全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(3): 471−478 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家现代农业产业技术体系建设项目(CARS-15-1-05)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 刘红彦, E-mail: liuhy1219@163.com, Tel: 0371-65730166
第一作者联系方式: E-mail: llmyykl@163.com
Received(收稿日期): 2011-09-19; Accepted(接受日期): 2011-12-15; Published online(网络出版日期): 2012-01-04.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120104.1648.002.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.00471
茎点枯病菌诱导下芝麻内参基因的筛选
刘莉铭 1,2,3 刘红彦 1,2,3,* 田保明 1
1 郑州大学生物工程系, 河南郑州 450001; 2 河南省农业科学院植物保护研究所, 河南郑州 450002; 3 河南省农作物病虫害防治重点
实验室, 河南郑州 450002
摘 要: 用 CodeHop方法设计简并引物并克隆得到了 GAPDH、β-actin、α-tubulin、UBQ5、RPL4、eIF4A和 eEF1α 7
个看家基因的部分序列, 将这 7个基因和 GenBank中已公布的 18S rRNA、NADHD 2个基因共 9个基因作为候选内
参基因, 利用实时荧光定量 PCR技术, 分析其在茎点枯病菌诱导下芝麻中的表达稳定性。经 BestKeeper、NormFinder
和 GeNorm软件分析可知, UBQ5、eIF4A、α-tubulin 3个基因表达均较稳定, eEF1α变化最大。当使用多基因作为内
参基因时, 选择这 3个最稳定的候选内参基因即可准确矫正定量结果。
关键词: 芝麻; 茎点枯病菌; qRT-PCR; 内参基因
Selection of Reference Genes from Sesame Infected by Macrophomina phaseo-
lina
LIU Li-Ming1,2,3, LIU Hong-Yan1,2,3,∗, and TIAN Bao-Ming1
1 Bioengineering Department, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China; 2 Institute of Plant Protection, Henan Academy of Agricultural
Sciences, Zhengzhou 450002, China; 3 Henan Key Laboratory for Control of Crop Diseases and Insect Pests, Zhengzhou 450002, China
Abstract: Stem rot caused by Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid. is the most important disease in sesame, worldwide, the
use of sesame cultivars resistant to stem rot provides an effective, economical, and environmentally friendly method to control the
disease. The study on sesame defense response plays important roles in breeding resistant cultivars, and qRT-PCR was an impor-
tant method in studying plant defense response. In order to select the proper reference genes which can normalize expression of
the target gene in sesame induced by Macrophomina phaseolina, nine genes 18S rRNA, NADHD, GAPDH, β-actin, α-tubulin,
UBQ5, RPL4, eIF4A, and eEF1α, was analyzed by qRT-PCR. Among the nine genes, last seven were designed using CodeHop.
BestKeeper, NormFinder and GeNorm analyses showed that UBQ5, eIF4A and α-tubulin were the top three optimum choices
while eEF1α varied greatly. The analysis revealed that the three most stable genes UBQ5, eIF4A, α-tubulin were enough to obtain
an accurate result when using multiple genes as control.
Keywords: Sesame; Macrophomina phaseolina; qRT-PCR; Reference gene
PCR技术自 1983年问世以来, 已多方面取得很
大的改进, 其中实时荧光定量 PCR (real-time fluo-
rescence quantitative PCR, qRT-PCR)实现了 PCR技
术由定性到定量的飞跃。发展至今, 这项技术因其
具有高灵敏性、高效性、准确性和重复性好等特点
已成为分子生物学领域基因表达分析的重要方法之
一。另外, 它在基因拷贝数鉴定、疾病标志基因的
检测、食品中病原微生物的检测等方面也具有广泛
的应用[1]。
qRT-PCR对操作过程中待测样品的准备具有严
格的要求, 尤其是各样品间的均一化处理, 如 RNA
提取的产量和质量、反转录效率等, 由于很难满足
这一要求, 很容易对数据的准确性产生影响, 这就
需要在体系中引入内参基因对数据校正和标准化处
理 [2]。常用的内参基因一般都是看家基因 , 如
GAPDH、actin、tubulin、18S rRNA等, 这些基因是
维持细胞正常生命代谢所必需的, 一般情况下表达
都比较稳定。孙美莲等[3]研究了 4个内参基因在茶
472 作 物 学 报 第 38卷

树中的表达情况, 发现 GAPDH 在不同成熟度的叶
片、愈伤组织中表达最稳定, 而 Barsalobres 等[4]对
咖啡进行研究时发现 GAPDH 在不同器官组织中表
达最稳定。Jain 等[5]、Luo 等[6]和 Maroufi 等[7]分别
对水稻、荷花、菊苣研究, 发现 eEF1α 在不同组织
中表达较稳定, 而李钱峰等 [8]在对籼粳稻研究时发
现 eEF1α在不同品种间表达较稳定, Nicot等[9]通过
研究马铃薯, 发现在 3 种实验条件下 eEF1α 的表达
均较稳定。由上述可知, 目前所使用的内参基因都
是在一定条件下表达相对稳定的基因, 所以在研究
不同的实验材料和不同的实验条件下目标基因的表
达时有必要对内参基因重新筛选[10]。
芝麻是重要的油料作物之一, 并且含多种维生
素和矿物质, 具有较高的营养价值, 但在田间生长
过程中很容易受到多种病原菌的危害, 其中菜豆壳
球孢[Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid.]引起的
茎点枯病是芝麻主要病害之一, 它严重影响芝麻的
产量和品质, 目前集高产、优质和抗病于一身的芝
麻良种还很少, 所以加强抗病机制的相关研究, 克
隆抗病基因, 对于推动抗病育种工作具有重要的意
义[11]。目前, 在芝麻抗病相关基因的表达分析方面,
尚无相关的内参基因报道及利用。本研究选取 18S
rRNA、NADHD、GAPDH、β-actin、α-tubulin、UBQ5、
RPL4、eIF4A和 eEF1α共 9个看家基因作为候选内
参基因, 利用 qRT-PCR技术对其在茎点枯病菌侵染
过程中的表达定量, 利用 BestKeeper、NormFinder
和 GeNorm 软件分析它们表达的稳定性, 以期为抗
病相关基因的相关研究提供合适的内参基因。
1 材料与方法
1.1 材料及预备试验
芝麻茎点枯病菌菌株 09-54 由本实验室分离,
芝麻品种冀 9014、豫芝 11及和尚头均由河南省农业
科学院芝麻研究中心提供。
将菌株接种于 100 mL 液体马铃薯葡萄糖培养
基中, 在转速为 200 转 min−1的摇床中 28℃振荡培
养 48 h, 用组织捣碎机处理培养物, 经 50倍稀释后
得到菌丝悬液。采用菌丝悬液灌根侵染幼苗, 该接
种方法能够保证每个单株充分发病, 并且发病重复
性较好, 在接菌 24 h左右茎基部开始出现褐色病斑,
48 h病斑扩展至茎秆的 2/3处(发病级别为 3级)。在
预备试验中选用冀 9014、豫芝 11 及和尚头作为试
验材料, 接菌试验表明 3个品种感病症状无显著差
异, 所以选择农艺性状较好的感病品种冀 9014作为
再次试验的材料。
将供试芝麻品种冀 9014种植于蛭石中, 待其长
至二叶一心期时用 1 mL菌丝悬液灌根处理, 分别采
集接菌后 0、8、16、24、36、48、60 和 72 h 的植
株, 每个时间点随机采样 3 株作为一个处理, 以未
接菌植株为同期对照 , 液氮速冻后保存于–70℃
备用。
1.2 总 RNA的提取及反转录
参照 RNAiso Plus (TaKaRa)试剂说明书提取总
RNA, 用 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA 的完整
性 , 用核酸分析仪检测其浓度和纯度。参照
Invitrogen 反转录试剂盒说明书, 以 500 ng 总 RNA
为模板, 分别用随机六聚体引物和 Oligo dT引物合
成 cDNA 第一链。用 NADH 脱氢酶(NADHD)定量
引物(表 1)检测获得的 cDNA产物, –20℃保存备用。
1.3 内参基因及引物设计
选用 18S rRNA、NADHD、GAPDH、β-actin、
α-tubulin、UBQ5、RPL4、eIF4A和 eEF1α, 其中 18S
rRNA 和 NADHD 根据 GenBank 已登录的相关序列,
用 Primer 5.0软件设计定量分析引物(表 1)。其他 7
个基因采用 CodeHop 方法设计简并引物(表 2), 以
Oligo dT引物反转录得到的 cDNA为模板克隆基因,
然后再根据测序结果设计定量分析引物, 委托上海
生工生物工程技术服务有限公司测序和合成引物。
1.4 实时荧光定量 PCR
实时荧光定量 PCR 在 Mastercycler ep realplex
定量 PCR 仪上进行。qRT-PCR 反应总体系包括
2×SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa) 10 μL, 10 μmol


表 1 芝麻候选内参基因 18S rRNA和 NADHD引物序列
Table 1 Primer sequences of the candidate reference genes 18S rRNA and NADHD in sesame
基因
Gene symbol
GenBank登录号
GenBank accession No.
引物序列
Primer sequence (5′→3′)
扩增长度
Amplication length (bp)
18S rRNA AJ236041.1 F: CTCAACCATAAACGATGCCGACC R: TCAGCCTTGCGACCATACTCCC 116
NADHD L36413.1 F: GGGGTAAGGGGTGTTCAA R: ACATTCTCATCACTTCGGTAT 112
第 3期 刘莉铭等: 茎点枯病菌诱导下芝麻内参基因的筛选 473


表 2 芝麻候选内参基因的简并引物序列
Table 2 Degenerate primer sequences of the candidate reference genes in sesame
引物名称
Primer name
引物序列
Primer sequence (5′→3′)
简并度
Degeneracy
预期扩增长度
Expected amplication length (bp)
GAPDH-F TGTTCGTGGTGGGCGTNAAYGARAA 16
GAPDH-R GGACACCACGTCGTCCTCNGTRTANCC 32
461
β-actin-F GGAGAAGATGACCCAGATCATGTTYGARACNTT 16
β-actin-R CCTTGGCGATCCACATCTGNTGRAANGT 32
731
α-tubulin-F CGGGCCGTGTTCATGGAYYTNGARCC 32
α-tubulin-R AAGTTGGTGGGGCACCANTCNRYRAA 128
863
UBQ5-F GGAGGTGGAGTCCTCCGAYACNATHGA 24
UBQ5-R TGGTACACGTAGGTCAGGCCRCAYTTNCC 16
408
RPL4-F CAGCCCGGGCCGTNGTNCAYMG 64
RPL4-R GGCGGCGATGAAGTCCYKNGTYTTNGG 128
336
eIF4A-F TCGAGAAGCCCTCCGCNATHCARCA 24
eIF4A-R CAGGGACACCTGCTGCACRTCDATNCC 24
870
eEF1α-F CGGGTGATCGAGCGGTTYGARAARGA 8
eEF1α-R CCACGGCCACGGTCTGNCKCATRTC 16
1152

L–1上、下游引物各 0.4 μL, cDNA模板(相当于 2.5 ng
RNA) 6 μL, 用 ddH2O补齐 20 μL。反应程序为 95℃
预变性 2 min, 95℃变性 30 s, 57℃退火 30 s, 72℃延
伸 30 s并收集荧光, 40个循环, 57~95℃生成熔解曲
线。每个样品 3次重复。利用 qRT-PCR检测定量分
析引物, 熔解曲线为单峰时用于后续分析。
1.5 标准曲线的绘制及基因扩增效率
以 cDNA第一链作为模板, 依次稀释 5个梯度,
每个梯度稀释 5 倍, 即 cDNA 初始模板浓度分别为
50 (反转录产物 6倍稀释液)、5–1、5–2、5–3、5–4。根
据荧光定量 PCR 结果, 以 cDNA 初始模板的 log 值
为横坐标, 以测得的Ct值为纵坐标, 绘制标准曲线。
利用公式 E=(10–1/slope–1)×100计算基因的扩增效率。
1.6 数据分析
根据 qRT-PCR 定量分析结果, 利用 GeNorm、
BestKeeper和 NormFinder软件对各候选内参基因在
病程中的表达稳定性进行统计学分析, 从而筛选出
最优的内参基因。
2 结果与分析
2.1 简并引物的扩增与序列分析
利用表 2 中的简并引物对 7 个候选内参基因进
行扩增, 从图 1 可以看出每对引物均能扩增出清晰
的特异性条带, 测序结果显示各基因片段的长度分
别是 461、731、863、408、344、872和 1 180 bp, 与
预期的长度基本一致。利用 NCBI 数据库对测序结
果进行 Blastx 同源性搜索(表 3), 由比对结果可知,
克隆得到的基因片段所编码的氨基酸序列与相应已
知蛋白的氨基酸序列最低相似性亦可达到 75%, 说
明这些基因片段分别属于GAPDH、β-actin、α-tubulin、
UBQ5、RPL4、eIF4A和 eEF1α基因。
根据测序结果设计定量引物, 如表 4所示。

图 1 简并引物 RT-PCR产物电泳图谱
Fig. 1 Electrophoresis profile of RT-PCR from degenerate
primers
M: DNA maker DL-2000; 1: GAPDH; 2: β-actin; 3: α-tubulin; 4:
UBQ5; 5: RPL4; 6: eIF4A; 7: eEF1α.

2.2 荧光定量 PCR的效率
由表 5 可知, 9 个候选内参基因的标准曲线 R2
值变化范围为 0.990~0.999 (表 5), 表明 cDNA初始
模板量与其相应的 Ct值线性关系较好。各基因扩增
效率的变化范围为 88.5%~109.6%, 显示出荧光定量
PCR反应的有效性。模板与 Ct值间的良好线性关系
和反应的有效性确保定量结果准确、可靠。
2.3 BestKeeper软件分析
利用 BestKeeper 软件比较标准差(SD)和变异系
474 作 物 学 报 第 38卷

数(CV)的大小, 分析各基因的稳定性, SD 越小, CV
越小, 基因稳定性就越好。如表 6所示, 在茎点枯病
菌诱导下稳定性最好的是 UBQ5, 其次是 α-tubulin、
eIF4A等, eEF1α最差。

表 3 基因片段同源性比对结果
Table 3 Homology results of the gene fragments
GenBank登录号
GenBank accession number
基因
Gene symbol
分值
Score (bits)
期望值
E-value
相似性
Identity (%)
AEE81172.1 GAPDH 262 4E–88 94
BAK52268.1 β-actin 463 9E–165 95
CAD13177.1 α-tubulin 523 0 96
AAQ76040.1 UBQ5 192 2E–61 99
CAA63651.1 RPL4 124 2E–33 79
P41379.1 eIF4A 530 0 97
ACS68201.1 eEF1α 604 0 75

表 4 7个内参基因的定量引物序列
Table 4 Quantitative primer sequences of seven reference genes
基因
Gene symbol
引物序列
Primer sequence (5′→3′)
扩增长度
Amplication length (bp)
GAPDH F: TGATTCTTGCTTGATGACGGC; R: AAGTTTGGCATTGTGGAGGGT 300
β-actin F: TTTGAGCAGGAACTGGACACT; R: ACAACACTTCTGGACAACGGA 118
α-tubulin F: CCATACCCGAGGATTCACTTCA; R: TGGTGGCAACAGCAGCATT 223
UBQ5 F: TCTCGCCGACTACAACATTCA; R: TGGACACTCTTTCCTCAACCTCT 202
RPL4 F: CACTGCTTCAACCCTCACCC; R: ATAGCGAGCCTCTTCTCCTTCTT 189
eIF4A F: AGCCCGTCCGCATTCT; R: AAGCCAGTCAACCTTTCTCC 176
eEF1α F: CTCTGCTCGCCTACACCCTC; R: CTCCTTCTCCCAGCCCTTG 236

表 5 9个候选内参基因的标准曲线方程、回归系数及扩增效率
Table 5 Standard curve equation, regression coefficient and PCR efficiency of nine candidate reference genes
基因
Gene symbol
标准曲线方程
Standard curve equation
斜率
Slope
扩增效率
PCR efficiency (%)
回归系数
Regression coefficient (R2)
18S rRNA y = –3.6315x + 24.858 −3.63 88.52 0.997
NADHD y = –3.5238x + 33.370 −3.52 92.21 0.999
GAPDH y = –3.5858x + 38.227 −3.59 90.05 0.998
β-actin y = –3.3425x + 35.791 −3.34 99.15 0.999
α-tubulin y = –3.2443x + 34.611 −3.24 103.34 0.999
UBQ5 y = –3.2114x + 36.578 −3.21 104.83 0.998
RPL4 y = –3.4126x + 37.367 −3.41 96.35 0.998
eIF4A y = –3.4870x + 37.223 −3.49 93.54 0.997
eEF1α y = –3.1117x + 38.107 −3.11 109.59 0.992

表 6 以 BestKeeper软件分析 9个候选内参基因在病程中的表达稳定性
Table 6 Expression stability of nine candidate reference genes during pathogenic stages by BestKeeper
基因 Gene 参数
Parameter 18S rRNA NADHD GAPDH UBQ5 β-actin α-tubulin RPL4 eIF4A eEF1α
GM [CP] 8.68 18.97 22.23 21.24 21.12 22.24 23.12 21.24 23.57
AM [CP] 8.71 19.01 22.30 21.25 21.18 22.25 23.16 21.26 24.16
Min [CP] 7.95 16.86 20.39 20.20 19.08 20.97 21.01 19.70 17.62
Max [CP] 10.34 20.78 24.99 22.50 24.48 23.06 25.99 22.54 30.89
SD [± CP] 0.65 1.10 1.53 0.59 1.30 0.63 0.89 0.67 5.12
CV [% CP] 7.45 5.79 6.87 2.79 6.16 2.82 3.84 3.16 21.19
第 3期 刘莉铭等: 茎点枯病菌诱导下芝麻内参基因的筛选 475


2.4 NormFinder软件分析
NormFinder软件通过生成基因表达稳定值M来
筛选内参基因, M值越大, 内参基因越不稳定, M值
越小 , 内参基因越稳定。由图 2 可知 , M 值为
eEF1α>β-actin>GAPDH>RPL4>NADHD>18S rRNA>
UBQ5>α-tubulin>eIF4A, 其中, eIF4A 的 M 值最小,
是表达最稳定的基因, 说明 eIF4A 可作为芝麻在茎
点枯病菌诱导下进行基因表达分析的内参基因。
2.5 GeNorm软件分析
GeNorm 软件也是一款通过分析内参基因的表
达稳定值来筛选内参基因的程序, 但该程序基于标
准差, 默认取舍值 M=0.5, 若内参基因 M<0.5, 就可
考虑将其作为内参基因。由图 3可知, UBQ5、eIF4A
和 α-tubulin 均可考虑作为内参基因。但与 Norm-
Finder类似, M值越大, 内参基因越不稳定, 反之内
参基因越稳定。由结果可知, 候选内参基因的表达
稳定性为 UBQ5 = eIF4A>α-tubulin>18S rRNA>RPL4>
NADHD>β-actin>GAPDH>eEF1α, UBQ5、eIF4A 表
达稳定性较好, 更适合作为芝麻在茎点枯病菌诱导
下进行基因表达分析的内参基因。

图 2 以 NormFinder软件分析候选内参基因在病程中的表达稳定性
Fig. 2 Expression stability of candidate reference genes during pathogenic stages by NormFinder


图 3 以 GeNorm软件分析候选内参基因在病程中的表达稳定性
Fig. 3 Expression stability of candidate reference genes during pathogenic stages by GeNorm

GeNorm 软件通过分析内参基因的配对差异值
Vn/n+1 能确定在某种条件下所需内参基因的最适数
目, 该程序默认 V值为 0.15, 若 Vn/n+1<0.15, 则没必
要引入第 n+1 个内参基因。由图 4 可知 , V3/4 =
0.137<0.15, 没必要引入第 4个内参基因, 说明在茎
点枯病菌诱导下进行基因表达分析的内参基因的最
适数目是 3 个 , 分别是表达较稳定的 UBQ5、
eIF4A和 α-tubulin。
3 讨论
3.1 简并引物的设计
传统的简并引物一般是针对与目标基因亲缘关
系较近的氨基酸序列的高度保守区, 根据密码子的
简并性设计的, 但由于未考虑物种的密码子偏好性,
476 作 物 学 报 第 38卷


图 4 内参基因最适数目的确定
Fig. 4 Determination of the optimal number of reference genes
for normalization

传统简并引物的简并度一般都偏高, 而 Tm 值又偏
低, 导致 PCR扩增产物的特异性降低[12]。本研究所
用的 CodeHop方法[13-14]是一种新的在线软件程序化
设计简并引物的方法, 用该方法设计的简并引物包
括 3′端核心简并区和 5′端非简并性夹板区两部分,
引物 5′端夹板区就是根据密码子偏好性设计的一致
性序列, 而 3′端核心简并区是根据 4 个保守氨基酸
设计的, 这种引物设计方法既能减少引物的简并度,
又能提高 Tm值, 降低了 PCR非特异性的产物。
本研究利用 CodeHop方法设计的简并引物在芝
麻中克隆得到 GAPDH、β-actin、α-tubulin、UBQ5、
RPL4、eIF4A 和 eEF1α 等看家基因, 这几个基因在
维持细胞结构、正常生理代谢以及转录调控等方面
有着重要作用, 基因的获得为深入研究它们的功能
也奠定了基础, 而从电泳检测结果可看出, 简并引
物的扩增效率和扩增特异性都比较高, 测序结果显
示无假阳性。由于 CodeHop方法设计的简并引物不
仅针对这些同源性较高的基因, 对于同源性较低或
低丰度的基因也特别有效[15-18], 所以, CodeHop 方
法是一种比较实用的快速、高效克隆基因的方法。
3.2 内参基因的筛选
理想的内参基因一般具有以下特点: 第一, 在
不同的组织器官和发育阶段中表达稳定 [19]; 第二 ,
在生物或非生物胁迫下表达稳定; 第三, 表达水平
与目标基因相近; 第四, 选用的内参基因不存在假
基因[20]。但在实际上, 能满足这些条件的基因几乎
是不存在的, 目前所研究的基因(包括看家基因)在
不同类型的组织、细胞及实验条件下表达均有差
异[3-9, 21], 研究者需要针对不同的实验条件分析内参
基因的稳定性。
在分析内参基因的表达稳定性时, 常常需要用
到 BestKeeper、NormFinder、GeNorm等软件。其中,
BestKeeper 是 Pfaffl 等[22]开发的一款专门筛选内参
基因的程序, 它可以直接利用 Ct值通过反复配对相
关分析和归一化分析, 产生标准差(SD)和变异系数
(CV), 然后通过比较这 2个值的大小, 评价各基因的
稳定性, SD越小, CV越小, 基因稳定性就越好。由
于 18S rRNA表达量较高, 使得Ct值较其他内参基因
普遍偏低, 利用 BestKeeper 分析时容易出现 SD 较
小、CV值偏大的现象(表 6), 不过有研究表明在进行
基因表达分析时, 选用与目的基因表达量相近的内
参更能准确校正定量结果, 所以, 18S rRNA 的漏选
不影响内参基因的筛选。NormFinder[10]是 Andersen
开发的同类筛选内参基因的程序, 原始数据先经标
准曲线或 ΔCt 法将其转换成线性表达量, 然后运用
软件通过方差分析得出基因的表达稳定值 M, 直接
评价基因的稳定性。与 NormFinder 类似, GeNorm
也是一款通过分析内参基因的表达稳定值来筛选内
参基因的程序, 由 Vandesompele 等[23]于 2002 年编
写, 原始数据先经 2–ΔCt 法转换成相对表达量, 然后
输入 Excel表格, GeNorm软件通过将每个候选内参
基因与其他候选基因的配对表达水平比值经对数变
换, 计算其标准差作为基因表达稳定值 M, 对所有
候选内参基因的表达稳定性排序。同时 GeNorm 软
件通过对标准化因子配对差异分析(V), 从而确定合
适的内参基因数目。该程序默认 V 值为 0.15, 若
Vn/n+1<0.15, 则没必要引入第 n+1个内参基因。当然,
对极少数基因进行分析或目的基因有较大表达差异
时则没必要选择较多的内参基因, 这需要视具体实
验要求及实验条件而定。与上述 3种软件不同, GPR
软件[24]基于多基因标准化后独立样本的 t 检验, 既
不针对候选内参基因的表达稳定性排序, 也不筛选
最稳定的内参基因, 相反, GPR 软件利用候选内参
基因将每个基因标准化, 然后针对每个基因的对照
组和处理组对表达有差异的基因进行鉴定。
在内参基因筛选方面, 选择出最稳定的内参基
因比选出最不稳定的基因更有利用价值, 因此, 本
实验选用 BestKeeper、NormFinder、GeNorm 这 3
种软件进行内参基因稳定性的评价。由软件分析结
果可知, UBQ5、eIF4A、α-tubulin在茎点枯病菌诱导
下芝麻中表达均较稳定, 与在水稻[5]、杨树[25]、莱
茵衣藻[26]中的研究结果一致, 而 eEF1α 变化最大,
与在荷花[6]、菊苣[7]、马铃薯[9]中的研究结果相反。
当使用多基因作为内参基因时, V2/3=0.151>0.15, 说
明除 UBQ5、eIF4A 外还需引入第 3 个内参基因
α-tubulin, 而 V3/4=0.137<0.15, 则没必要引入第 4个
第 3期 刘莉铭等: 茎点枯病菌诱导下芝麻内参基因的筛选 477


内参基因 18S rRNA, 说明在茎点枯病菌诱导下进行
基因表达分析的内参基因的最适数目是 3 个, 分别
是表达较稳定的 UBQ5、eIF4A和 α-tubulin。
根据文献报道, 研究植物的苗期抗病机制时多
采用两叶一心期的植株材料[27], 本研究的目的是筛
选出在茎点枯病菌诱导下芝麻苗期表达稳定的内参
基因, 从而为苗期芝麻抗茎点枯病分子机制的研究
奠定基础。另外, 应在植株的整体水平上研究苗期
抗病及其相关基因的表达情况, 所以有必要从植株
整体水平筛选合适的内参基因, 而对于成株期内参
基因的筛选在接菌方法、采样时间、采样部位等方
面的条件都有待进一步探索。
4 结论
在芝麻中利用 CodeHop方法设计简并引物克隆
得到 GAPDH、β-actin、α-tubulin、UBQ5、RPL4、
eIF4A 和 eEF1α 7 个基因, 其中, UBQ5、eIF4A、
α-tubulin是最稳定基因, 适合校正目的基因表达。
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