 144 4 0. 210 3 0. 301 0
可产生物碱 Yield of alk aloid ( mg·L- 1) 24. 30 12. 48 16. 38 27. 30
2. 3　糖含量变化
在培养前的鳞茎内淀粉的含量为 10. 98% ,较可溶性总糖的含量高。在培养过程中,可溶性总糖和
蔗糖含量的变化不明显, 而淀粉含量的变化幅度最大, 在 13～35 d期间有大幅度振荡(图 3)。
2. 4　淀粉酶活性变化
在培养过程中,
-淀粉酶活力显著变化, 而 -淀粉酶的活力始终处于较低的水平, 仅在培养的中期
出现 1 个活性高峰, 其它时期的变化不明显。总淀粉酶的变化趋势与
-淀粉酶相似,见图 4。
　- 　 蔗糖( Sucrose) ;×-×(还原糖( Reducing sugar) ;
▲- ▲ 可溶性总糖(S oluble total sugar) ;
●- ● 淀粉( Starch)
图 3　鳞茎培养过程中糖含量变化
Fig. 3　Changes of sugar content during
th e bulb culture of F . p uqiensis
▲- ▲ -淀粉酶( -amylase) ;
●- ●
-淀粉酶(
-amylas e) ;
　- 　 总淀粉酶( Total amylas e)
图 4　鳞茎培养过程中淀粉酶活性变化
Fig. 4　Changes of amylas e act ivi ty durin g
th e bulb culture of F. p uqiensis
316 武汉 植 物学 研究　　　　　　　　　　　　　　　第 17卷　　
2. 5　PAL活力变化
PAL 活力在第 19 d 时有一明显的高峰,酶活力比培养初期升高约 2. 5倍, 以后活力急剧下降,到最
后几天几乎没有活性(图 5)。
2. 6　生物碱含量变化
生物碱含量在第 19 d 出现 1个高峰, 比培养前增加 27% , 其它时期保持在比较平稳的水平(图 6)。
图 5　 鳞茎培养过程中 PAL 活力变化
Fig. 5　Changes of PAL act ivity durin g the
bulb cultur e of F. p uqiensis
图 6　鳞茎培养过程中生物碱含量变化
Fig. 6　Changes of alkaloid content during
th e bulb culture of F. p uqiensis
3　讨论
( 1)从生长率增长看,贝母鳞茎在各个培养阶段的生长率变化较大。在培养的初期,鳞茎几乎没有生
长; 在培养的中期生长最快,尤其是在第 30～35 d 期间, 生长率净增长达 0. 71; 而在培养后期, 生长又逐
渐减慢。而生物碱含量( % )在培养期间不仅没有下降, 在培养 19 d 时还出现过高峰,这表明蒲圻贝母器
官培养期间可以保持次生代谢产物生产的稳定性。培养物生长量的增长将对生物碱积累起决定作用。在
第 19 d 时, 虽然生物碱含量较高, 但综合生长率所计算出的每升培养基所产生物碱的量并不高, 因此
19 d时不能作为收获鳞茎的最佳时期, 而在第 45～50 d 时收获较好。在本实验范围内, BA 2 mg·L - 1和
IAA 1 mg·L - 1配合时生长率最高, 而 BA 1 mg·L - 1和 NAA0. 5 mg·L - 1配合使用时每升培养基可产
生的生物碱最多, 因此在以后的培养中应选择这一配比。
( 2) 由于贝母鳞茎中含有较多淀粉, 因此在组织培养初期, 首先利用本身的淀粉提供能量, 淀粉含
量下降, 体内可溶性糖的含量增加。在培养的第 3 周( 13～19 d) ,由于细胞要分化一些新的芽原基,这时
淀粉迅速积累以满足细胞对物质和能量的需求; 同时淀粉酶活性迅速降低, 使得淀粉含量在第 19 d 时
达 14. 21%。在 22 d 左右可看到有小鳞茎长出,这时淀粉含量迅速降低,说明小鳞茎形成时动用了体内
的大量淀粉。在新鳞茎的生长过程中,淀粉逐渐积累; 而到了培养的后期, 由于培养基中的养料消耗殆
尽,淀粉积累逐渐减慢。在整个贝母鳞茎的培养过程中,
-淀粉酶的活力始终高于 -淀粉酶, 且
-淀粉酶
的活性变化与淀粉含量变化呈负相关。可能
-淀粉酶在贝母鳞茎的淀粉代谢中起主要作用。这与伊贝母
组织培养的报道不一致〔9〕,还需进行研究。从实验结果看,蔗糖与淀粉含量变化呈负相关,而蔗糖含量始
终处于较低水平, 可能在整个培养过程中蔗糖大量分解供淀粉积累所需。培养基中外源的蔗糖也为贝母
鳞茎的生长提供能量。
在培养过程中, 淀粉含量的变化非常显著, 淀粉含量、PAL 活性、生物碱含量的峰值以及芽点分化
在时间上的一致性是明显的, 这表明糖代谢与组织培养中的生物碱积累之间的关系值得注意。
( 3) PAL 是酚代谢中一种重要的酶, 它催化分支反应,从而由莽草酸途径产生广泛的次生产物,如
木质素、酚和香豆素等。此酶的活动受到各种内外因素的影响, 它随植物的生长发育状态而变。在第
317　第 4期　　　　　　　　　蔡朝晖等:蒲圻贝母组织培养鳞茎形成过程中生理生化变化研究
13～19 d时 , PAL 活力迅速升高 2. 5 倍,与这时正在进行芽原基的分化在时间上相一致,可能 PAL 在组
织分化中起重要作用。在芽原基形成后, 酶活性迅速下降, 可能 PAL 活力与细胞的生长无关。
参　考　文　献
1　季晖,李萍,姚力等 . 蒲贝酮碱的止咳作用研究 . 中国药科大学学报, 1993, 24( 2) : 95～97
2　李萍,季晖,徐国钧等 . 中药贝母的止咳化痰作用研究 . 中国药科大学学报, 1993, 24( 6) : 360～362
3　高山林,朱丹妮,蔡朝晖等 . 暗紫贝母鳞茎器官培养生长特征和生物碱累积的研究 . 中国药科大学学报, 1992,
23( 3) : 143～147
4　林炎坤 . 常用的几种蒽酮比色定糖法的比较和改进 . 植物生理学通讯, 1989( 4) : 53～55
5　张友杰 . 蒽酮比色法测定葡萄糖,果糖,蔗糖和淀粉的含量 . 分析化学, 1976, 5( 3) : 167～169
6　严国光 . 农业仪器分析法.北京:农业出版社, 1982. 356～358
7　Koukol J. T he metabol ism of aromat ic compounds in hig her plants. IV. Purif icat ion an d propert ies of th e ph enylala-
nine deam inas e of hordeum vulgare. J Biol Chem , 1961, 236: 2 692～2 698
8　李萍,徐国钧,金蓉銮等 . 中药贝母的研究 XV. 21种贝母生物碱含量的测定 . 中国药科大学学报, 1990, 21( 5) :
319～320
9　汪丽虹,王亚馥,杨汉民等 . 伊贝母组织培养形态发生过程中几种糖类含量及淀粉酶和蔗糖酶活力动态研究 . 西
北植物学报, 1991, 11( 3) : 194～198
PHYSIOLOGICAL AND BIOCHEMICAL ANALYSIS
OF CULTURED FRITILLARIA PUQIENSIS
DURING BULB ORGANOGENESIS
Cai Zhaohui　Li Ping　Li Huijun　Gao Shanlin
( Coll ege of T rad itional Chinese Medic ine, China Phar maceuti cal Univ ersity　Nan jing　210038)
Dong Tingx ia　Zhan Huaqiang
( Dep artment of Biology and Biote chnology Re sear ch I nsti tute , T he H ong K ong
Unive rsity of S cience and T echnology　Kowloon , Hon g Kong, C hina)
Abstract　Plant tissue culture methods o f Fr itillar ia puqiensis w ere est ablished. Var ious combinations
of phytohormones w ere t est ed in the cultured F . p uqiensis, and t he best cultur e condition w as r e-
vealed. In addition, so luble sugar , st arch, amy lase act ivity, pheny lalanine ammonia lyase ( PAL ) activit y
and alkaloid content dur ing bulb or ganogenesis of F . puqiensis were also det ermined.
Key words　Bulb cultur e, Sugar content, Am ylase , PAL , A lkalo id
318 武汉 植 物学 研究　　　　　　　　　　　　　　　第 17卷