全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(8): 12471252 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家自然科学基金项目(31300280)和国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2013CB127702)资助。
This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31300280) and the National Key Basic Research Program of
China (2013CB127702).
* 通讯作者(Corresponding authors): 郑文明, E-mail: wmzheng@henau.edu.cn; 董振营, E-mail: zhydong@genetics.ac.cn
** 同等贡献(Contributed equally to this work)
第一作者联系方式: E-mail: xingzhang.1989@163.com
Received(收稿日期): 2016-02-22; Accepted(接受日期): 2016-05-09; Published online(网络出版日期): 2016-06-02.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160602.1435.008.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.01247
利用 HMW-GS全缺失突变体快速构建 Glu-1位点近等渗入系
张星星 1,2,** 王召军 2,3,** 杨玉双 2,4 王道文 2 郑文明 1,* 董振营 2,*
1河南农业大学生命科学学院 / 小麦玉米作物学国家重点实验室 / 河南粮食作物协同创新中心, 河南郑州 450002; 2中国科学院遗传
与发育生物学研究所 / 植物细胞与染色体工程国家重点实验室, 北京 100101; 3中国科学院大学, 北京 100049; 4中国热带农业科学
院橡胶研究所, 海南儋州 571731
摘 要: 小麦高分子量麦谷蛋白亚基(high molecular weight glutenin subunit, HMW-GS)由 Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1位点
中含有的复等位基因编码, 评价和优化 Glu-1 位点组合是认识与改良 HMW-GS 表达与功能的重要途径。本研究创制了
以小偃 81 为背景的 HMW-GS 基因完全缺失突变体 DLGlu1。将 DLGlu1 与加拿大优质强筋小麦品种 Glenlea 杂交, 结
合后代幼胚培养与分子标记辅助选择技术, 在 BC3F3种子中快速鉴定出来自 Glenlea 的 Glu-A1a、Glu-B1al 和 Glu-D1d
位点不同组合的 7 种渗入系材料, 可进一步发展成一套完整的 Glu-1 位点有差异的近等渗入系。本研究表明, DLGlu1
可用于 Glu-1位点近等渗入系的快速创制, 对 Glu-1位点功能研究和改良具有重要价值。
关键词: 小麦; 高分子量麦谷蛋白亚基; 缺失突变体; 渗入系
Rapid Development of Glu-1 Locus Near-isogenic Introgression Lines Using
HMW-GS Deletion Mutant
ZHANG Xing-Xing1,2,**, WANG Zhao-Jun2,3,**, YANG Yu-Shuang2,4, WANG Dao-Wen2, ZHENG Wen-
Ming1,*, and DONG Zhen-Ying2,*
1 State Key Laboratory of Wheat and Maize Crop Science / Collaborative Innovation Center of Henan Grain Crops, College of Life Science, Henan
Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2 State Key Laboratory of Plant Cell and Chromosome Engineering, Institute of Genetics and
Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China; 3 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
4 Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou 571731, China
Abstract: Wheat (Triticum aestivum L., AABBDD) high molecular weight glutenin subunits (HMW-GS) were encoded by the
genes located in Glu-A1, Glu-B1, and Glu-D1 loci. Evaluation and optimization of the combination of HMW-GS are very impor-
tant to understand Glu-1 functions. In this study, we constructed a HMW-GS deletion mutant, DLGlu1 with Xiaoyan 81 back-
ground, and crossed it with Glenlea, a Canada elite wheat variety with superior end-use quality. Combining the technologies of
wheat embryo culture and molecular marker-assisted selection (MAS), we obtained seven introgression lines containing Glenlea
Glu-A1a, Glu-B1al, and Glu-D1d loci, which can be developed as a complete set of near-isogenic introgression lines possessing
Glenlea different HMW-GS genes. Our study indicated that the Glu-1 deletion mutant DLGlu1 is of great value in the fast deve-
lopment of Glu-1 near-isogenic introgression lines and the study and utility of wheat Glu-1.
Keywords: Wheat; HMW-GS; Deletion mutant; Introgression lines
随着测序技术的发展 , 一些模式植物和重要农作物
基因组相继被测序 , 并绘制出基因组精细图 [1-2]。小麦
(Triticum aestivum L., 2n = 42, AABBDD)基因组十分庞大
(17 Gb, 约为水稻基因组的 40 倍), 基因组重复序列比重
较高, 同时携带 A、B和 D三套亚基因组, 因此小麦基因
组测序和功能基因组研究一直是极具挑战性的工作[3]。最
近已经通过测序获得普通小麦及其近缘物种的基因组草
图[4-6], 为进一步认识小麦功能基因和加快小麦产量和品
1248 作 物 学 报 第 42卷
质育种进程提供了新的机遇。
创制基因缺失突变体是研究基因功能的重要方法之
一。采用 T-DNA插入和 EMS诱变方法, 已得到拟南芥和
水稻几乎每个基因的缺失突变体 , 这些突变体是用来研
究相应基因功能缺失效应的重要材料[7-8]。普通小麦是异
源六倍体, 对大多数小麦基因而言, 同时存在 6 个同源拷
贝, 每 2 个拷贝来自同一亚基因组, 理论上只有把每个基
因的 6个拷贝同时突变才可以造成功能缺失, 这种基因组
冗余对创制小麦基因功能缺失突变体是个巨大挑战。然而,
基因组冗余特性使小麦基因组可以耐受更高频率的突变,
即可以在一个较小的突变群体内检测到较多基因的突变,
同时也使得小麦基因组可以耐受更大片段的缺失 [9]。如
Fitzgerald 等[10]通过检测 4500 份小麦离子束辐射诱变 M2
材料, 共检测出 9 个 TaPFT1 基因缺失突变体, 缺失区间
达到数十兆碱基。Yang等[11]检测了 5600份小麦离子束辐
射诱变M2材料, 共发现 7个 Glu-1缺失突变体, 缺失范围
对应水稻 156~345 kb 的区间。这些结果说明采用物理诱
变方法可以快速创制大片段缺失突变体用于小麦功能基
因研究。
相对于玉米和水稻等作物 , 小麦面粉可以制作成面
包、馒头、面条、饼干和糕点等多种食品, 主要是因为小
麦面粉含有独特面筋成分, 赋予面团黏弹性和延展性。小
麦面筋主要由醇溶蛋白(gliadin)和谷蛋白(glutenin)组成,
其中谷蛋白又可以分为高分子量麦谷蛋白(high molecular
weight glutenin subunit, HMW-GS)和低分子量麦谷蛋白
(low molecular weight glutenin subunit, LMW-GS)两大类[12]。
醇溶蛋白对形成面团的延伸性起主要作用, 而麦谷蛋白
是影响面团弹性的重要因素, 决定面包烘烤品质, 其中
HMW-GS 与小麦面包烘烤品质的关系尤为密切 [ 1 2 ]。
HMW-GS的编码基因位于普通小麦第一部分同源群 1A、
1B、1D长臂的 Glu-1位点, 分别称为 Glu-A1、Glu-B1和
Glu-D1[13]。每个 Glu-1位点编码 2个在遗传上紧密连锁的
HMW-GS 亚基, 一个为分子量较大的 x-型亚基, 一个为
分子量较小的 y-型亚基。x-型和 y-型亚基蛋白序列均由信
号肽、N-端结构域、中间重复区和 C-端结构域组成[12-13]。
HMW-GS 在不同小麦品种中存在着丰富的变异, 这些等
位变异不仅造成其表达及在 SDS-PAGE 凝胶电泳的迁移
率差异, 也造成它们功能上的差异。如在 Glu-D1 位点,
Glu-D1d (表达 Dx5 和 Dy10 亚基)功能显著优于 Glu-D1a
(表达 Dx2和 Dy12亚基)[14]。
本实验室在前期研究中创制了普通小麦品种小偃 81
的离子束辐射诱变群体, 筛选到Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1
的单缺失突变体, 并在同一遗传背景下评价了 3个同源位
点的功能差异[11]。在此基础上, 我们采用聚合育种技术获
得了小偃 81的 Glu-1完全缺失突变体 DLGlu1。本研究旨
在评价 DLGlu1作为材料基础快速获得不同 Glu-1等位渗
入系, 并用于 Glu-1功能研究的前景。
1 材料与方法
1.1 试验材料
将普通小麦品种小偃 81 (1, 14+15, 2+12)分别缺失
Glu-A1a、Glu-B1h 及 Glu-D1a 的突变体 DLGluA1、
DLGluB1和 DLGluD1 [11]相互杂交, 获得 Glu-1完全缺失
突变体 DLGlu1。Glenlea (2*, 7OE+8, 5+10)是加拿大优质
强筋小麦品种, 携带 Glu-A1b、Glu-B1al 和 Glu-D1d 优异
等位变异[15]。普通小麦中国春及其缺体–四体材料[16]用于
分子标记的定位验证。
2014 年将 Glenlea (父本)和突变体 DLGlu1 (母本)种
植于中国科学院遗传与发育生物学研究所温室(北京), 并
进行杂交 , 利用分子标记筛选目标单株 , 与轮回亲本
DLGlu1 回交至 BC3F1 代, 再自交一次; 结合幼胚培养技
术[17], 于 2015 年获得 BC3F2群体; 随机选取 3 个位点均
为 Glenlea 基因型(Glu-A1b、Glu-Bal1 和 Glu-D1d)的 3份
材料(BC3F2-6、BC3F2-16、BC3F2-56)自交, 产生 BC3F3种
子, 用于基因分型分析。
1.2 引物设计及特异分子标记检测
利用 NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) Glu-A1
序列信息和普通小麦中国春基因组序列信息(http://plants.
ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index), 根据 Glu-A1
转座子插入多态性开发 Glu-A1 特异分子标记 Xrj5, 并采
用 Primer Premier 5.0设计引物。Glu-B1特异分子标记为
BxMAR, 位于 Bx 基因上游 750 bp 核基质结合区(matrix
attachment region, MAR) [18]; Glu-D1特异分子标记为 Xrj2,
位于 Glu-D1座位 1Dx和 1Dy基因之间[19]。Glu-A1、Glu-B1
和 Glu-D1 特异分子标记引物序列及在不同小麦品种中预
期扩增产物如表 1所示。
表 1 本研究所用的分子标记
Table 1 Molecular marker primers used in this study
标记
Marker
引物序列
Primer sequence (5′–3′)
预期扩增长度
Expected amplicon (bp)
检测位点
Examined site
Xrj5 F: GCCCAATAATTTGTAAGTCCA; R: ACAACTATTTCGGAACAGAGG 594 (X), 719 (C), 882 (G) Glu-A1
BxMAR F: CCTCAGCATGCAAACATGCAGC; R: CTGAAACCTTTGGCCAGTCATGTC 520 (C), 563 (G), 800 (X) Glu-B1
Xrj2 F: CTCGCTCGACGGTGTTGAA; R: CCTTTGGCCCAGATAAAGTG 428 (G), 1085 (X, C) Glu-D1
括号内 C、G和 X分别表示中国春、Glenlea和小偃 81。
C, G, and X in the brackets stand for Chinese Spring, Glenlea, and Xiaoyan 81, respectively.
第 8期 张星星等: 利用 HMW-GS全缺失突变体快速构建 Glu-1位点近等渗入系 1249
从每个系取 30 粒 BC3F3代种子, 用解剖刀切取有胚
端的半粒放入营养钵发苗, 在小麦一叶一心期剪取第 1片
叶, 用 CTAB法提取基因组 DNA[20]。
PCR总体积为 20 μL, 含 2× PCR Mix (全式金公司)
10 μL、引物各 0.5 μL、DNA模板 1 μL、双蒸水 8 μL。PCR
程序为 94 °C预变性 5 min; 94℃变性 30 s, 60℃退火 30 s,
72℃延伸 50 s, 35个循环; 72℃延伸 5 min。用 1%琼脂糖
凝胶在 1× TAE缓冲液中电泳分离 PCR产物。所使用 DNA
分子标量为 Trans2k Plus DNA Marker (全式金公司)。
用 SPSS 18.0软件对分子标记基因型分离比进行卡方
检验。
1.3 小麦 HMW-GS的提取和 SDS-PAGE
取 BC3F3 种子无胚端的半粒, 用锤子砸碎置 1.5 mL
离心管中。参照 Wan 等[21]描述的方法提取 HMW-GS, 在
10%分离胶上进行 SDS-PAGE电泳。
2 结果与分析
2.1 Glu-1特异分子标记的多态性和染色体定位分析
Glu-1特异分子标记扩增谱带(图 1)与预期(表 1)一致,
其中标记 Xrj5 在含 Glu-A1b 的 Glenlea 中扩增出 882 bp
谱带, 在小偃 81和中国春中的扩增谱带分别为 594 bp和
719 bp; 标记 BxMAR在含 Glu-B1al的 Glenlea中扩增出
563 bp谱带, 在小偃 81和中国春中分别扩增出 800 bp和
520 bp谱带; 标记 Xrj2在含 Glu-D1d的 Glenlea中的扩增
谱带为 428 bp, 中国春和小偃 81携带 Glu-D1a, 扩增产物
为 1085 bp。
利用中国春缺体–四体系, 将 Xrj5、BxMAR 和 Xrj2
分别定位于小麦染色体 1A、1B和 1D上(图 1)。3个分子
标记均为共显性标记, 且在 Glenlea和小偃 81间存在明显
多态性(图 1)说明这 3个分子标记可以用于Glenlea和小偃
81 Glu-1位点的基因型分析。
图 1 3个分子标记的染色体定位及其在 Glenlea和小偃 81间的多态性分析
Fig. 1 Chromosome assignment of the three molecular markers, and validation of the polymorphism between Glenlea and
Xiaoyan 81
2.2 Glenlea不同 Glu-1位点渗入系材料的鉴定
由于 DLGlu1 同时缺失了 Glu-A1、Glu-B1 和 Glu-D1
位点, 因此 3个分子标记检测 DLGlu1均为阴性(图 2), 在
DLGlu1 × Glenlea杂交后代中, 该 3个标记扩增出的条带
为来自 Glenlea的 Glu-A1b、Glu-B1al和 Glu-D1d等位位点。
用标记 Xrj2 和 Xrj5 检测 BC3F2-6 单株后代, 均检测
出与 Glenlea 相同的带型, 说明 Glu-A1b 和 Glu-D1d 在
BC3F2已经纯合, 而标记 BxMAR检测结果存在分离, 因此
在 BC3F2-6 单株后代中共发现 Glu-A1b+Glu-D1d 和
Glu-A1b+Glu-B1al+Glu-D1d 两种基因型 (表 2)。对
BC3F2-16单株后代的检测结果表明, 共有 4种基因型, 分
别是 Glu-D1d、Glu-A1b+Glu-D1d、Glu-B1al+Glu-D1d和
Glu-A1b+Glu-B1al+Glu-D1d (表 2)。
对 BC3F2-56单株后代分两批检测, 共 60粒种子, 3个
分子标记均检测到分离, 说明 Glu-A1、Glu-B1 和 Glu-D1
位点都是杂合状态。检测第 1批 30 粒种子发现 5种基因
型, 分别是 Glu-A1b、Glu-A1b+Glu-D1d、Glu-A1b+Glu-
B1al、Glu-B1al+Glu-D1d和 Glu-A1b+Glu-B1al+Glu-D1d,
但是没有发现 Glu-B1al基因型; 从第 2批 30粒种子中检
测到 2 个 Glu-B1al 基因型个体, 但没有 Glu-A1b、Glu-
B1al、Glu-D1d全部为阴性的材料(表 2)。
综上认为, DLGlu1×Glenlea BC3F3群体中存在以小偃
81为背景、携带 Glenlea Glu-1位点的 7种渗入系(图 2)。
对 BC3F2-6和 BC3F2-16单株后代分离比的卡方检验表明,
Glenlea 的 Glu-1 遗传行为遵从孟德尔基因独立分配和自
由组合规律(表 2); 由于 BC3F2-56 后代个体观测数较小,
未进行卡方检验。
为了进一步验证 Glenlea 的 Glu-1 在所筛选材料的表
达, 提取所检测材料籽粒谷蛋白, 采用 SDS-PAGE方法检
测发现所有材料均有相应 Glu-1 亚基的表达(图 3)。同时
发现, Glu-A1b+Glu-B1al基因型(BC3F3-4)的 7OE表达量略
低于 2*。
3 讨论
HMW-GS 的组成是影响小麦加工品质的重要因素之
一[13]。HMW-GS 功能研究的主要手段有构建重组自交系
或近等基因系研究同一位点不同等位亚基的功能差异[22-23],
创制单位点缺失突变体研究单个位点的缺失效应 [11], 及
采用基因沉默或过表达手段研究单个 HMW-GS 亚基的功
能[24-25]。这些研究为解析 HMW-GS功能提供了重要资料,
但是由于每个 Glu-1位点均存在多种等位变异, 需要创制
多套材料才能一一对其开展研究, 同时受环境及其他遗
传位点(如 LMW-GS 或醇溶蛋白)影响, 来自不同材料的
研究有时会得到截然相反的结论[26-27]。有研究表明, 不同
1250 作 物 学 报 第 42卷
图 2 以分子标记 Xrj5、BxMAR和 Xrj2检测 Glenlea Glu-1渗入系基因型
Fig. 2 Glu-1 genotyps of Glenlea introgression lines detected with molecular markers Xrj5, BxMAR, and Xrj2
1–7单株均以小偃 81为背景, 其基因型分别为 Glu-A1b、Glu-B1al、Glu-D1d、Glu-A1b+Glu-B1al、Glu-A1b+Glu-D1d、Glu-B1al+Glu-D1d、
Glu-A1b+Glu-B1a+Glu-D1d。
The individual BC3F3 plants (1–7) were all in Xiaoyan 81 background and their genotypes were Glu-A1b, Glu-B1al, Glu-D1d,
Glu-A1b+Glu-B1al, Glu-A1b+Glu-D1d, Glu-B1al+Glu-D1d, and Glu-A1b+Glu-B1al+Glu-D1d, respectively.
表 2 以分子标记检测 3个 BC3F2材料后代基因型分布
Table 2 Genotype distribution in the progenies of three BC3F2 lines identified by molecular markers
基因型 Genotype 材料
Line Xrj5+ BxMAR+ Xrj2+ Xrj5+BxMAR+ Xrj5+Xrj2+ BxMAR+Xrj2+ Xrj5+BxMAR+Xrj2+
2 20.05
BC3F2-6 0 0 0 0 6 0 24 0.40 3.84 (3:1)
BC3F2-16 0 0 3 0 5 6 16 1.85 7.82 (9:3:3:1)
BC3F2-56 2 2 4 3 10 7 32 — —
Xrj5+表示 Xrj5标记检测结果阳性, 即与 Glenlea有相同带型, 余此类推。
Xrj5+ indicates positive result of Xrj5 marker amplification, i.e., the banding pattern is the same with that of Glenlea. Analogically to the
others.
图 3 以 SDS-PAGE检测 Glenlea Glu-1渗入系组成
Fig. 3 HMW-GS compositions in the Glenlea introgression lines identified by SDS-PAGE
1–7单株均以小偃 81为背景, 其基因型分别为 Glu-A1b、Glu-B1al、Glu-D1d、Glu-A1b + Glu-B1al、Glu-A1b + Glu-D1d、Glu-B1al +
Glu-D1d、Glu-A1b+ Glu-B1a + Glu-D1d。
The individual BC3F3 plants (1–7) were all in Xiaoyan 81 background and their genotypes were Glu-A1b, Glu-B1al, Glu-D1d,
Glu-A1b+Glu-B1al, Glu-A1b+Glu-D1d, Glu-B1al+Glu-D1d, and Glu-A1b+Glu-B1al+Glu-D1d, respectively.
Glu-1位点编码的 HMW-GS之间存在一定的上位效应[28],
通过构建近等基因系或转基因等实验材料难以消除这些
影响。目前, 还没有一个较好的用于研究每个 Glu-1位点
及每个 Glu-1位点不同等位变异功能的系统。本实验室采
用离子束诱变方法获得 Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1 单缺失
突变体 , 并证明了不同位点缺失在功能效应上存在显著
差异[11]。本研究在此基础上, 采用杂交方法创制了不携带
任何 Glu-1 位点的材料 DLGlu1。理论上可以通过杂交或
者转基因方法将任何 Glu-1 位点或 HMW-GS 亚基编码基
因导入到 DLGlu1背景进行相关基因的功能研究。
为进一步检验 DLGlu1 作为材料载体用于 HMW-GS
功能研究的潜力和创制不同 HMW-GS 渗入系的效率 ,
2014年我们以超强筋小麦Glenlea为父本, DLGlu1为轮回
亲本开展了回交转育工作 , 对每个世代的杂交材料均进
第 8期 张星星等: 利用 HMW-GS全缺失突变体快速构建 Glu-1位点近等渗入系 1251
行分子标记辅助选择, 大大减少了工作量。所有杂交种均
以幼胚培养获得下一代材料, 两年时间即得到 BC3F3 材
料。从这些材料中检测到携带 Glenlea 的 Glu-A1b、
Glu-B1al、Glu-D1d、Glu-A1b+Glu-B1al、Glu-A1b+Glu-
D1d、 Glu-B1al+Glu-D1d、 Glu-A1b+Glu-B1al+Glu-D1d
共 7 种基因型, 即获得了一整套以小偃 81 为遗传背景、
携带Glenlea的Glu-1不同亚基组合的渗入系(图 2和图 3)。
利用这些材料可以对 2*、7OE+8和 5+10功能展开研究, 也
可对 HMW-GS 全部或者部分缺失在培育低筋小麦的应用
前景上展开研究。
通过计算Glenlea×DLGlu1的BC3F3材料分离比(表 2),
发现Glu-1的遗传行为遵从孟德尔基因独立分配和自由组
合规律。SDS-PAGE 分析发现 Glenlea 的 Glu-1 编码的 x-
型和 y-型亚基作为一个孟德尔单位共遗传(图 3)。有意思
的是, 发现携带 Glenlea 的 Glu-A1b+Glu-B1al 材料中 2*
亚基表达量略高于 7OE (图 3), 推测这是由于该材料在
Glu-A1位点纯合, Glu-B1位点杂合造成的剂量效应。李保
云等[29]曾报道, 采用 SDS-PAGE 方法发现在正交和反交
杂种 F1中 HMW-GS表达双亲所有的全部亚基, 但表达量
不同, 母本谱带的表达量多, 父本谱带的表达量少。这种
现象与小麦的双受精和三倍体胚乳形成时来源于母本和
父本的遗传物质比例不同(母本占 2/3, 父本占 1/3)所造成
的基因剂量效应有关[29]。本研究中携带 Glu-1位点的材料
作父本, 如果 Glu-A1b 纯合, 而 Glu-B1al 杂合, 则 7OE的
理论表达量为 2*的 1/3, 这可能是 SDS-PAGE 凝胶中 7OE
的谱带略浅于 2*的原因之一。
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