全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(5): 855−860 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由湖南省科技计划项目(07JJ5040)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 张学文, E-mail: xwzhang@hunau.net; Tel: 0731-4617017
Received(收稿日期): 2008-09-03; Accepted(接受日期): 2008-12-30.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.00855
薤白 EPSP合成酶基因转化烟草提高其草甘膦抗性
黄丽华 1 蒋 向 1 李 博 1 李育强 2 张学文 1,*
1湖南农业大学生物科学技术学院, 湖南长沙 410128; 2湖南省棉花科学研究所, 湖南常德 415101
摘 要: 葱属植物薤白具有较强的草甘膦抗性。将薤白中与草甘膦抗性相关的 EPSP 合成酶基因(EPSPsA) cDNA 重
组到植物表达载体 pWM101 中, 构建薤白植物表达 EPSPsA 重组载体, 采用根癌农杆菌介导法将其转入烟草品种
WS38, 获得转薤白 EPSPsA 基因烟草。PCR 分析表明 , 目的基因已经整合进烟草基因组中。对转基因烟草愈
伤组织及幼苗进行的草甘膦抗性检测表明 , 转基因烟草对草甘膦的耐受性明显提高。
关键词: 薤白; EPSP合成酶基因; 烟草转化; 草甘膦抗性
Transformation of EPSP Synthetase Gene from Allium macrostemon Bunge into
Tobacco and Improvement of Resistance in Transgenic Plants to Glyphosate
HUANG Li-Hua1, JIANG Xiang1, LI Bo1, LI Yu-Qiang2, and ZHANG Xue-Wen1,*
1 College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2 Hunan Cotton Science Institute, Changde
415101, China
Abstract: EPSPs (5-enolppyruvylshikimate-3-phosphate synthetase) is an important enzyme involved in the synthesis of the aro-
matic amino acids in all plants, which catalyzes phosphoenolpyruvate and shikimate 3-phophate to form 5-enolpyruvlshimimate-
3-phosphate and phosphate. Glyphosate is a chemical with similar structure of phosphoenolpyruvate, which combines enzyme to
inhibit the activity of EPSPs, so it is a broad spectrum herbicide to control weeds. Breeding glyphosate tolerance or resistance
crops will be an effective way to control weeds. In the study, a gene cDNA (EPSPsA) isolated from Allium macrostemon Bunge
was ligated with vector pWM101 to construct a recombinant vector. The recombinant gene was transformed into WS38 via
Agrobacterium-mediated way to obtain transgenic tobacco seedlings. Transgenic seedlings were screened with ordinary antibio-
tics. PCR analysis showed that EPSPsA was successfully integrated into the tobacco genome in all the transgenic seedlings. The
result of RT-PCR also validated that EPSPsA was transcripted at mRNA leve1. At 60 d after spraying 200 mg L−1 glyphosate, the
transgenic tobacco plants grew better than the untransformed plants. The average fresh weight of aerial parts in transgenic plants
had a significant increase compared with those in untransformed control plants. The average chlorophyll content in transgenic
plants was 5.54 mg g−1, while that in the control only 1.16 mg g−1. In the treatment with 400 mg L−1 glyphosate, the untransformed
plants died while the transgenic ones grew well in the treatment with 1 000 mg L−1 glyphosate. These results proved that the EP-
SPsA can improve the glyphosate tolerance in tobacco.
Keywords: Allium macrostemon Bunge; EPSPs cDNA; Tobacco transformation; Glyphosate resistance
草甘膦是一种广谱灭生性、内吸传导型除草剂,
被广泛用于农田害草控制。其作用机理是与芳香族
氨基酸合成过程的关键酶 EPSP 合成酶(5-烯醇式丙
酮酸-3-磷酸莽草酸合成酶, EPSPs)结合, 竞争抑制
其底物结合活性, 导致植物芳香族氨基酸不能正常
合成而致死, 因其具有高效、广谱、低毒、低残留等
特性, 而成为使用范围最广的除草剂之一[1-3]。但由于
草甘膦作为一种非选择性除草剂, 对农作物同样有
着毒害作用 , 从而限制了其使用范围和施用方式 ,
同时也给农业生产带来了巨大的损失[4-5]。因此, 自
从草甘膦广泛应用以来, 许多研究者通过多种方法
来选育抗草甘膦的作物新品种[6-8]。
目前通过基因工程培育抗草甘膦植物是最有效
的获取抗性作物的手段。基因工程方法多采用细菌
来源的抗性 EPSP 合成酶基因, 该基因的产物与草
甘膦结合活性下降而不能被其竞争抑制, 保证了植
物芳香族氨基酸的正常合成。常用的抗性基因来源
有鼠沙门氏菌、根癌农杆菌、大肠杆菌、假单胞菌
856 作 物 学 报 第 35卷

等。许多研究者利用这些抗性基因, 采用基因工程
的方法获得了表达细菌 EPSP 合成酶的转基因植物
表现对草甘膦的抗性 [9-16], 其中转基因抗草甘膦大
豆已在美国、巴西等国家大面积栽种。但这些来源
于细菌的抗性基因作物作为食品或食品原料, 其安
全性一直是争论的焦点。虽从矮牵牛、牛筋草[17]和
水稻[18]等植物中克隆出了 EPSPs 编码基因, 但从这
些植物中获得的该基因很少表现出抗性, 利用这些
基因进行的草甘膦抗性基因工程也未能取得突破。
因此要解决当前草甘膦抗性基因工程存在的问题 ,
需要挖掘新的草甘膦抗性基因资源。
本实验室在生产实践中发现葱属植物薤白具有
较强的草甘膦抗性, 克隆了抗草甘膦薤白 EPSPsA
cDNA, 并对该基因的表达进行了分析[19]。本研究利
用已克隆的抗草甘膦薤白 EPSPsA cDNA, 构建薤白
EPSPsA 植物表达载体, 转化烟草, 旨在探讨薤白抗
草甘膦 EPSPsA cDNA在植物体中表达情况, 验证用
该基因 cDNA 开展植物抗草甘膦的可行性, 为作物
的抗除草剂基因工程提供新的方法。
1 材料与方法
1.1 试验材料
已克隆的薤白 EPSPsA 基因 cDNA, 烟草品种
WS38, 根癌农杆菌 LBA4404 等均为本实验室保
存。
1.2 薤白 EPSPsA基因的扩增
根据本实验室克隆的薤白 EPSPsA 基因 cDNA
序列(GenBank 登录号为 DQ462442), 设计特异性引
物 P1(5′-GCTCTAGAATTGGAGCACACGGTAATGG-
3′, 包含 Xba I酶切位点)和 P2(5′-AACTGCAGTTAA
TG CTTTGCATATCTTTC-3′, 包含 Pst I酶切位点)。
以 pMD-18-EPSPsA为模板, P1和 P2为引物, PCR扩
增薤白 EPSPsA基因。PCR程序为 95℃预变性 4 min;
94℃变性 1 min, 55℃退火 50 s, 72℃延伸 2 min; 共
35 个循环, 最后 72℃延伸 10 min。PCR 产物经 1%
琼脂糖凝胶电泳检测后, 采用凝胶回收试剂盒(购自
湖南长沙安比奥生物技术有限公司)切胶回收。
1.3 植物过表达载体的构建及检测
将薤白 EPSPsA基因和质粒载体 pWM101用 Pst
I和 Xba I双酶切, 1%琼脂糖凝胶电泳确认后分别切
胶回收, 重组连接后, 热激法转化至大肠杆菌 InvαF′
中。菌落 PCR和双酶切检测 pWM101-EPSPsA重组
载体, 并经测序鉴定转基因载体的正确性。
1.4 过表达载体 pWM101-EPSPsA 转化根癌农
杆菌
参考《分子克隆实验指南》 , 通过冻融法将
pWM101-EPSPsA重组载体转化农杆菌细胞。
1.5 叶圆盘法转化烟草
取烟草无菌苗幼嫩、健壮叶片, 剪成叶圆盘后,
用农杆菌 LBA4404培养液(OD600 = 0.5~0.6)侵染, 再
接种于 MS培养基上共培养 3 d, 然后转入含羧苄青
霉素(500 mg L−1)、潮霉素(50 mg L−1)、6-BA (1.0 mg
L−1)、NAA (0.1 mg L−1)MS固体培养基中, 25℃ 16 h
光照、8 h黑暗交替培养 3周。
1.6 转基因烟草的草甘膦抗性检测
将通过潮霉素抗性筛选的愈伤组织和普通愈伤
组织分别接种到草甘膦浓度为 0、200、400、800、
1 200、2 000和 3 000 mg L−1 MS培养基中, 25℃ 16 h
光照、8 h黑暗交替培养, 检测转基因烟草愈伤组织
对草甘膦的抗性。用浓度 200、400、800和 1 000 mg
L−1 草甘膦溶液喷洒再生后的转基因烟草植株叶片,
检测其草甘膦抗性。
1.7 转基因烟草的检测
取转基因烟草和对照烟草嫩叶, 采用安比奥公
司 GenoDNA Plant Mini Kit 试剂盒提取基因组 DNA,
作为 PCR模板。以 P1、P2为引物, pWM-EPSPsA质
粒为阳性对照, 进行PCR, 其产物大小预计为1.6 kb。
1.8 EPSPsA基因转录表达分析
随机选取 4个 PCR检测阳性的转基因植株, 进
行 EPSPsA 基因的转录表达分析。取对照烟草及转
基因烟草叶片, 用 Trizol (Introgen)抽提总 RNA。采
用 Fermentas 公司反转录试剂盒将 RNA 反转录为
cDNA, 作为半定量RT-PCR扩增的模板。以烟草 18S
rRNA 为内参基因, 扩增的上游引物为 5′-ATGATAAC
TCGACGGATCGC-3′, 下游引物为 5′-CTTGGATGT
GGTAGCCGT-3′, 扩增分子长度为 189 bp。EPSPsA
基因扩增的上游引物为 5′-GTTAACGTCAACAGCT
TTCAATCTC-3′, 下游引物为 5′-ATCCCGACAGTG
CTACATATGAGAG-3′, 扩增片段大小为 539 bp。
采用同机分管扩增 18S rRNA与目的基因。PCR
产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测, 并以天能凝胶成像
系统拍照成像。
2 结果与分析
2.1 EPSPs基因 PCR扩增结果
通过 PCR 方法从克隆的 pMD-18-EPSPsA 上扩
第 5期 黄丽华等: 薤白 EPSP合成酶基因转化烟草提高其草甘膦抗性 857


增出 EPSPsA 基因, 并在其两端加上 Xba I 和 Pst I
酶切位点。经 1%琼脂糖凝胶电泳分析(图 1), PCR扩
增产物大小约为 1.6 kb, 是预期的 EPSPsA基因。



图 1 PCR扩增 EPSPsA cDNA
Fig. 1 PCR ampLification of EPSPsA cDNA
M: DNA ladder mix; 1: EPSPsA cDNA.
2.2 植物表达载体 pWM101-EPSPsA 的构建与
鉴定
植物表达载体 pWM101-EPSPsA 的构建如图 2
所示。构建的表达质粒转化大肠杆菌后, 在转化平
板上随机挑取 10个菌落, 进行菌落 PCR检测。其中
7个菌落扩出约 1.6 kb的特异条带, 与预期大小相符
(图 3)。挑取阳性菌落提取质粒, 用 Xba I和 Pst I酶
切, 获得大小约为 1.6 kb的预期带(图 4)。
2.3 表达载体 pWM101-EPSPsA 转化农杆菌
LBA4404
以冻融法将 pWM101-EPSPsA 转化农杆菌
LBA4404 后, 在转化平板上随机挑取 7 个菌落, 进



图 2 植物表达载体 pWM101-EPSPsA的构建
Fig. 2 Construction of plant expression vector pWM101-EPSPsA



图 3 表达载体 pWM101-EPSPsA的菌落 PCR检测
Fig. 3 Colony PCR of recombinant pWM101-EPSPsA
M: DNA分子量标准; 1~10: 不同菌落的 PCR结果。
M: DNA ladder mix; 1–10: different colonies.



图 4 表达载体 pWM101-EPSPsA的双酶切检测
Fig. 4 Identification of the pWM101-EPSPsA digested by
Xba I and Pst I
M: DNA分子量标准; 1: pWM101-EPSPsA的双酶切鉴定; 2:
pWM101-EPSPsA重组质粒。
M: DNA ladder mix; 1: identification of pWM101-EPSPsA digested
by Xba I and Pst I; 2: recombinant plasmid of pWM101-EPSPsA.

行菌落 PCR, 电泳结果显示在所有 7 个菌中均出现
约 1.6 kb的目的带(图 5), 而未转质粒的对照农杆菌
中则无此带, 证明表达载体 pWM101-EPSPsA 已经
成功转化农杆菌 LBA4404。
2.4 以叶圆盘法转化烟草
将叶圆盘转入含羧苄青霉素(500 mg L−1)和潮霉
素(50 mg L−1) MS固体培养基中 1周后, 对照组叶圆
盘逐渐褐化死亡。转基因叶圆盘经培养 3周后, 分化
出不定芽(图 6)。



图 5 菌落 PCR 检测 pWM101-EPSPsA转化农杆菌
LBA4404的结果
Fig. 5 Colony PCR screening of A. tumefaciens LBA4404
transformed by pWM101-EPSPsA
M: DNA分子量标准; 1~7: 不同菌落 PCR结果; 8: 对照。
M: DNA ladder mix; 1–7: different transformed colonies; 8: CK.



图 6 转基因叶盘愈伤组织诱导与筛选
Fig. 6 Transgenic leaf plate callus induced and screened
A: 转基因叶圆盘产生抗性愈伤组织;
B: 对照烟草叶圆盘逐步坏死。
A: transgenic callus growing up on transgenic leaf plate;
B: putrescence of non-infected leaf plates on the medium.

2.5 转基因烟草愈伤组织的草甘膦抗性检测
25℃ 16 h光照、8 h黑暗交替培养 2周后, 对照
烟草愈伤组织在草甘膦浓度为 50 mg L−1的培养基
858 作 物 学 报 第 35卷

上, 已全部坏死, 而转基因烟草愈伤组织在 800 mg
L−1的草甘膦培养基上仍可缓慢生长, 当草甘膦浓度
达到 1 200 mg L−1时愈伤组织也逐步坏死(图 7)。



图 7 转基因烟草愈伤组织的草甘膦抗性
Fig. 7 Resistance of transgenic tobacco callus to glyphosate
A: 在正常MS培养基上生长的转基因烟草愈伤组织; B: 在含有 50
mg L−1草甘膦MS培养基上生长 2周的对照烟草愈伤组织; C: 在含
有 800 mg L−1草甘膦MS培养基上缓慢生长的转基因烟草愈伤组织;
D: 在含有 1200 mg L−1草甘膦MS培养基上的转基因烟草愈伤组织。
A: transgenic tobacco callus on normal MS medium; B: control
callus growing on MS medium with 50 mg L−1 glyphosate for 2
weeks; C: transgenic tobacco callus growing on MS medium with
800 mg L−1 glyphosate; D: transgenic tobacco callus growing on MS
medium with 1 200 mg L−1 glyphosate.

2.6 对转基因烟草植株草甘膦抗性的检测
非转基因和转基因烟草在正常条件下的生长状
态基本相似(图 8-A, B); 200 mg L−1草甘膦喷洒后,
非转基因植株虽能成活但生长受到抑制(图 8-C), 而
转基因植株能较正常生长(图 8-D)。喷洒植株 60 d
后, 对照地上部分的净增鲜重平均为 25 g, 叶片总
叶绿素含量平均为 1.16 mg g−1; 转基因植株地上部
分的净增鲜重平均为 75 g, 叶片总叶绿素含量平均
为 5.54 mg g−1。当草甘膦浓度高于 400 mg L−1时, 对
照植株在喷洒后, 逐渐死亡(图 8-E)。转基因植株在
喷洒浓度低于 1 000 mg L−1草甘膦后, 仍能较正常
生长(图 8-F); 当草甘膦浓度高于 1 000 mg L−1时,
生长也受到抑制。试验初步说明薤白 EPSP 合成酶
基因 cDNA导入使烟草的草甘膦抗性提高。
2.7 转基因烟草的 PCR检测
图 9 显示, 10 株转基因植株和质粒对照扩增出
与薤白 EPSPsA基因大小(1.6 kb)相近的 DNA片段,
证明薤白 EPSPsA基因已经整合入烟草基因组中。
2.8 EPSPsA基因转录表达分析
随机选取 4 株转基因烟草进行 RT-PCR(图10),
在 539 bp 处扩增出特异的目的条带, 表明 EPSPsA
基因在转基因烟草中都有一定量的表达, 而对照中
没有发现 EPSPsA 基因的表达。根据该结果推测转
基因烟草草甘膦抗性的提高可能是 EPSPsA 基因导


图 8 转基因烟草的草甘膦抗性
Fig. 8 Resistance of transgenic tobacco plants to glyphosate
A: 非转基因烟草; B: 转基因烟草; C: 200 mg L−1草甘膦处理后 60 d的对照; D: 200 mg L−1草甘膦处理后 60 d的转基因烟草;
E: 400 mg L−1草甘膦处理后 2周的对照; F: 1 000 mg L−1草甘膦处理后 2周的转基因烟草。
A: control plant; B: transgenic plant; C: control plants at 60 d after spraying with 200 mg L−1 glyphosate; D: transgenic plantsat 60 d after
spraying with 200 mg L−1 glyphosate; E: control plants at 2 weeks after spraying with 400 mg L−1 glyphosate; F: transgenic plants at 2 weeks
after spraying with 1 000 mg L−1 glyphosate.
第 5期 黄丽华等: 薤白 EPSP合成酶基因转化烟草提高其草甘膦抗性 859


入和过量表达引起的。



图 9 转基因烟草植株的 PCR检测
Fig. 9 PCR analysis of transgenic tobacco plants
M: marker; 0: 非转基因植株; 1: 阳性质粒对照; 2~11: 转基因烟草。
M: Marker; 0: control; 1: pMD-18-EPSPsA plasmid;
2–11: transgenic plants.



图 10 转基因烟草中 EPSPsA基因的表达
Fig. 10 Expression of EPSPsA in transgenic tobacco plants
CK: 非转基因植株; 1~4: 转基因植株。
CK: non-transgenic tobacco plants; 1–4: transgenic tobacco plants.
3 讨论
5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合成酶(5-enolpy-
ruvylshikimate-3-phosphate synthetase, EPSPs)是细菌
和高等植物莽草酸途径中的一个必需合成酶, 其功
能是催化烯醇式丙酮酸(PEP)与莽草酸-3-磷酸合成
5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸(EPSP), 进而合成芳
香族氨基酸[20]。草甘膦是目前使用最广泛的一种广
谱除草剂, 具有与 PEP 相似的结构, 因而能竞争性
与 EPSPs、S3P 形成复合物, 阻遏 EPSPs 和 PEP 的
结合, 从而阻断芳香族氨基酸的合成, 使植物细胞
分裂、叶绿素合成、蒸腾、呼吸以及蛋白质等代谢
过程受到影响而死亡[21]。因此, 通过植物基因工程
手段, 利用转基因技术提高 EPSPs 基因的表达量或
定点突变 EPSPs以降低酶对草甘膦的亲和力来获得
草甘膦抗性作物。目前获取草甘膦抗性作物有效、
快速并普遍应用的方法是将外源抗性基因导入作物
中。已有许多研究表明, 将编码对草甘膦具有天然
耐药性的 EPSPs 基因导入植物, 可以提高植物对草
甘膦的抗性。1983年, Rogers等[22]将 aroA基因连接
到质粒 pBR322 中并转化到大肠杆菌中 , 以增加
aroA 基因的表达, 使大肠杆菌对草甘膦的抗性提高
了 8倍。Shah等[23]培育并筛选出了具草甘膦抗性的
矮牵牛细胞系 MP4-G, 它能超量产生 EPSP 合成酶,
从中分离出EPSP合成酶的 cDNA克隆, 将其转入矮
牵牛叶片表现出较高的草甘膦抗性。Lebrun等[24]利
用位点直接突变, 从玉米细胞系克隆得到了对草甘
膦不敏感的 CP4 基因, 并得到转化该基因的商品化
抗草甘膦玉米品种。我国研究者从微生物和植物中
克隆了许多抗草甘膦的 EPSP 合成酶基因, 也进行
了转基因植物研究[6,25]。虽然转基因植物与野生型相
比对草甘膦的抗性有所提高, 但能在生产应用的很
少。另外, 目前推广的抗草甘膦作物品种几乎全都
是美国 Monsanto 公司研制成功的。Monsanto 公司
的抗草甘膦转基因作物种子和农药捆绑式销售, 已
经形成了独霸抗草甘膦作物种子和草甘膦农药市场
的局面。我国作为农业大国, 要改变这种局面, 必须
研制出能在生产上应用的具有独立知识产权的抗草
甘膦基因, 这是目前我国抗草甘膦转基因研究中的
关键。
本研究室在生产实践中发现葱属植物薤白具有
较强的草甘膦抗性, 并对抗性机理进行了研究。实
验结果证明薤白对草甘膦的抗性源于其对草甘膦的
耐受性[26]。为了鉴定薤白 EPSPs 基因的功能, 我们
克隆了该基因, 并将其重组入植物表达载体 pWM101
中, 通过根癌农杆菌介导法将重组基因转入烟草
WS38, 提高了对草甘膦的抗性, 且生长情况较好,
从而证实利用薤白 EPSPs酶基因开展植物抗草甘膦
的可行性, 为作物抗除草剂基因工程提供了新的方
法。
4 结论
构建了含薤白 EPSPsA cDNA植物表达载体, 通
过叶圆盘法转化模式植物烟草, 共获得 70株当代转
基因植株。草甘膦喷施试验表明转基因烟草对草甘
膦的抗性提高。
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