全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(7): 1328−1333 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31000908), 中央高校基本科研业务费专项资金(XDJK2009C124, XDJK2012B020), 重庆市自然科学
基金(2009BB1307, 2011BA1002)和国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2012CB1139000)资助。
∗ 通讯作者(Corresponding author): 宋明, E-mail: swausongm@yahoo.com.cn
第一作者联系方式: E-mail: swutql@163.com, Tel: 023-68251274 ** 同等贡献(Contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2011-09-30; Accepted(接受日期): 2012-04-16; Published online(网络出版日期): 2012-05-11.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120511.1809.025.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.01328
芥菜 AP1基因体外表达及其与 FLC相互作用的验证
汤青林** 许俊强** 宋 明* 王志敏
西南大学园艺园林学院 / 南方山地园艺学教育部重点实验室 / 重庆市蔬菜学重点实验室, 重庆 400715
摘 要: 芥菜花分生组织决定因子 AP1与开花路径核心调节子 FLC可能存在直接的相互作用, 从而调节开花时间。
为进一步检测该相互作用, 从芥菜“QJ”材料中同源克隆了 790 bp的 AP1 cDNA序列, 该基因编码 256个氨基酸。生
物信息学分析表明, AP1属 MIKC型蛋白, 其 MADS域含有 2个α螺旋和 2个β折叠, 第 1个α螺旋内含有 1个不保守
氨基酸位点; 而 K域含有 3个α螺旋, 第 1、2个α螺旋内各有 1个不保守位点, 第 3个α螺旋内具有 4个不保守位点。
同时构建了原核表达质粒 pET43.1a-AP1, 转化宿主菌大肠杆菌 BL21, 以 IPTG 诱导该融合蛋白体外表达。利用
pET43.1a-AP1融合蛋白序列中 6×His 标签与 Ni+结合的特点, 结合 SDS-PAGE分析, 证实了体外表达蛋白 AP1能与
FLC相互作用并形成复合体, 该结果为深入研究 AP1与 FLC互作机制及花分生组织的分子调控奠定了基础。
关键词: 芥菜; AP1基因; FLC; 蛋白互作
Expression of Floral Meristem Identity Gene AP1 in vitro and Validation of
Interaction between AP1 and FLC in Brassica juncea Coss. (Mustard)
TANG Qing-Lin**, XU Jun-Qiang**, SONG Ming *, and WANG Zhi-Min
College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University / Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous Re-
gions, Ministry of Education / Key Laboratory of Olericulture, Chongqing 400715, China
Abstract: There exists a possible direct interaction between floral meristem factor AP1 and flowering pathway central regulator
FLC in Brassica juncea Coss. To further prove the interactive mechanism between AP1 and FLC, the protein interaction in vitro
was testified in Brassica juncea Coss. (Mustard). The cDNA of AP1 gene isolated using homologous cloning techniques from
mustard “QJ” was 790 bp, encoding 256 amino acids. AP1 belongs to MIKC type protein with MADS domain and K-box known
from analysis software. The conserved MADS domain had two alpha helixes (α) and two beta-sheets (β), and one amino acid site
in the first α helix was not conserved. The K-box had three alpha helixes (α), and one amino acid site in the first and second α
helixes was not conserved, respectively, but four amino acid sites in the third α helix were not conserved. Furthermore, recombi-
nant plasmid pET43.1a-AP1 was constructed, transformed to E. coli (BL21) and then induced protein expression by IPTG. With
the characteristics of 6×His tag in fusion protein of pET43.1a-AP1 which could combine with Ni+, the interaction between AP1
and FLC was analyzed via SDS-PAGE. The results showed that AP1 and FLC could act with each other to combine and form a
complex. This research provides theoretical and technical bases for further analyzing the interaction mechanism of AP1-FLC pro-
tein complex and the molecular regulation of floral meristem in Brassica juncea.
Keywords: Brassica juncea Coss.; AP1 gene; FLC; Protein interaction
花分生组织发育是保证正常花形态的一个重要前期
发育阶段。AP1既是花分生组织决定基因, 又是花器官特
征基因。它编码的蛋白属于 MADS 家族成员, 具有转录
调节因子功能[1]。在花分化初期, 它在整个花原基里表达;
在花器官分化阶段, AP1仅在萼片和花瓣中表达[2-3]。AP1
表达受其上游因子诱导。长日照会促使 CONSTANS (CO)
表达 , CO 又促使叶片中的成花素 FT (FLOWERING
LOCUS T)表达[4]。FT蛋白作为开花信号分子沿韧皮部向
顶端分生组织移动[5], 与顶端分生组织表达的 bZIP 转录
因子 FD 互作, 形成的 FT/FD 辅因子激活 AP1 表达, 并
第 7期 汤青林等: 芥菜 AP1基因体外表达及其与 FLC相互作用的验证 1329


直接诱导花芽分化和开花[6-7]。AP1 表达受 LEAFY (LFY)
正向调节, LFY 可直接促进 AP1 转录[8]。Weigel 等[9]和
Liljegren等[10]研究表明 35S::AP1转基因植株在长/短日照
条件下皆能提早开花。吕晋慧等[11]将 AP1 同源基因转入
地被菊“玉人面”品种中, 也能使菊花提早开花。转 AP1
基因植株的开花时间早于野生型, 说明 AP1 在植物成花
过程中起着非常重要的作用。
在花分生组织生长发育的第 1阶段和第 2阶段, AP1
能够与 SVP或者 AGL24蛋白相互作用, 这种蛋白复合物
对花分生组织的确立非常重要 , 同时抑制花器管形态基
因的表达[12-13]。随后, SVP和 AGL24在花分生组织第 2阶
段受到抑制, AP1与 SEP(SEP从花分生组织第 2阶段开始
表达)蛋白相互作用, 花器官开始发育[14-15]。FLC 和 SVP
均为开花路径核心调节子 [16-17], 它们能够选择性地与开
花信号整合子(例如 SOC1、FT等基因)的顺式作用元件相
互作用, 调控 SOC1、FT 等基因的转录表达[18-20]。通过
AP1 与 SVP 的相互作用, 预测花分生组织决定因子 AP1
也能够与另一个开花路径核心调节子 FLC 发生相互作
用 [21], 在营养生长向花分生组织转变中起着重要的调节
作用[12]。
目前 , 本课题组已从芥菜 “QJ”材料中同源克隆了
625 bp 的 FLC 基因, 编码 197 个氨基酸。将其构建到
pET43.1a表达载体上, 获得了带有 BamH I / Kpn I双酶切
位点的融合质粒。以 0.1 mmol L–1 IPTG在 25℃诱导 4 h
后 , 能够大量表达特异性目标蛋白 pET43.1a-FLC[22]。
为了分析 AP1 与 FLC 的相互作用, 本研究拟从芥菜“QJ”
材料中同源克隆 AP1 基因, 并进行体外表达和 AP1-FLC
蛋白复合物验证研究, 探索转录因子 AP1 与 FLC 的作用
机制 , 以期为阐明控制花分生组织形态的调节机理奠定
基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
芥菜“QJ”为重庆市蔬菜学重点实验室多代自交纯合
品系, 属于长日照早花类型根用芥菜。在 RXZ 型智能人
工气候箱中播种和生长植株, 采用 20℃/16 h/光照、18℃/8
h/黑暗的光周期, 长日照处理 35 d 后取茎端于–80℃冻存
备用。表达载体 pET-43.1a、大肠杆菌 BL21 均本实验室
保存; UNIO-10 Trizol Total RNA Preparation Kit、BamH I、
Kpn I 购自生工生物工程(上海)有限公司; pEASY-Blunt
Simple Cloning Vector、TransStart FastPfu DNA Polymerase、
DNA 回收纯化试剂盒、质粒提取试剂盒购自北京全式金
生物技术有限公司; TOYOBO MagExtractor-His-tag-蛋白
纯化试剂盒购自东洋纺(上海)生物科技有限公司。
1.2 AP1和 FLC基因的克隆
以拟南芥、花椰菜 AP1 基因序列(NCBI 登录号分别
为 Z16421、U67452)设计简并引物对(APF和 APR)。APF
为 5′-CGCGGATCCATGGGRAGGGGTAGGGTTCARYT
GA-3′, 5′带保护碱基的 BamH I酶切位点; APR为 5′-CGG
GGTACCTTCATGCSGCRAAGCAGCCAAGGTT-3′, 5′带
保护碱基 Kpn I酶切位点。
以 TaKaRa RNAiso Reagent 试剂盒提取芥菜茎端总
RNA, TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试
剂盒反转录成 cDNA第 1条链。并以此作为扩增模板, 采
用 TransStart FastPfu DNA Polymerase, 以引物对 APF和
APR 扩增芥菜 AP1 基因的编码序列。PCR 扩增程序均为
95℃ 1 min; 95℃ 20 s, 58℃ 20 s, 72℃ 30 s, 35个循环;
72℃ 5 min。PCR产物经 1%琼脂糖电泳后回收 AP1目的
条带, 与 pEASY-Blunt Simple Cloning Vector 22℃连接 15
min, 转化宿主菌 JM109, 经菌液 PCR 和酶切鉴定后挑选
正确的克隆送上海英骏生物技术有限公司测序。
FLC 基因克隆所用芥菜种质材料、引物、PCR 扩增
程序以及最终获得的 FLC核苷酸序列等, 均与汤青林等[22]
完全相同。因此, 直接采用汤青林等[22]构建的原核表达载
体 pET43.1a-FLC作为后续试验。
1.3 表达质粒的构建与重组蛋白诱导
提取目的基因质粒, 经 BamH I 和 Kpn I 双酶切后,
将 AP1 编码序列定向插入载体 pET43.1a, 重组质粒转化
大肠杆菌 JM109, 提取质粒经 BamH I/Kpn I双酶切鉴定和
华大基因公司测序验证 , 构建正确质粒并命名为
pET43.1a-AP1, 并转化宿主菌 BL21。挑取单菌落, 接种于
含有 50 μg mL–1 氨苄青霉素 1 mL LB液体培养基, 37℃
振荡培养过夜。次日, 过夜培养物按 1∶100扩大培养, 当
OD600在 0.8~1.0 时加入 IPTG, 按照 L9 (34)正交设计筛选
融合蛋白表达条件(表 1), 诱导完成后收集细胞用于电泳
检测表达情况和重组蛋白纯化。

表 1 IPTG诱导原核表达条件的正交设计表
Table 1 L9(34) orthogonal layout of IPTG induction conditions
编号
No.
因素
Factor
温度
Temperature
(℃) (A)
浓度
Concentration
(mmol L–1) (B)
时间
Time
(h) (C)
1 A1B1C1 22 0.1 1
2 A1B2C2 22 0.5 2
3 A1B3C3 22 1.0 4
4 A2B1C3 25 0.1 4
5 A2B2C1 25 0.5 1
6 A2B3C2 25 1.0 2
7 A3B1C2 30 0.1 2
8 A3B2C3 30 0.5 4
9 A3B3C1 30 1.0 1

1.4 AP1与 FLC相互作用的体外检测
以 1.3 中确定的最佳条件培养含有 pET43.1a-AP1 的
BL21 (DE3), TOYOBO MagExtractor-His-tag-蛋白纯化试
剂盒纯化体外表达蛋白。以汤青林等[22]表达的融合蛋白
pET43.1a-FLC 为诱饵蛋白、优化诱导条件表达的
pET43.1a-AP1为靶蛋白(FLC和 AP1基因均来源于相同的
1330 作 物 学 报 第 38卷

芥菜材料“QJ”)。诱饵蛋白和靶蛋白的制备、Ni+剩余的假
阳性检测、蛋白提取液的配制参考汤青林等[22]的方法。
AP1与 FLC相互作用的检测程序如下: (1)取 5管, 每管取
5 mL pET43.1a-FLC表达菌液, 10 000×g离心 2 min收集细
胞, 加 1.5 mL 1×FastBreak Cell Lysis Reagent重悬细胞,
加 1 μL DNase后置 25 ℃摇床上摇 15 min; (2)各管分别加
15、20、25、30和 35 μL MagneHis Ni-Particles, 轻轻混
匀, 室温孵育 2 min, 用磁力架回收Ni-Particles再加 50 μL
蛋白提取液重悬; (3)悬浮液与 300 μL pET43.1a-AP1上清
液混匀, 室温孵育 2 min, 收集 Ni-Particles, 用结合/清洗
液(100 mmol L–1 HEPES pH 7.5, 10 mmol L–1 imidazole,
2~8 mol L–1 guanidine-HCl)洗 3次; (4)用 50 μL洗脱缓冲液
(100 mmol L–1 HEPES pH 7.5, 500 mmol L–1 imdazole)洗脱
蛋白, 电泳检测 Ni+ 与 AP1结合情况; (5)参照前 4步结果
离心收集 15 mL pET43.1a-FLC表达菌液中细菌, 用 5 mL
1×FastBreak Cell Lysis Reagent裂解细胞, 取 20 μL Mag-
neHis Ni-Particles 加入细胞悬浮液中, 轻轻混匀, 室温孵
育 10 min, 用磁力架回收 Ni-Particles, 加 50 μL蛋白提取
液重悬液; (6)取第 5步得到的悬浮液 20 μL检测 Ni+离子
是否有剩余 (以此作为对照 ): 20 μL 悬浮液与 200 μL
pET43.1a-AP1 上清液混匀 , 室温孵育 2 min, 收集
Ni-Particles, 用结合/清洗液洗 3次, 然后用 50 μL洗脱缓
冲液洗脱蛋白; (7)取第 5步中剩余 30 μL悬浮液与 200 μL
pET43.1a-AP1上清液混匀, 4℃孵育 2 h, 每隔 15 min混匀
一次; (8)孵育结束后用 200 μL 蛋白提取液洗 3 次, 然后
用 50 μL洗脱缓冲液洗脱蛋白。将各蛋白洗脱液加入等体
积的 2×样品缓冲液 100℃煮沸 5 min, 每样取 30 μL电泳
检测。
2 结果与分析
2.1 AP1克隆与序列分析
以长日照处理 35 d的芥菜茎端 RNA反转录成 cDNA
第一链为模板, APF和 APR为引物, 从芥菜中同源克隆的
AP1片段为 790 bp (图 1)。经 NCBI网上比对, 芥菜 AP1
与 花 椰 菜 (Brassica oleracea var. botrytis)和 拟 南 芥
(Arabidopsis thaliana)的 AP1同源性分别高达 94%和 93%,
表明确实获得了芥菜 AP1 目的基因。芥菜 AP1 含完整编
码区, 从起始子到终止子共编码 256 个氨基酸, 理论等电
点为 8.25。
蛋白结构域分析(http://pfam.sanger.ac.uk/)表明, AP1
属于MIKC型MADS域蛋白(图 2), 其中MADS结构域(M
域)位于第 9 位氨基酸到第 57 位氨基酸之间, 含有 2 个α
螺旋和 2个β折叠(其结构为αββα); K结构域位于第 77位
氨基酸到第 174位氨基酸之间, 含有 3个α螺旋。
在线氨基酸多序列比对 (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-
bin/npsa_automat.pl?page=npsa_clustalw.html)表明, AP1蛋
白的M结构域高度保守, 仅第 29位氨基酸不同(图 2), 该
位点位于M域的第 1个α螺旋内, 芥菜和拟南芥中该位点
均为亮氨酸 Leu, 而在花椰菜中为苯丙氨酸 Phe或者甲硫
氨酸 Met。K结构域有 6个不保守位点(第 87、122、141、
149、151和 156位点), 其中第 87位点存在于 K域的第 1
个α螺旋内, 第 122位存在于K域第 2个α螺旋内, 第 141、
149、151和 156存在于 K域的第 3个α螺旋内(图 2)。这
些不保守的氨基酸位点很可能决定着不同种属植物的
AP1蛋白与其他蛋白相互作用的特异性[21]。
AP1 蛋白序列分子进化树分析(Vector NTIAdvance
软件)显示, 芥菜 AP1基因编码的蛋白 BjAP1与拟南芥、
筷子芥、鼠耳芥、大豆、豇豆和花椰菜的 AP1 (AtAP1、
AlAP1、AhAP1、GmAP1、VuAP1和 BoAP1)亲缘关系较
远; 与荠菜 AP1(CbAP1)亲缘关系最近(图 3)。



图 1 AP1 cDNA的 PCR产物图
Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of the cDNA PCR products
of AP1
M: Trans 2K plus DNA marker; 1~2: AP1 RT-PCR产物。
M: Trans 2K plus DNA marker; 1–2: RT-PCR products of AP1.

2.2 表达质粒的构建与鉴定
构建的表达质粒 pET43.1a-AP1经 BamH I / Kpn I双
酶切, 电泳结果表明, 可得到 800 bp左右目标条带(图 4)。
将表达质粒送华大基因公司双向测序 , 结果 AP1 插入
pET43.1a 载体的位点和方向完全正确。采用汤青林等[22]
的融合质粒 pET43.1a-FLC。
2.3 重组蛋白的体外表达与检测
表达产物经 SDS-PAGE 检测发现 , 有重组蛋白
pET43.1a-AP1 的特异条带出现, 其蛋白质相对分子量与
预期值相符, 而空载体 pET43.1a 或者未诱导的重组子菌
液均不见此条带(图 5)。由此证明表达质粒 pET43.1a-AP1
构建正确, 且融合蛋白在大肠杆菌中成功表达。
另外 , 各泳道之间重组蛋白的表达量差异较大 , 说
明 IPTG 浓度和诱导温度对该蛋白表达量有影响。
pET43.1a-AP1 以 1 mmol L–1 IPTG 在 25℃诱导 2 h, 目
标蛋白表达量最高(图 5 中泳道 7, 箭头所指为融合蛋白
pET43.1a-AP1)。采用 TOYOBO MagExtractor-His-tag-蛋
白纯化试剂盒, 对体外表达的融合蛋白 pET43.1a-AP1 进
行纯化, 可得到目标条带。
2.4 AP1与 FLC相互作用的体外验证
为排除相互作用检测过程中可能由于没有完全与
pET43.1a-FLC 结合, 使得剩余的 Ni+又与 pET43.1a-AP1
第 7期 汤青林等: 芥菜 AP1基因体外表达及其与 FLC相互作用的验证 1331




图 2 AP1核苷酸序列编码
Fig. 2 Deduced amino acid of AP1
核苷酸大写部分为开放阅读框, 其上为相应氨基酸序列; 下画线表示上下游引物; 方框分别表示 M域和 K域; 箭头所指为 M或 K域
内不保守氨基酸。
The ORF is indicated with capital letter and its deduced amino acid sequences are shown on the top of cDNA sequence. The primers are un-
derlined. Boxes represent MADS domain and K domain. Arrows show the sites of nonconservative amino acids.



图 3 AP1蛋白分子进化树分析
Fig. 3 Phylogenetic tree of AP1
Ah、Al、At、Bj、Bo、Cb、Gm、Vu分别代表鼠耳芥、筷子芥、
拟南芥、芥菜、花椰菜、荠菜、大豆和豇豆的缩写。
Ah, Al, At, Bj, Bo, Cb, Gm, and Vu represent Arabidopsis halleri,
Arabidopsis lyrata, Arabidopsis thaliana, Brassica juncea, Brassica
oleracea var. botrytis, Capsella bursa-pastoris, Glycine max, and
Vigna unguiculata, respectively.

结合, 从而带来的假阳性结果, 试验设置 5 个 Ni+梯度(15、
20、25、30 和 35 μL MagneHis Ni-Particles), 参考汤青林
等 [22]和杨洋等 [23]的方法进行 Ni+剩余检测。结果表明 ,
pET43.1a-FLC表达菌液中加入 20 μL Ni+ 可排除 Ni+剩余
干扰。Ni+磁珠与 pET43.1a-FLC 融合蛋白结合后得到 50
μL Ni+ 磁珠悬浮液, 取其 20 μL悬浮液与 300 μL pET43.1a-
AP1 上清液室温孵育 2 min 的电泳结果见图 6 泳道 1, 只
有 pET43.1a-FLC融合蛋白条带, 没有 pET43.1a-AP1融合蛋
白条带, 说明 Ni+全部与 pET43.1a-FLC结合。


图 4 pET43.1a-AP1酶切电泳图
Fig. 4 Electrophoresis profiles of pET43.1a-AP1 digested by
restriction enzymes
M1: DL2000 DNA marker; 1: pET43.1a-AP1质粒对照; 2: BamH I
单酶切; 3: Kpn I单酶切; 4: BamH I / Kpn I双酶切; M2: Trans 2K
plus II DNA marker。
M1: DL2000 DNA marker; 1: pET43.1a-AP1 without digestion as
control; 2: recombinant digested by BamH I; 3: recombinant di-
gested by Kpn I; 4: recombinant digested by BamH I / Kpn I;
M2: Trans 2K plus II DNA marker.

融合蛋白 pET43.1a-FLC、pET43.1a-AP1经 TOYOBO
MagExtractor-His-tag-蛋白纯化试剂盒反复多次纯化(图 6
泳道 3、4 箭头所示), 尽管存在少量杂带, 但并不影响蛋
白互作试验的结果分析与判断。将上述剩余的 30 μL悬浮
液与 300 μL pET43.1a-AP1上清液 4℃孵育 2 h后的电泳
结果见泳道 2, 可以清楚地显示既有 pET43.1a-FLC 融合
蛋白条带(泳道 2中箭头 F)也有 pET43.1a-AP1融合蛋白条
带(泳道 2中箭头 A), 而对照泳道 1中没有 pET43.1a-AP1
融合蛋白条带, 说明 FLC与 AP1结合在一起, 并随 Ni+磁
1332 作 物 学 报 第 38卷



图 5 融合蛋白 pET43.1a-AP1不同诱导条件的 SDS-PAGE
电泳图谱
Fig. 5 SDS-PAGE patterns of fusion protein pET43.1a-AP1
expression under differrent conditions
M: protein marker B (TaKaRa); 1: 空载体诱导对照; 2~10: 不同
IPTG诱导条件对应表 1中 1~9 (泳道 7中箭头之处为
pET43.1a-AP1); 11: 未诱导对照。
M: protein marker B (TaKaRa); 1: induction control of pET43.1a;
2–10: different induction conditions of pET43.1a-AP1 correspond
with those from 1 to 9 in Table 1 (the arrow shows recombination
protein pET43.1a-AP1); 11: non-induction control.



图 6 pET43.1a-AP1与 pET43.1a-FLC相互作用的 SDS-PAGE
Fig. 6 SDS-PAGE of interaction of pET43.1a-AP1 and
pET43.1a-FLC
M: 蛋白质分子量标记; 1: Ni+剩余情况检测; 2: pET43.1a-AP1与
pET43.1a-FLC孵育产物; 3: 纯化的 pET43.1a-FLC; 4: 纯化的
pET43.1a-AP1。
M: protein molecular marker; 1: test of the rest Ni+ as control; 2:
product of pET43.1a-AP1 incubated with pET43.1a-FLC; 3: puri-
fied pET43.1a-FLC; 4: purified pET43.1a-AP1.

珠一起沉淀下来, 由此证实了两者间的相互作用。
3 讨论
本研究克隆的芥菜 AP1基因, 与拟南芥、花椰菜 AP1
相似性高达 90%以上, 编码含有 256个氨基酸的MIKC型
蛋白。其 MADS域有 49个氨基酸, 除了 M域第 1个α螺
旋内有 1 个氨基酸位点与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、
花椰菜(Brassica oleracea var. botrytis) AP1 蛋白不同外,
其他位点完全相同; 而 I域(位于结构域M与 K之间)完全
保守; K域则具有 6个氨基酸位点不保守, 分布于 K域的
3 个连续亲水α螺旋内; C 域(位于 K 域之后)具有 14 个位
点不保守。可能正是这 4个α螺旋和 C域内的不保守氨基
酸位点决定着不同种属植物的 AP1 蛋白与其他蛋白互作
的特异性 , 在蛋白相互作用形成蛋白复合物中可能起着
调节作用 [24], 但仍然未知蛋白相互作用形成多聚体的精
细作用以及特异性识别的目标位点。
本研究成功克隆了芥菜 AP1, 与拟南芥和花椰菜
AP1相似性分别高达 93%和 94%, 编码的蛋白 AP1, 又与
模式植物拟南芥的另一个 MIKC 型开花调节蛋白 CAL
(CAULIFLOWER)高度相似(NCBI 登录号 NM_102395),
其相似性得分(bitscore)高达 447.3 (http://string.embl.de/);
还与白菜、花椰菜 CAL 蛋白也有较高的相似性。这暗示
AP1 与 CAL 蛋白二者在开花调节功能上可能具有一定的
相似性和冗余性 [25-27], 但有待进一步克隆芥菜 CAL, 与
AP1进行功能对比研究。
AP1 是花分生组织决定因子 , 目前已发现它能与
CAL、AGL24、SOC1、SEP3、SVP和 AP3等多种 MIKC
型蛋白发生相互作用[25-26,28-29], 同时也预测 AP1 能够与
FLC发生相互作用[21], 但之前未证实这一作用。本试验将
芥菜体外原核表达蛋白 pET43.1a-AP1 作为靶蛋白, 与诱
饵蛋白 pET43.1a-FLC 相互作用。巧妙利用融合蛋白中
6×His标签能与Ni+结合的特性, 将诱饵蛋白与靶蛋白 4℃
孵育后, 利用 pET43.1a-FLC 上结合的 Ni+与磁力架吸附
性 , 纯化诱饵蛋白与靶蛋白的异源复合体 , 并经 SDS-
PAGE检测到了两条目标蛋白, 由此证明芥菜 AP1与 FLC
蛋白存在相互作用。
本试验 AP1与 FLC结合产物经过 3次纯化洗涤, 仍
能检测到这两者的相互作用, 表明 AP1 与 FLC 之间的相
互作用并不是瞬间发生 , 而应是两者结合并形成稳定的
异源复合体。
FLC 与 SVP 同属于开花路径核心抑制因子, 本试验
巧妙利用体外原核蛋白表达系统 , 证实了芥菜开花路径
核心抑制子 FLC与 AP1存在稳定的相互作用。在此之前,
Gregis 等[25]利用酵母双杂证实了另一开花抑制子 SVP 也
能与AP1相互作用, 从而维持花分生组织形态, 抑制花器
官形成[30]。那么 AP1-FLC蛋白复合物是否与 AP1-SVP复
合物具有相似的功能？AP1-FLC 复合物对该功能的实现
又有怎样的贡献？这些都有待进一步研究。
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