全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(5): 641647 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由江苏高校优势学科建设工程资助项目 , 农业部农作物保护项目(2015NWB006), 江苏省自然科学基金面上项目(BK2012579,
BK20141146)和江苏省高校自然科学研究重大项目(12KJA180001)资助。
This study was supported by the Project Funded by the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions, the
Project on Crop Conservation Funded by the Ministry of Agriculture of China (2015NWB006), the General Projects Funded by Natural Sci-
ence Foundation of Jiangsu Province (BK2012579, BK20141146), and the Major Project Funded by Natural Science Foundation of Jiangsu
Higher Education Institutions (12KJA180001).
* 通讯作者(Corresponding authors): 罗永海, E-mail: yhluo@jsnu.edu.cn; 李宗芸, E-mail: zongyunli@jsnu.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: shixuanluck@163.com
Received(收稿日期): 2015-10-19; Accepted(接受日期): 2016-01-11; Published online(网络出版日期): 2016-02-18.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160218.1503.006.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.00641
利用简化基因组技术分析甘薯种间单核苷酸多态性
石 璇 1 王茹媛 1 唐 君 2 李宗芸 1,* 罗永海 1,*
1江苏师范大学生命科学学院, 江苏徐州 221116; 2中国农科院甘薯研究所 / 国家甘薯改良中心, 江苏徐州 221121
摘 要: 选用Xushu 18 (6x)和Nancy Hall (6x)、2个二倍体 I. trifida (2x)品系(4597-10和 4597-21)、四倍体 I. trifida (4x)、
六倍体 I. trifida (6x)、二倍体 I. temussima (2x)和 I. littorallis (2x)以简化基因组测序技术 SLAF-seq测序, 获得 724 589
个 SLAF标签, 其中多态性 SLAF标签 35 310个。通过序列分析, 获得 40 765个有效单核苷酸多态(SNP), 并用这些
SNP分析了 8个种质的群体结构和系统发生树。结果表明, 利用简化基因组测序技术 SLAF-seq能高效、低成本地开
发出大量可用于群体遗传分析的 SNP标记; 通过构建进化树发现甘薯栽培种和野生种 I. trifida的亲缘关系比较近。
这些分析结果为进一步研究甘薯栽培种的起源提供了基础数据。
关键词: 甘薯; SLAF-seq; 分子标记; SNP; 进化分析
Analysis of Interspecific SNPs in Sweetpotato Using a Reduced-Representation
Genotyping Technology
SHI Xuan1, WANG Ru-Yuan1, TANG Jun2, LI Zong-Yun1,*, and LUO Yong-Hai1,*
1 School of Life Science, Jiangsu Normal University, Xuzhou 221116, China; 2 Sweetpotato Research Institute, Chinese Academy of Agricultural
Sciences / National Sweetpotato Improvement Centre, Xuzhou 221121, China
Abstract: Xushu 18 (6x), Nancy Hall (6x), I. trifida (2x) 4597-10, I. trifida (2x) 4597-21, I. trifida (4x), I. trifida (6x), I. temus-
sima (2x), and I. littorallis (2x) were used as experimental materials for sequencing by specific-locus amplified fragment se-
quencing (SLAF-seq), a high-throughput reduced-representation genotyping technology. In total, 724 589 SLAF tags were ob-
tained and 40 765 SNPs were identified out of 35 310 polymorphic SLAF tags. A total of 40 765 single nucleotide polymorphisms
(SNPs) were obtained by sequence analysis. Population structure and phylogenetic relationship of eight germplasm were analyzed
using the SNP dataset, which suggests that SLAF-seq can be used to develop large-scale SNPs for population genetic analysis,
effectively and economically. Our analysis revealed that the relationship between sweet potato cultivars and the wild species I.
trifida is closer. These results provide empirical data for further study of the origin of sweet potato.
Keywords: Sweetpotato; SLAF-seq; Molecular marker; SNP; Phylogenetic analysis
甘薯[Ipomoea batatas (L.) Lam]又称甜薯、地
瓜、白薯、红薯, 旋花科甘薯属草本植物, 是世界范
围内最重要的经济作物之一[1]。甘薯是六倍体作物
(2n = 6x = 90), 由于形态相似程度高、进化过程中发
生难以追踪的杂交以及表型可塑性等问题, 很难仅
仅根据甘薯及其近缘物种的形态学特征来构建其系
统发生树[2-3]。时至今日, 甘薯的起源和驯化历史仍
不明确。现有的研究表明, 甘薯有可能起源于异源多
倍体, 其祖先种可能是 I. leucantha、I. triloba 和 I.
trifida[4]; 但是更多的研究提示甘薯可能起源于同源多
642 作 物 学 报 第 42卷


倍体, 推测由二倍体 I. trifida染色体加倍而成[2,3,5-8]。
尽管如此, 现有数据并不足以确定甘薯的起源关系,
特别是缺少高质量的 I. trifida和 I. batatas的核基因
组序列和叶绿体基因组序列, 不能通过比较基因组
学分析证明二倍体的 I. trifida 是否是六倍体的甘薯
栽培种 I. batatas的祖先。
随着现代生物技术的发展, 分子标记越来越广
泛地被用于确定物种间的亲缘关系。早期人们利用
RAPD、RFLP、AFLP、ISSR 等分子标记技术来构
建甘薯遗传图谱, 但由于准确性差、工作量大、可
重复性差、成本高等问题[2,9-12], 都无法开发出高通
量的分子标记。随着测序技术的发展以及因此带来
的测序成本降低, 高通量测序技术越来越多地被应
用于分析复杂物种间的亲缘关系。在过去几十年 ,
基因组学蓬勃发展, 众多高等植物的基因组如拟南
芥、水稻、苜蓿草、大豆、小麦等均已经完成了测
序, 但是甘薯基因组的测序仍未成功。甘薯基因组
构成复杂, 异质性高, 缺乏高解析度的遗传图谱。即
便在今天的技术条件下, 要克服这些障碍、对甘薯
进行全基因组测序和组装依然困难重重。此外, 甘
薯是一种异花授粉的作物, 一般情况下不仅品种内
自交不亲和, 同一种群内品种间也存在自交不亲和
现象。这些情况严重限制了甘薯遗传学、基因组学
和育种学的研究, 提示研究人员应该从研究方法或
技术手段上多些创新和尝试。
简化基因组测序是在高通量测序技术(主要是
二代测序技术)基础上发展起来的 , 它利用酶切技
术、芯片捕获技术或其他实验手段降低物种基因组
复杂程度, 进而研究基因组代表性遗传变异的技术
手段[13-14]。SLAF-seq (specific-locus amplified frag-
ment sequencing)是特异性位点扩增片段测序技术的
简称, 是基于高通量测序技术发展起来的一种简化
基因组深度测序技术。简要地说, SLAF-seq 先利用
生物信息学方法, 对目标物种的参考基因组(例如目
标物种已知的 BAC 序列或近缘物种的基因组)系统
分析; 再根据参考基因组的 GC含量、重复序列情况
和基因特点等信息, 设计酶切方案, 构建 SLAF-seq
文库, 筛选特异性长度片段, 应用高通量测序技术
获得高通量标签序列; 然后对数据分析, 获取测序
深度和质量均满足要求的 SLAF 片段; 这些片段可
以充分代表全基因组的序列特征信息, 依据这些片
段可以开发出大量的分子标记特别是单核苷酸多态
(SNP)。该技术可以且已经运用于大规模种质资源研
究、高密度遗传连锁图谱构建、不同个体间的多态
性分析和目标性状相关的基因组区段或候选功能基
因快速定位。它具有高准确性、高通量、低成本、
获得的分子标记能作为序列信息直接进行后续工作、
能缩短试验周期、可以多性状并行研究等优点[15-17]。
本文尝试将 SLAF-seq 技术应用于甘薯生物学的研
究, 测定8个甘薯栽培种及其近缘物种基因序列, 拟
揭示品种间亲缘关系, 有效提高在复杂农作物中开
发大规模分子标记、研究其物种起源与进化关系的
能力。
1 材料与方法
1.1 试验材料
选用8个甘薯或其近缘物种 , 分别是六倍体栽
培种 Xushu 18 (6x)和 Nancy Hall (6x)、2个二倍体 I.
trifida (2x)品系(4597-10和4597-21)、四倍体 I. trifida
(4x)、六倍体 I. trifida (6x)、二倍体 I. temussima (2x)
和 I. littorallis (2x)(基本信息列于表1)。
1.2 基因组 DNA制备
用液氮速冻新鲜叶片, 存于–80℃冰箱备用, 用
C TA B 法分别提取8个样品的基因组 D N A , 用
Nanodrop 2000C和 Qubit 2.0进行 DNA的质量检测,
以确保所提基因组 DNA 质量达到建库要求 (即

表 1 本研究所用的 8种甘薯或其近缘品种
Table 1 Eight germplasms of sweetpotato and its relatives in this study
物种名称 Species 材料类型 Material type 基因组倍性 Genomic ploidy
Xushu 18 (6x) 栽培种 Cultivar 6x
Nancy Hall (6x) 栽培种 Cultivar 6x
I. trifida (2x) 4597-10 野生种 Wild relative 2x
I. trifida (2x) 4597-21 野生种 Wild relative 2x
I. trifida (4x) 野生种 Wild relative 4x
I. temussima (2x) 野生种 Wild relative 2x
I. littorallis (2x) 野生种 Wild relative 2x
I. trifida (6x) 野生种 Wild relative 6x

第 5期 石 璇等: 利用简化基因组技术分析甘薯种间单核苷酸多态性 643


OD260 与 OD280 的比值分布在 1.8~2.0 之间; DNA
浓度达到 30 ng μL–1)。
1.3 酶切方案的设计
由于没有合适的甘薯或其近缘物种参考基因组
可用, 我们选择马铃薯基因组为参考基因组进行电
子酶切预测。马铃薯基因组大小约为 651 Mb, GC含
量为 34.80%[18]。利用 SLAF酶切预测软件对参考基
因组进行酶切预测, 选择最合适的酶切方案, 其原
则如下: (1)位于重复序列的酶切片段比例尽可能低;
(2)酶切片段在基因组上尽量均匀分布; (3)酶切片段
长度与具体实验体系的吻合程度较高[17]; (4)最终获
得酶切片段(SLAF标签)数达到预期标签数。同时,
通过设置对照基因组(拟南芥)进行同样流程的测序、
评估对照基因组的测序数据, 进而验证实验过程是
否正常, 确定所用酶切方案的有效性。
1.4 测序、SLAF标签分析、SNP鉴定
根据选定的最适酶切方案 , 对各样品基因组
DNA 分别进行酶切, 分离目标酶切片段, 对其进行
3端加 A 处理、连接测序接头、PCR 扩增、纯化、
混样、纯化等试验操作, 文库质检合格后用 Illumina
HiSeq 2500进行双端测序(PE100)。对测序得到的原
始数据进行识别、过滤、质检、评估等分析, 获取
各个样品的序列(reads)。
测序产生的序列(reads)来源于同一限制性内切
酶对不同样品作用产生的长度相同或相近的酶切片
段 , 根据相似性可以将各样品的序列(reads)聚类 ,
聚到一起的序列(reads)被认为来源于同一个 SLAF
酶切片段, 称为一个序列组(SLAF标签)。一般来说,
同一 SLAF 标签在不同样品间的序列相似度远高于
不同 SLAF标签间的相似度; 同一个 SLAF标签在不
同样品间序列有差异, 即可定义为多态性 SLAF 标
签。通过分析多态性 SLAF标签, 鉴定其中存在的单
核苷酸多态性(SNP), 利用这些 SNP分析群体。
1.5 群体遗传分析和亲缘关系分析
对鉴定到的 SNP 分子标记过滤, 选择次要基因
型频率(MAF)大于 0.05和完整度大于 0.8的 SNP进
行群体差异性分析。使用 Admixture 软件[19]分析群
体结构, Cluster[20]软件分析主元成分, MEGA5[21]软
件、Neighbor-Joining[22]分析进化关系。
2 结果与分析
2.1 简化基因组序列的产出和质量评估
利用 SLAF 酶切预测软件分析, 最终确定使用
Rsa I酶切, 酶切片段长度在 264~314 bp的片段定义
为目标酶切片段, 预测能得到 107 700 个 SLAF 标
签。试验中, 从对照基因组(拟南芥)获得了 1.79百万
序列(MReads)。通过序列分析可知, Rsa I的酶切效
率为 93.50%, 双端比对效率(一条序列两端在对照
基因组上的比对跨度介于 50~1000 bp 的 reads占总
reads 的比例)为 85.15%。这些数据显示我们选定的
酶切方案和试验结果均达到试验预期。从 8 个甘薯
栽培种及其近缘物种共获得 18.66 百万序列
(MReads), 平均 Q30 (测序碱基质量值, 即测序时错
误识别的概率是 0.1%、正确率为 99.9%的碱基比例)
为 90.74%, 平均 GC含量为 38.69% (表 2)。所测序列
的 GC 含量处于较低水平, 对本试验测序反应的影响
不大; Q30数据表明测序质量很高, 测序结果可靠。
2.2 SLAF标签和 SNP分子标记的鉴定
通过序列分析 , 从8个甘薯甘薯栽培种及其近
缘物种共获得了724 589个 SLAF标签, 每个样品获
得的 SLAF标签数从123 205至292 800不等(表3)。每
个样品的平均测序深度 (即各个样品中平均每个
SLAF标签上对应的测序 reads数)有所差别, 从6.62
至17.03, 平均测序深度为11.46, 达到了 SLAF 试验

表 2 SLAF-seq基因组测序数据统计表
Table 2 Summary of genomic sequences generated by SLAF-seq
物种名 Species 测序片段数 Reads number 测序质量 Q30 (%) GC含量 GC (%)
Xushu 18 (6x) 2 614 884 90.44 38.16
Nancy Hall (6x) 1 963 571 91.18 38.90
I. trifida (2x) 4597-10 2 727 805 89.98 38.83
I. trifida (2x) 4597-21 2 815 762 91.24 38.48
I. trifida (4x) 1 836 361 91.21 38.22
I. temussima (2x) 2 058 021 92.56 38.09
I. littorallis (2x) 2 309 477 91.77 40.74
I. trifida (6x) 2 336 775 87.57 38.07
Arabidopsis 1 789 696 84.40 41.66

644 作 物 学 报 第 42卷


预期(一般认为, 测序深度达到 5即可提供较可靠的、
高通量的分子标记, 可用于研究物种的亲缘关系)。
从这些 SLAF 标签中共鉴定到多态性 SLAF 标
签 35 310个。通过分析, 鉴定到 89 375个 SNP (表
4): 每个样品的 SNP数目从 7 096至 14 860不等。
这些 SNP 的平均完整度(即 SNP 所在位点在全部样
品中的信息完整度)介于 17.41%~36.45%之间。根据
次要基因型频率(MAF)大于 5%和完整度大于 80%的
选择标准, 从这些 SNP中筛选出 40 765个有效 SNP,
用于群体遗传分析。

表 3 SLAF标签统计表
Table 3 Summary of obtained SLAF tags
物种 Species SLAF标签数 SLAF number 测序总深度 Total depth 测序平均深度 Average depth
Xushu 18 (6x) 207 413 2 217 415 10.69
Nancy Hall (6x) 195 376 1 583 451 8.10
I. trifida (2x) 4597-10 210 744 2 412 087 11.45
I. trifida (2x) 4597-21 147 347 2 509 724 17.03
I. trifida (4x) 168 772 1 572 073 9.31
I. temussima (2x) 123 205 1 789 636 14.53
I. littorallis (2x) 144 218 2 013 863 13.96
I. trifida (6x) 292 800 1 939 688 6.62

表 4 群体 SNP统计表
Table 4 Summary of identified SNPs
物种 Species SNP数 SNP number SNP完整度 Integrity (%) SNP杂合率 Heter ratio (%)
Xushu 18 (6x) 14 706 36.08 94.04
Nancy Hall (6x) 14 093 34.57 92.89
I. trifida (2x) 4597-10 8 136 19.96 72.66
I. trifida (2x) 4597-21 8 118 19.91 76.08
I. trifida (4x) 13 461 33.02 92.99
I. temussima (2x) 7 096 17.41 7.61
I. littorallis (2x) 8 905 21.84 15.05
I. trifida (6x) 14 860 36.45 93.98

此外, 分析所鉴定到的 SNP 可以看到, 不同样
品的 SNP 杂合率存在较大差异, 多数样品具有较高
的杂合率。其中六倍体栽培种 Xushu 18 (6x)和 Nancy
Hall (6x)、野生种四倍体 I. trifida (4x)、六倍体 I.
trifida (6x)的 SNP杂合率都超过了 92% (表 4), 表明
它们的基因组高度杂合。相反地, 野生种 I. temussima
(2x)和 I. littorallis (2x)的 SNP杂合率分别只有 7.61%
和 15.05%, 表明其基因组的纯合度很高(表 4)。
2.3 群体遗传分析
基于筛选出的有效 SNP, 采用 Admixture 软件
计算了 8个甘薯栽培种及其近缘物种的群体结构(图
1)。根据交叉验证错误率来确定分群数, 拥有最低交
叉验证错误率的分群数为最优分群数。从图 1可见,
当 K 为 8 时值最低, 这反映了 8 个甘薯栽培种及其
近缘物种的遗传结构并不明显。
利用这些 SNP 信息, 绘制 8 个甘薯栽培种及其
近缘物种的进化树(图 2)。从进化树可见, 2个六倍体
栽培种 Xushu 18 (6x)和 Nancy Hall (6x)的亲缘关系
最近; 二倍体 I. trifida (2x)的 2个品系在进化树上相
邻, 显示它们更高的亲缘关系。值得关注的是, 2个
六倍体栽培种与四倍体 I. trifida (4x)和六倍体 I.
trifida (6x)比二倍体 I. trifida (2x)的亲缘关系近。此
外, 可看出, I. temussima (2x)和 I. littorallis (2x)与甘
薯栽培种的亲缘关系较远。
3 讨论
3.1 传统分子标记技术的局限性
分子标记技术是生物学研究不可或缺的技术手
段。尽管我们已经步入后基因组时代, 在很多物种
中, 分子标记依然十分有限。甘薯栽培种染色体数
目多(2n = 6x = 90), 遗传背景复杂, 严重影响甘薯
分子生物学和分子育种的研究 [19]。早期人们利用
RFLP 来研究甘薯及其近缘野生种的亲缘关系, 但
是花费较高, 工作量较大, 效率相对较低。也有研究
第 5期 石 璇等: 利用简化基因组技术分析甘薯种间单核苷酸多态性 645



图 1 基于所鉴定 SNP分析群体结构
Fig. 1 Analysis of population structure by using identified SNPs
A: 不同分群数(K值)的聚类结果显示无明显群体结构存在; B: 不同 K值对应的交叉验证错误率显示 k为 8的时候交叉验证错误率最小。
A: cluster results of different structuring number (K-values) show no obvious population structure; B: cross validation error rates
corresponding to different K-values show k = 8 is the best.

图 2 基于所鉴定 SNP的进化树
Fig. 2 Phylogenetic tree based on identified SNPs

者使用 RAPD技术来研究种质资源间的遗传多样性,
但其结果的准确性及可重复性的问题很难解决[2]。
近年来, Jarret等[3,9]和贺学勤等[10]综合运用 RAPD、
AFLP和 ISSR等分子标记分析并明确了一些甘薯品
种的亲缘关系, 发现 ISSR标记产生的聚类图与系谱
图最吻合, 因而认为用 ISSR标记分析甘薯品种的亲
缘关系具有较高的效率和准确度。但是, ISSR 标记
存在一些局限性, 限制了其进一步的发展与应用。
这些局限性包括 , 需要一定的时间来摸索反应条
件、筛选标记; 系显性遗传标记, 不能区分显性纯合
基因型和杂合基因型; 通量小、精确性较低、耗时
耗力、成本高等[11-12]。尽管人们已经利用这些传统
的分子标记技术研究了甘薯的亲缘关系、构建了一
些甘薯及其亲缘物种的遗传图谱[23-29], 但是利用高
通量测序技术开发全基因组范围内的分子标记并用
于亲缘关系分析的报道仍然缺少。本文尝试应用简
化基因组技术之一的 SLAF-seq 在甘薯及其近缘物
种间开发大规模 SNP, 并取得了成功。
3.2 简化基因组技术在复杂农作物分子标记开
发上的可行性及优势
简化基因组测序对没有参考基因组的物种特别
适用, 能有效克服基因组复杂、序列与标记信息缺
乏等问题, 进而大规模的开发和分析 SNP 标记。目
前主要发展起来的简化基因组测序技术有, 限制性
酶切位点相关的 DNA(RAD)测序、基因分型测序
(GBS)、基于 II B型限制性内切酶位点相关的 DNA
646 作 物 学 报 第 42卷


(2b-RAD) 测 序 和 特 异 性 长 度 扩 增 片 段 测 序
(SLAF-seq)技术。这些技术都是通过限制性内切酶
来降低基因组 DNA 的复杂程度[30]。由于酶切产生
的标记是全基因组范围内呈现特异性酶切位点附近
的小片段 DNA, 它们一定程度上代表了整个基因组
的序列特征, 因此对酶切标签进行二代测序能够在
大多数物种中获得成千上万的单核苷酸多态性(SNP)
标记。本研究运用 SLAF-seq技术, 在 8个甘薯栽培
种或其近缘物种中共获得 18.66 百万序列(MReads),
开发了 724 589 个 SLAF 标签(其中多态性 SLAF 标
签 35 310个), 从中鉴定到 89 375个 SNP, 进一步分
析筛选出 40 765个有效 SNP并利用这些分子标记分
析了相应种质的杂合率和群体结构, 构建了它们的
系统发生树, 从而为甘薯栽培种的起源提供了新的
证据。我们的研究表明, 利用简化基因组测序技术
SLAF-seq能高效、低成本地开发出大量可用于群体
遗传分析的 SNP 标记(表 4)。这为下一步利用该技
术在更大范围内分析甘薯栽培种及其近缘种的亲缘
关系, 为阐明甘薯栽培种的起源历程创造了可能性,
同时也为开发分子标记用于基因定位(例如, 全基因
组关联分析)和分子育种奠定了基础。
3.3 甘薯栽培种起源的探讨
针对甘薯的起源目前主要有 3 种假说[31]。第一
种假说认为甘薯起源于二倍体的 I. leucantha, 然后
通过染色体多倍化派生出四倍体的 I. littoralis[32],
这 2个物种再杂交产生三倍体的 I. trifida, 进而染色
体加倍产生六倍体的野生甘薯, 对这些野生甘薯进
一步的筛选和驯化即产生了六倍体的 I. batatas。第
二种假说认为甘薯的野生祖先是 I. batatas, 它是由
I. trifida和 I. triloba杂交产生的六倍体[33]。第三种
假说认为 I. trifida 的同源多倍体是甘薯的祖先, 有
可能是其产生的 2n 配子参与了一系列的染色体多
倍体化[33]。此外, Roullier 等[12]、Caroline 等[34]、
Otto[35]、Zohary[36]和 Allaby等[37]通过分析 ITS序列
和 SSR分子标记, 推测栽培种甘薯是从 I. trifida进
化而来的同源六倍体。他们发现, I. triloba与甘薯栽
培种的亲缘关系比 I. trifada 更远, 无法得出其与甘
薯存在明显的亲缘关系, 也就无法确切地证明甘薯
是来源于 I. trifida和 I. triloba的异源六倍体[35]。从我
们的数据可以看出, 甘薯栽培种和野生种 I. trifida的
亲缘关系比较近, 而且, 2个六倍体甘薯栽培种与四
倍体 I. trifida (4x)和六倍体 I. trifida (6x)的比二倍体 I.
trifida (2x)的亲缘关系更近(图 2)。这个数据与之前甘
薯栽培种可能起源于 I. trifida同源多倍化的假设相一
致, 提示了 I. trifida (2x)可能先多倍化形成 I. trifida
(4x), 之后进一步形成 I. trifida (6x), 再经自然选择或
者人工驯化形成甘薯栽培种[11,23,31,34]。当然, 该假说
需要进一步的基于比较基因组学、群体遗传学的分
析以便获得无可辩驳的证据。
4 结论
通过简化基因组测序技术 SLAF-seq 在甘薯栽
培种及其近缘野生种中成功开发了高通量 SNPs, 并
将其用于亲缘关系的分析, 为进一步研究甘薯的起
源提供了基础数据。
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