全 文 ：第 26 卷 第 6 期 作　物　学　报 V o l. 26, N o. 6
2000 年 11 月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA N ov. , 2000
提高马铃薯原生质体细胞分裂频率的研究X
李　韬XX 　戴朝曦XXX
(甘肃农业大学农业生物工程研究所, 甘肃兰州, 730070)
提　要　为了提高马铃薯原生质体培养时的细胞分裂频率, 对原生质体游离、纯化, 培养过程中的几
个重要环节进行了研究。结果表明: 以蔗糖作为渗透压调节剂游离原生质体时, 原生质体的损伤小、
活力好、分裂频率高、原生质体自发融合频率低; 采用看护培养时, 在同一属内, 马铃薯物种的异同,
饲养层愈伤组织与培养细胞的亲缘关系的远近, 对饲养效果并无显著影响; 进行单个原生质体培养时
加入 1. 2% 的马铃薯块茎浸提液可明显提高细胞分裂频率; 酶的纯度也是影响原生质体游离效果的重
要因素之一。
关键词　马铃薯; 原生质体; 细胞分裂频率
Stud ies on Im prov ing the Cell D iv is ion Frequency of Pota to
Protopla sts
L I T ao　DA I Chao2X i
(A g robiotechnology Institu te, Gansu A g ricu ltu ra l U niversity , L anz hou , 730070)
Abstract　T he low cell d ivision frequency of the p ro top lasts is one of the m ain p rob lem s in
po ta to p ro top last m an ipu la t ion. T he p resen t stud ies a im ed at so lving the p rob lem. T he
resu lts show ed tha t the p ro top lasts had good vigo r, h igh cell d ivision frequency and low cell
selffu sion frequency as w ell as less cell dam age frequency w hen sucro se w as u sed as o som o tic
regu la to r du ring the iso la t ion of p ro top lasts. U sing nu rse cu itu re system , the cell d ivision
frequency of p ro top lasts cou ld be increased bu t no sign if ican t effects cou ld be found from
differen t po ta to species and differen t b lood rela t ion sh ip to the cu ltu re resu lts. U sing sing le
p ro top last cu ltu re system , good resu lts w ere a lso ob ta ined w hen the 1. 2% po ta to tuber
ex tract ion so lu t ion w as supp lied in to the m edium. T he pu rity of the enzym es u sed to iso la te
p ro top lasts w as a lso one of the im po rtan t facto rs w h ich affect the yield and the vigo r of
p ro top lasts.
Key words　Po ta to; P ro top last; Cell d ivision frequency
马铃薯 (S olanum tuberosum L. )是粮菜兼用型作物, 原生质体的培养在遗传操作及育种
研究中有着重要的意义, 它既是体细胞融合与杂交的基础, 同时也是获得体细胞变异的一个
重要手段。马铃薯原生质体培养最早获得成功的是美国的 Shepard [ 1 ]。截止目前, 马铃薯原生
质体培养取得了很大进展, 共有 80 多个品种或品系的马铃薯原生质体培养再生了植株[ 2 ] , 其
中包括四倍体栽培品种、双单倍体品系和野生种。原生质体来源于不同的器官或组织, 以叶
片来源的最多, 此外还有悬浮培养的细胞、芽、叶柄、块茎贮藏细胞、根尖和实生苗子叶及下
X
XX
XXX 联系人
收稿日期: 1999206203, 接受日期: 2000201215
现在地址: 扬州大学农学院农学系, 江苏扬州, 225009。
国家自然科学基金资助项目; 国家“九五”重点科技攻关资助项目。

胚轴。因此, 马铃薯是原生质体培养再生植株涉及品种最多的作物[ 3 ]。虽然前人在原生质体
研究中做了许多富有成效的研究工作, 但是原生质体的操作技术还不完善, 有许多方面的问
题仍需解决, 主要是原生质体的得率和分裂频率较低, 操作重复性差。本文对原生质体游离、
纯化、培养过程中的几个重要环节进行了比较深入的研究, 旨在进一步改善原生质体的生理
状态, 提高原生质体的得率、细胞分裂频率和实验结果的重复性。
1　材料和方法
1. 1　材料的来源及繁殖
实验材料来源于甘肃农业大学农业生物工程研究所用花药培养法产生的普通栽培种
(S olanum tuberosum L. ) 双单倍体品系 84237 (2n = 2x = 24) , 一个二倍体野生种 S olanum
bu lbocastanum (2n= 2x= 24) 和一个四倍体栽培品种 R u sset Bu rbank (2n= 2x= 48) 的无菌试
管苗。
材料的繁殖采用带有 1～ 2 个腋芽的茎切段扩大繁殖的方法, 以继代培养 15～ 25d 的无
菌试管苗的中上部幼嫩叶片作为游离原生质体的供体材料。同时取上述三种材料的一部分,
分别以其无菌苗叶片为外植体来源诱导愈伤组织。以培养 30d 左右形成的具有旺盛分裂能力
的愈伤组织作为看护培养时原生质体的饲养层。所有材料均置于 25±2℃、2000lx 连续光照
的培养室中培养。
1. 2　原生质体的游离
在无菌条件下, 分别剪取继代培养 15～ 25d 的无菌试管苗中上部幼嫩叶片约 1. 0g, 放入
一 60 mm ×15 mm 的培养皿中, 将 10 mL 酶液 (表 1) 用装有孔径为 0. 2Lm 微孔滤膜的细菌
过滤器过滤两 次 (第一次用单层膜, 第二层用双层膜)。然后将酶液倒入培养皿中, 材料在酶
表 1　　酶液组成成分
Table 1　　Composition of enzyme solution
组成成分
Components
浓度
Concentration
纤维素酶 (Cellu lase R 210) 1. 2%
离析酶 (M acerozym R 210) 0. 3%
聚乙烯吡咯烷酮 (PV P10000) 2. 0%
2- N - 吗啉乙烷磺酸 (M ES) 3. 0 mmo lö L
酪蛋白水解物 (CH ) 0. 01%
渗透压调节剂 (O somo tics) 1) 0. 30 mo lö L
pH 5. 6
　　注: 1) 分别为蔗糖、甘露醇, 以及 1 ö 3 葡萄糖
+ 2 ö 3 甘露醇。
　　N o te: 1) T hey are sucro se m annito l and 1 ö 3
gluco se + 2 ö 3 m annito l, respectively.
液中剪碎后连同酶液一起倒入 15 mL 的抽滤瓶中,
用真空抽气泵在压力为 0. 05M Pa 下抽气使酶液渗
进组织, 直至在组织的边缘和表面不冒气泡为止,
约需抽气 10m in。然后将组织和酶液转入另一 60
mm×15 mm 的培养皿中, 用 Parafilm (石蜡薄膜)
封口后, 置于可调温摇床上, 在 25～ 30℃、40r ö m in、
黑暗或弱光条件下轻摇 6～ 8h, 在原生质体游离终
止前 2h 用镊子夹挤或用解剖针撕裂未被酶液消化
的大块组织, 降低摇床速度至 20r ö m in, 继续轻摇
2h 后纯化原生质体。
1. 3　原生质体的纯化
原生质体的纯化采用漂浮法和沉降法相结合
的方法[ 2 ]。
1. 4　原生质体的培养
1. 4. 1　液体浅层静止培养　　将上述纯化后的原生质体分别用原生质体培养基 RA [ 4 ]调整,
使其密度为 1×104 个ö mL , 然后移入 15 mm ×10 mm 的小培养皿中, 用 Parafilm 封口, 在
23±2℃、黑暗条件下静止培养。培养两周后, 在倒置显微镜下统计细胞分裂频率, 此后每隔
两周补充新鲜等渗的原生质体培养基RA 少许。
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1. 4. 2　看护培养　　分别在三个 60 mm ×15 mm 的培养皿底部铺一层愈伤组织诱导培养基
C I(M S+ 2. 0 m g ö L NAA ) , 将预先由双单倍体 84237, 二倍体野生种 S olanum bu lbocastanum
及四倍体栽培品种R u sset Bu rbank 诱导 30d 左右的小愈伤组织, 用无菌镊子轻轻分成直径
约为 4 mm 的小颗粒状, 分别均匀接种于 3 个不同培养皿中的愈伤组织诱导培养基上, 其上
铺上无菌的双层滤纸, 滤纸孔径小于原生质体直径且滤纸边缘略高于培养基平面。调整悬浮
液中原生质体的密度至 1×102 个ö mL 左右, 然后用吸管转移原生质体悬浮液至滤纸上。悬
浮液液面不得高于滤纸边缘, 以免分散的愈伤组织单细胞和小细胞团混杂于原生质体悬浮
液。用 Parafilm 封口后, 置于 23±2℃、黑暗条件下静止培养, 培养 2 周时, 用吸管吸取悬浮
液 0. 2 mL 置于倒置显微镜下统计细胞分裂频率, 此后每隔一周补充新鲜降渗 (约 0. 025
m o lö L )的原生质体培养基少许。
1. 5　单个原生质体的培养
将塑料多孔细胞培养板 (8×12 个孔柱)在 75% 的酒精溶液中浸泡 2h, 然后用无菌水冲洗
2～ 3 次, 置于超净工作台上吹风兼紫外线照射 30m in 后备用。
培养方法: 将纯化的原生质体悬浮液调整成密度为 1×102 个ö mL 后, 分两次各吸取 1
mL , 分别用原生质体培养基RA 和修改后的原生质体培养基 RA (附加 1. 2% 的马铃薯块茎
浸提液) 稀释 50 倍, 用微吸管每次吸取稀释后的原生质体悬浮液约 0. 5 mL 注入细胞培养板
的孔中, 盖上盖子后, 置于倒置显微境下标记出只有单个原生质体的孔柱, 将其在 23±2℃、
黑暗条件下培养, 培养 2 周时统计单个细胞的分裂频率。
2　结果与讨论
2. 1　不同种类的渗透压调节剂对原生质体游离、纯化和培养的影响
在以往关于马铃薯原生质体培养的报道中, 不同研究者使用蔗糖[ 6～ 8 ]或甘露醇[ 13 ]作为渗
透压调节剂, 有的还加入了葡萄糖[ 5, 6 ]。由于这些研究都是用不同基因型材料作为原生质体
的供体, 且在不同的条件下进行的, 所得结果无法进行比较。为了比较这三种类型的渗透压
调节剂在马铃薯原生质体游离、纯化及培养过程中的优劣, 本研究采用同一基因型的相同组
表 2　　不同类型渗透压调节剂对原生质体细胞分裂频率的影响
Table 2　　Efffects of differen t osomotics on protoplast div ision frequency
渗透压调节剂类型
T ypes of o somo tics
原生质体的细胞分裂频率1)
Cell division frequency of p ro top lasts (% )
平均2)
A verage (% )
蔗糖 Sucro se 27. 0 23. 1 19. 4 23. 2a
甘露醇+ 葡萄糖
M annito l+ Gluco se
11. 5 22. 0 19. 6 17. 7ab
甘露醇M annito l 14. 4 9. 3 10. 6 11. 4b
　 　注: 1) 所有的原生质体培养细胞均来自双单倍体品系 84237, 并用液体浅
层培养。
2) 采用邓氏新复极差法进行差异显著性测验, 凡数字后面有相同字
母者表示差异未达到 5% 显著水平。
　 　N o te: 1) A ll the p ro top lasts cam e from the dihap lo id strain 84237 and
cultu red in th in layer so lu tion m edia.
2) T he num bers of average fo llow ed by sam e letter m ean that no
sign ifican t difference at 5% level by D uncan′s m ultip le range test.
织作为原生质体的供体材料,
在其它条件均相同的情况下,
对这三种不同的渗透调节剂的
游离效果进行了对比实验, 结
果列于表 2。结果表明: 以蔗糖
作为渗透压调节剂明显地优于
甘露醇和葡萄糖+ 甘露醇。其
原因可能是由于蔗糖分子较大,
在同样的渗透压下具有较高的
浮力, 原生质体一旦游离出来
就漂浮于酶解液表面, 减少了
用分子量较小的甘露醇或甘露
醇加葡萄糖作为渗透压调节剂
时由于原生质体沉底使原生质
5596 期　　　　　　　　　　李　韬等: 提高马铃薯原生质体细胞分裂频率的研究　　　　　　　　　　　　

体与未解离的碎片发生碰撞而破裂的损失。此外, 甘露醇只能作为原生质体游离的渗透压调
节剂, 而不能为细胞吸收利用, 而蔗糖和葡萄糖可被细胞吸收作为碳源加以利用, 这对于较
长时间游离原生质体时保持细胞的旺盛生活力是比较有利的。用蔗糖作为渗透压调节剂的缺
点是: 由于蔗糖会被细胞吸收, 若游离时间过长会使渗透压降低, 从而引起部分原生质体破
裂, 因此, 掌握好游离时间是十分重要的。由于以不同基因型材料或同一基因型不同组织作
为供体游离原生质体时, 细胞的渗透压变化较大, 不是一个固定的数值, 究竟用多大渗透压
和多长的游离时间只能根据实验中的多次观察确定。以甘露醇作为渗透压调节剂时, 原生质
体游离时间若超过 6h, 原生质体之间会发生不同程度的粘连现象, 这可能是因为长时间的游
离使得原生质膜表面的电荷发生改变, 从而导致膜极性的改变而发生的。据我们多次的观
察, 发生粘连的原生质体对纯化漂浮和以后的培养均会产生不利的影响。但以蔗糖作为渗透
压调节剂时, 即使游离时间长达 12h, 对原生质体的培养效果并没有显著影响。此外, 用蔗糖
作渗透压调节剂在原生质体纯化过程中可从酶液直接漂浮, 再经过用相同 (或较高) 渗透压的
蔗糖漂浮 2～ 3 次即可。不过以蔗糖作为渗透压调节剂进行漂浮离心时对离心力要求严格, 掌
握不好会浪费一部分较好的原生质体, 甚至根本漂不起来, 用甘露醇或甘露醇+ 葡萄糖作为
渗透压调节剂时, 最初只能用沉淀法, 然后再用价格较贵的 Perco ll 或 F ico ll 漂浮, 在经济性
方面也不如用蔗糖。
在不同类型渗透压调节剂下原生质体细胞的分裂频率以及差异显著性测验结果列于表
2, 表中每个数据为 10 个观察视野 (10×25) 的平均值。可以看出, 在原生质体来源、游离时
间及苗龄均相同的条件下, 采用不同类型渗透压调节剂时, 原生质体细胞分裂频率有显著差
异, 细胞分裂频率以蔗糖为调节剂时最高。
2. 2　看护培养时不同饲养层对原生质体细胞分裂频率的影响
原生质体培养方法也明显影响原生质体细胞的分裂频率, 已报道的培养方法可大致归结
为液体培养 (包括液体浅层静止培养、微滴培养、悬滴培养、微室培养等)、固体培养、看护培
养 (即饲养层培养)。液体浅层静止培养简单易行, 已被大多数研究者采用。固体培养在琼脂
糖包埋和更换培养基过程中, 很容易破坏原生质体, 并且琼脂糖包埋后空气交换受到影响,
对原生质体生长不利。看护培养虽然比较繁琐, 但原生质体细胞的分裂频率较高。据已有的
报道, 看护培养的看护层 (即饲养层) 有多种形式, 如核失活的原生质体、离散的细胞、悬浮
培养细胞、愈伤组织等[ 3 ]。我们以不同基因型来源的愈伤组织作为饲养层对同一来源的原生
质体的细胞分裂频率的影响进行了研究, 结果列于表 3。
表中所有数据也是 10 个观察视野 (10×25)的平均值。结果表明, 以同一属内的相同或不
同马铃薯种诱导产生的愈伤组织作为饲养层, 虽然其基因型不同, 但在其它条件均相同的情
况下, 原生质体细胞分裂频率并无显著差异。这一结果与一些研究者认为饲养层与培养细胞
只有在基因型保持一致的情况下饲养效果较好的观点不一致[ 3 ] , 其原因尚待进一步研究。
此外, 对表 2 和表 3 的数据进行比较可以看出, 在其它条件均相同的情况下, 采用看护
培养时原生质体的细胞分裂频率明显高于液体浅层培养时原生质体的分裂频率, 这可能是因
为饲养层愈伤组织能够提供给原生质体分裂时所需的天然营养物质, 其中某些成分是人工培
养基无法提供或没有提供的缘故。
2. 3　单个原生质体培养
单个原生质体的分离培养有着重要的理论和实践意义, 特别适用于原生质体得率极少的
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表 3　　饲养层愈伤组织的不同来源对原生质体分裂频率的影响
Table 3　　Effects of feeder layer ca ll i with differen t
or ig in on protoplast div ision frequency
饲养层愈伤组织来源
Callus o rigin
原生质体分裂频率1)
D ivision frequency of cells (% )
平均2)
A verage (% )
S. tuberosum L.
D ihap lo id strain“84237”(2x) 29. 2 30. 4 27. 3 29. 0a
cv. “Russet Burbank”(4x) 31. 7 31. 5 29. 0 30. 7a
S. bu lbocastanum. (2x) 32. 6 29. 8 35. 8 32. 7a
　　注: 1)和 2)同表 2。　　N o te: 1) and 2) are the sam e as tab le 2.
场合, 并且容易观察培养时原生
质体的分裂和分化以及植株再
生的过程, 还能得到单一的细胞
无性系。单个原生质体的分离和
培养最早由 Koop 等[ 9, 10 ]报道,
他们将烟草的单 个原生质体通
过手工操作转移到培养基中进
行微滴培养, 得到再生苗, 后来
单个原生质体的培养方法有了
表 4　　马铃薯块茎浸提液浓度对单个原生质体
培养中细胞分裂频率的影响
Table 4　　Effects of potato tuber extraction solution on cell
d iv ision frequency in single protoplast culture
浸提液浓度
Concentration of ex tracts (% )
分裂频率1)
Cell division frequency (% )
平均2)
A verage (% )
0. 0 0. 0 0. 4 0. 1 0. 2e
0. 4 8. 2 8. 4 7. 6 8. 1c
0. 8 11. 0 10. 4 10. 5 10. 6a
1. 2 12. 0 11. 8 10. 8 11. 5a
1. 6 9. 2 9. 5 9. 8 9. 5b
2. 0 5. 3 5. 3 6. 9 5. 8d
　　注: 1)和 2)同表 2。　　N o te: 1) and 2) are the sam e as tab le 2.
较大的改进[ 11, 12 ]。关于马铃薯单
个原生质体的分离和培养近年来
也 有 研 究 报 道, 如 H un t 和
H elgson [ 13 ] 在 Kao [ 12 ] 等的 KM 培
养
基的基础上进行修改并加入了
0. 1%～ 0. 2% 的脱脂肪酸牛血清,
用多孔培养板、半固体琼脂糖包埋
培养, 在普通栽培种和野生种
S olanum ca rd iop hy llum 中, 均高
频率地得到了单细胞无性系和植
株分化。本实验采用高度稀释的方法, 用附加了 1. 2% 的马铃薯块茎浸提液的原生质体培养
基以改善原生质体的营养状态。培养 48h 后观察, 绝大部分原生质体体积增大、细胞伸长、
颜色变浅, 在 72h 后发生第一次分裂, 培养 2 周时统计分裂频率, 可达 11. 5%。而培养基中
未加马铃薯块茎浸提液的原生质体几乎不分裂 (表 4)。加入马钤薯块茎浸提液之所以能够显
著提高细胞的分裂频率, 这是因为它不仅能够提供原生质体培养基中的营养成分, 而且还提
供了原生质体生长和分裂所需的其它天然营养物质, 其中某些成分是人工培养基无法提供或
没有提供的。此外, 培养基中马铃薯块茎浸提液的浓度不同, 细胞的分裂频率也有较大差异。
但加入马钤薯块茎浸提液的浓度若超过 1. 2% , 原生质体分裂频率反呈降低趋势, 且极易发
生出芽现象。一些研究者认为, 原生质体的出芽现象是原生质体抵御外界不良环境的正常生
理反应[ 5 ]。但根据本实验结果, 这种出芽的原生质体不再发生分裂, 培养 3～ 4d 后全部褐化
死亡。至于高浓度的马铃薯块茎浸提液导致出芽现象的原因, 有待于进一步探讨。单个原生
质体的操作和培养可为原生质体的微融合奠定坚实的基础。但根据笔者的实验观察, 原生质
体在游离过程中存在低频率的自发融合现象, 而且原生质体的渗透压调节剂不同, 自发融合
发生的频率也不相同, 以甘露醇作为渗透压调节剂时, 自发融合发生的频率高于以蔗糖作为
渗透压调节剂时的自发融合频率。因此, 在进行单个原生质体的操作时, 为了尽量减少这种
不必要的融合, 酶液的渗透压调节剂最好用蔗糖。
此外, 在实验中还观察到酶的质量也对原生质体的游离效果有重要影响。来自不同厂商
的酶的游离效果差异较大, 以日本产“ONA ZU KA ”牌的纤维素酶 (Cellu lase R 210) 配合以同
一厂牌的离析酶 (M acerozym e R 210) 效果较好。但即便是来自同一厂商的酶, 由于购买的时
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间不同, 其效果也有较大差异。由于确定酶的质量无具体指标, 因而只能从总的游离效果来
观察。根据我们的观察, 在其它条件均相同的情况下, 若用酶离解开的细胞几乎全部皱缩不
圆, 并且形状极不规则, 加无菌水数滴调节渗透压也毫无效果, 这在很大程度上可能是由于
酶的不纯引起的。因为若酶不纯, 其中含有少量蛋白酶或脂肪酶可溶解镶嵌在质膜上的蛋白
质或脂肪, 从而引起质膜不可逆性破裂, 导致了细胞内容物的泄漏而死亡。
参　考　文　献
1　Shepard J F, R E To tten. P lan t P hy siol, 1977, 60: 313～ 316
2　戴朝曦, 孙顺娣, 李继红. 农业科学集刊 (第二集) , 北京, 中国农业出版社. 1995, 144～ 151
3　李耿光, 张兰英. 见: 孙勇如, 安锡培主编. 植物原生质体培养. 北京, 科学出版社. 1991, 172～ 178
4　D ai Chaoxi, D. M ertz, V. N. L am beth. P lan t S ci. , 1987, 50: 70～ 84
5　Sylvia W arra, A nita W llin, A gneta O tto sson et al. P lan t S ci. , 1991, 21: 257～ 265
6　Koop H U , H J Schw eiger. J. P lan t P hy siol. , 1985, 121: 245～ 257
7　Koop H U , H J Schw eiger. J. Cell. B iology. , 1985, 39: 46～ 49
8　 Iu ts E igel, H U Koop. J . P lan t P hy siol. , 1989, 134: 577～ 581
9　Schw eiger G, J D irk, H U Koop et al. T heor A pp l Genet. , 1987, 73: 769～ 783
10　Spangenberg G, H U Koop , R L ich ter et al. P hy siol P lan t. , 1986, 66: 1～ 8
11　H unt G J , J P H elgson. P lan t S ci. , 1989, 60: 251～ 257
12　Kao K N , M R M ichayluk. E up h tica. , 1975, 126: 105～ 110
13　Shepard J F. Genetic Imp rovem en t of C rop s. In: Em ergent T echniques U niv. M inneso ta P ress. , 1980, 185: 201～ 215
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　　2000 年世纪交替之年, 适逢我刊创刊 50 周年。为了回顾我国农业科学家所取得的重要
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