全 文 ：　　
第 27 卷 第 2 期 作　物　学　报 V o l. 27, N o. 2
2001 年 3 月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA M ar. , 2001
小麦 T、K、V 型胞质不育系和杂种m tD NA 的 RAPD 分析及
育性相关片段的克隆Ξ
孙兰珍　姚方印ΞΞ　李传友　李利斌　刘保申　高庆荣
(山东农业大学农学系, 山东泰安 271018)
提　要　用RA PD 技术对细胞质分别来源于粘果山羊草 (A e. kotschy i)、偏凸山羊草 (A e. ven tricosa)、
提莫菲维小麦 (T. tim op heev ii) 的三种普通小麦雄性不育系22K 型、V 型、T 型及相应的保持系、恢复
系以及杂种 F 1 代的线粒体DNA (m tDNA ) 进行了比较分析。结果如下: (1) 发现在m tDNA 组织结构
上 K 型、V 型、T 型不育系之间以及与保持系之间均呈现差异, 这从DNA 水平上提供了三类不育系
胞质来源不同的证据; (2) 利用 23 个引物的扩增结果进行了聚类分析, 绘制出了 T 型、K 型、V 型三
种不育系、保持系和 K、V 型共同的恢复系及杂种 F 1 代树式遗传关系图; (3) 对两个特异的多态性
DNA 片段进行了回收, 克隆、并制备探针, Sou thern 杂交结果显示不育系与保持系间存在多态性, 有
两个片段可能与育性有一定的联系。
关键词　普通小麦 (T. aestivum ) ; 细胞质雄性不育; 线粒体DNA ; RA PD 分析
RAPD Ana lys ing of CM S-T, K, V m tD NA s and Clon ing of m tD NA
Fragm en ts A ssoc ia ted w ith CM S-K in W hea t
SUN L an2Zhen　YAO Fang2Y in　L I Chuan2You　L IL i2B in　L IU Bao2Shen
GAO Q ing2Rong
(D ep artm en t of A g ronomy , S hand ong A g ricu ltu ra l U niversity , T aian, S hand ong 271018, Ch ina)
Abstract　　M itochondria l DNA s (m tDNA s) from th ree types of cytop lasm ic m ale sterility
lines (CM S2K, 2V and 2T ) in w heat, of w h ich the cytop lasm derived from A e. kotschy i,
A e. ven tricosa and T. tim op heev ii, respect ively, w ere com pared am ong CM Ss and their
m ain ta iner, resto rer and hyb rids of CM S2K and 2V. T he resu lts ind ica ted tha t: ( 1) the
m tDNA s from CM S2K, 2V and 2T w ere d ifferen t from each o ther and from their m ain ta iner,
th is p rovided som e evidence a t m o lecu lar level fo r th ree k inds of CM S lines w ith d ifferen t
cytop lasm s; (2) the genet ic dendrogram w as m ade and the rela t ive genet ic d istance am ong 7
differen t w heat m ateria ls w as ca lcu la ted by clu ster ana lysis w ith am p lif ica t ion p roducts from
23 p rim ers; (3) tw o specif ic fragm en ts of m tDNA w ere then cloned in to p lasm id vecto r and
converted in to R FL P p robes. Sou thern hyb rid iza t ion pat tern s revea led po lym o rph ism
betw een sterile line and m ain ta iner line .
Key words　　W heat (T. aestivum ) , Cytop lasm ic m ale sterility (CM S) , M itochondria l DNA
(m tDNA ) , RA PD analysisΞΞΞ 现工作单位: 山东省农业科学院水稻研究所
收稿日期: 2000202222, 接受日期: 2000206216
Received on: 2000202222, A ccep ted on: 2000206216国家自然科学基金 (39570452)资助课题。

在小麦CM S 研究中[ 1～ 8 ], 也倾向于m tDNA 对雄性不育具有决定性的影响。刘忠松对线
粒体和叶绿体离体翻译产物研究的结果表明, 小麦CM S 与线粒体直接有关, 而与叶绿体的
关系不大[ 9 ]。Q uetier 等对小麦雄性不育系与其保持系的线粒体DNA 限制性内切酶酶切图谱
分析表明二者存在显著差异[ 10 ]。M oh r. S 等的研究发现小麦 T 型不育系的线粒体基因组中
含有一个 a tp 6 拷贝, 而普通小麦则含有两个 a tp 6 拷贝, 因此, 把普通小麦细胞核引入 T 型
细胞质时, 可导致核质不协调而产生雄性不育[ 11 ]。Song. J 的研究表明, 位于 cox É 基因上游
的OR F256 只存在于提莫菲维小麦、T 型不育系和 T 型杂种的细胞质中, 而在普通小麦中未
发现, 而且OR F256 只在 T 型不育系中表达成蛋白质[ 12 ]。李传友等对小麦 T 型、K 型、V 型
不育系和吴敏生等对 T 型不育系的m tDNA 进行了酶切电泳和R FL P 分析, 发现不育系和保
持系的m tDNA 在结构上存在显著差异[ 13, 14 ]。
寻找和鉴定与CM S 相关的线粒体基因是当前植物CM S 机理研究的核心。以前同类研究
的基本思路是通过比较不育系和相应保持系m tDNA 的结构及表达的差异而确定雄性不育基
因。研究结果表明, 仅有这种比较很难找到与 CM S 有关的线粒体基因。CM S 是一个质核互
作的遗传性状, 在比较不育系和保持系m tDNA 的同时, 还需比较不育系与其杂种 F 1 代
m tDNA 及其表达的差异, 从而把雄性不育2育性恢复作为一个有机的整体来考虑将有利于寻
找不育基因或其相关调控基因[ 15 ]。本研究利用RA PD 技术对当前公认的最有应用前景的小麦
K 型、V 型和 T 型不育系及其相应的杂种 F 1 代、保持系及恢复系的m tDNA 进行比较分析。
1　材料与方法
1. 1　材料　　K149A、V 149A 和 T 149A 三种不育系的胞质分别来源于粘果山羊草 (A e.
kotschy i)、偏凸山羊草 (A e. ven tricosa )和提莫菲维小麦 (T. tim op heev ii) , 它们都是以 149 为
父本回交 10 代以上培育而成, 三者共同保持系 149B 的胞质为普通小麦 (T. aestivum ) ;
L K783 对 K、V 型两种不育系有很强的恢复能力, 其胞质为 T. aestivum ; 另有试验材料杂种
KF 1 (K149A öL K783)和V F 1 (V 149A öL K783)。
1. 2　方法
1. 2. 1　线粒体DNA 的提取、纯化　　参照已有方法[ 16 ] , 本实验室略作修改, 取黄化苗 100g
高速搅拌后, 4 层纱布过滤, 线粒体经差速离心沉淀, DN ase 法纯化, 线粒体裂解后, 用氯仿
抽提, m tDNA 经 p ro teinase K 处理、纯化后, 加 T E 溶解。
1. 2. 2　RA PD 扩增　　RA PD 反应在 0. 5 mL 离心管中进行, 在 PER K IN 2EL EM ER
PCR 480 仪器上自动循环. PCR 25 ΛL 反应体系如下: DNA 20 ng, 10×buffer 2. 5 ΛL , 1
mm o löL dN T P s 3 ΛL , 25 mm o l öL M gC l2 2. 5 ΛL , 10 Λm o löL P rim er 1 ΛL , T aq 酶 1. 5
un its, H 2O 11 ΛL。反应循环条件: 95℃ 3 m in 预变性, 然后 94℃ 1 m in, 38℃ 1 m in, 72℃
1. 5 m in, 36 个循环后进入 72℃ 5 m in 延伸, 扩增产物用 1. 4% 琼脂糖凝胶电泳, 用溴化乙锭
染色, 紫外灯下观察, 照像。
1. 2. 3　RA PD 多态性片段的回收和克隆　　用 Gene clean 试剂盒从琼脂糖凝胶上回收多态
性RA PD 扩增产物, 回收后的 PCR 产物克隆于 pGEM ○R 2T Easy V ecto r 系统中, 酶切鉴定插
入片段。
1. 2. 4　R FL P 分析　　用于R FL P 分析的总DNA 提取与纯化, Sou thern 转移及分子杂交均
参照 Zhang 的CTAB 法[ 17 ]。
5412 期　孙兰珍等: 小麦 T、K、V 型胞质不育系和杂种m tDNA 的RA PD 分析及育性相关片段的克隆　　　　

2　结果与分析
2. 1　7 个材料m tD NA 的 RAPD 分析　　在本实验所建立的反应条件下, 小麦m tDNA 的
RA PD 扩增产物一般有 1～ 9 条谱带, 分子量范围在 300～ 3400 bp 之间。共用 100 个Operon
引物对 7 个材料的m tDNA 进行了扩增, 其中 23 个引物在 7 个材料间扩增出了稳定的、可重
复的多态性。为了将多态性转化为数量上的关系, 将 RA PD 分析结果进行数据处理。在
RA PD 产物电泳图谱上不同分子量的条带代表线粒体基因组上的不同位点, 7 个材料中有某
特定条带记为 1, 没有的记为 0, 将 23 个引物的扩增结果转化为 0- 1 型数据, 并根据公式
Gsij= 2N ij ö(N i+ N j ) [ 18 ]计算两个材料间的遗传相似性 (N ij为两材料共有的条带数, N i+ N j 为
两材料扩增的总带数)。将 0- 1 型数据输入计算机用类平均数法 (U PGM A 软件) 进行聚类分
析, 得到 7 个材料的树式遗传关系图及遗传距离 (图 1)。
图 1　　小麦 7 个材料m tDNA 的树式遗传
关系图及其遗传距离
F ig. 1　　Genetic relat ionsh ip dendrogram and
genetic distance among m tDNA s of 7
differen t w heat m aterials
　　由图 1 可以看出, 7 个材料可分为四组。
K149A 与其杂种 F 1 代分为一组; V 149A 与其
杂种分为一组; 保持系 149B 和恢复系L K783
分为一组; T 149A 单独分为一组。这一聚类结
果很好地体现了 7 个材料的胞质来源关系。通
常认为父本细胞质不参与受精过程, 杂种 F 1
代与其母本具有相同的细胞质, 因此 K、V 型
不育系分别与其杂种 F 1 代聚为一类; 保持系
149B 和恢复系 L K783 都含有普通小麦细胞
质, 因此聚为一类; 三类不育系相比较, K、V
型不育系的细胞质都来自山羊草属, 二者亲缘关系更近一些。
2. 2　三类不育系之间以及不育系和保持系间m tD NA 的比较　　从RA PD 扩增图谱上看 (图
2) , 三类不育系的线粒体DNA 存在明显的差异。聚类结果也把 T、K、V 三个不育系分在不
图 2　　7 个材料m tDNA 的RA PD 扩增结果
F ig. 2　　Amp lified p roducts from m tDNA s of 7 m aterials using p rim er O PB- 20 and O PB205
M 为分子量标准 (ΚDNA öE coR I+ H indË )
1. V 149A ; 2. V F1; 3. L K783; 4. 149B; 5. K149A ; 6. KF1; 7. T 149A
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同的类群中 (图 1)。这就从分子水平上提供了三类不育系胞质来源不同的证据。这与李传友
等[ 13 ]对该三类不育系m tDNA 的R FL P 分析结果一致。另外, RA PD 分析结果也表明三类不
育系与其共同的保持系B 相比, m tDNA 也存在明显的多态性。
如前文所述, T、K、V 三个不育系是以B 为轮回亲本, 经过 10 代以上的回交选育而成
的, 就是说 T、K、V 及B 的核遗传背景相同而胞质来源不同, 四者在雄性育性上表现出的差
异, 应该取决于细胞质基因的作用或细胞质基因与核基因的相互作用。RA PD 分析结果揭示
出 4 个材料的m tDNA 存在明显的差异。由此不难推测, m tDNA 与 T、K、V 型CM S 的形成
有某种特定的联系。
2. 3　K 型不育系与其杂种 F1 代m tD NA 间多态性RAPD 产物的克隆　　用RA PD 分析很容
易找出不育系与保持系m tDNA 之间的差异, 因为不育系与保持系的胞质来源是不同的。但
要在这众多的差异中鉴定出真正与CM S 有关的差异片段是困难的。我们认为不育系与其杂
种后代m tDNA 应该是相同的, 其雄性不育性的恢复是核恢复基因对不育因子进行调控作用
的结果。如果不育因子确实存在于m tDNA 上, 那么比较杂种 F 1 代和其母本不育系m tDNA
的差异, 就反映了恢复基因引入前后不育系m tDNA 的变化, 这种变化就极有可能与CM S 有
关。H e. S [ 19 ]等的研究表明, 大豆 CM S 是由m tDNA 上的特异序列 p vs (p haseolus vu lg a ris
sterility ) 决定的, 而在杂种 F 1 代中, 由于核恢复基因的引入, p vs 序列缺失, 从而育性恢复。
受该研究结果的启示, 我们筛选了大量的引物试图检测 K 型不育系与其杂种 F 1 代m tDNA
的多态性, 来证实不育系在引入恢复基因后m tDNA 的结构发生了变化。虽然一些引物的扩
增产物在不育系和保持系之间表现差异, 但在不育系和 F 1 代之间却没有差异。令人感兴趣的
是在引物O PB 220 的扩增图谱上, K149A 的扩增产物比其 KF 1 多一条分子量约为 830bp 的
扩增片段, 记为O PB 220830 (图 2) ; 在引物O PB 205 的扩增图谱上, KF 1 比 K149A 多一条分子
量为 800bp 的扩增片段, 记为O PB 205800 (图 2)。将这两差异片段从琼脂糖胶上回收, 用 Gene
clean 试剂盒纯化, 纯化后的多态性片段按厂家的说明克隆于 pGEM ○R 2T Easy vecto r 系统中。
图 3　　两个重组质粒经酶切的电泳结果
F ig. 3　　E lectropho retic resu lt of 2 recom binant
p lasm ids digested by E coR É
M 为分子量标准 (ΚDNA öE coR É + H indË )
1. Recom binant p lasm id contain ing a fragm ent of O PB220830
2. Recom binant p lasm id contain ing a fragm ent of O PB205800 图 4　O PB220830öE coR É 和O PB205800öE coR É 检测小麦CM S 材料线粒体DNA 的RFL PF ig. 4　RFL P patterns detected w ith O PB220830öE coR Éand O PB205800öE coR É on m tDNA s of CM S w heat1: T 149A , 2: L K783, 3: 149B, 4: K149A ,5: KF1, 6: V 149A , 7: V F1
7412 期　孙兰珍等: 小麦 T、K、V 型胞质不育系和杂种m tDNA 的RA PD 分析及育性相关片段的克隆　　　　

克隆的重组质粒经 E coR É 酶切, 证明两重组质粒的酶切插入片段中分别有 800 bp 和 830 bp
这两个片段, 且分别与O PB 205 和O PB 220 扩增图谱箭头指明的片段大小相吻合, 图 3 显示
了重组质粒的酶切验证结果。
2. 4　以OPB-20830和OPB-05800两片段为探针的 Southern 杂交结果　　用O PB 220830和O PB 2
05800两片段为探针分别与 E coR É 酶切的总DNA 进行分子杂交 (图 4)。结果 K、V 型不育系
与保持系存在明显差异, 而 T 型不育系的线粒体DNA 与保持系和恢复系却没有明显区别,
这可能是由于提莫菲维小麦与普通小麦的亲缘关系比粘果山羊草 (和易变山羊草)与普通小麦
的亲缘关系更近一些, 提莫菲维与普通小麦线粒体DNA 存在着较小的差异, 这一点也可从
我们所用 7 个材料的树式遗传图 (图 1)中看出。而 K、V 型不育系与 KF 1、V F 1 的杂交图谱相
同。利用R FL P 分析未找到不育系m tDNA 与 F 1 杂种m tDNA 的差异, 这可能是由于所用内
切酶未能切开m tDNA 差异部分或虽被切开, 但与其他片段分子量相同而被掩盖。尽管没有
找到不育系与其 F 1 杂种m tDNA 的差异, 但是并不排除用更多的酶切找到不育系与其 F 1 代
之间差异的可能性。
参　考　文　献
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