全 文 ：中国秋海棠属 (秋海棠科) 植物的 DNA条形码评价*
焦丽娟1,2, 税玉民1**
(1 中国科学院昆明植物研究所生物多样性与生物地理学重点实验室, 云南 昆明摇 650201;
2 中国科学院大学, 北京摇 100049)
摘要: 秋海棠属植物种类繁多, 形态变异多样, 导致种类的系统放置混乱, 近缘种类鉴定困难。 利用
DNA条形码实现物种快速准确的鉴定技术具有不受形态特征约束的优势, 为秋海棠属植物的分类鉴定提
供了新的方法。 本研究选择 4 个 DNA条形码候选片段 ( rbcL, matK, trnH鄄psbA, ITS) 对中国秋海棠属 26
种 136 个个体进行了分析。 结果显示: 叶绿体基因 rbcL, matK和 trnH鄄psbA种内和种间变异小, 对秋海棠
属植物的鉴别能力有限; ITS / ITS2 种内和种间变异大, 在本研究中物种正确鉴定率达到 100% / 96% , 可
考虑作为秋海棠属 DNA条形码鉴定的候选片段。 研究结果支持中国植物条形码研究组建议将核基因 ITS /
ITS2 纳入种子植物 DNA条形码核心片段中的观点。
关键词: 秋海棠属; DNA条形码; ITS; matK; rbcL; trnH鄄psbA
中图分类号: Q 781, Q 949摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 2095-0845(2013)06-715-10
Evaluating Candidate DNA Barcodes among Chinese
Begonia (Begoniaceae) Species
JIAO Li鄄Juan1,2, SHUI Yu鄄Min1**
(1 Key Laboratory of Biodiversity and Biogeography, Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences,
Kunming 650201, China; 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)
Abstract: Begonia is the biggest genus in the Begoniaceae and exhibits high morphological and ecological diversity,
making intrageneric classification and species delimitation difficult, especially in the case of closely related species.
In this respect, DNA barcoding has the advantage of achieving rapid species identification without relying on mor鄄
phological characteristics, once a database containing species鄄specific sequences is established. In this study, we
tested four candidate plant barcoding regions, including three chloroplast loci ( rbcL, matK, trnH鄄psbA) and one
nuclear locus (ITS), in 136 samples representing 26 species of Begonia. The results demonstrated that species i鄄
dentification based on rbcL, matK and trnH鄄psbA sequences was poor due to low interspecific variation. Conversely,
ITS / ITS2 sequences showed significant intra鄄 and interspecific divergence enabling a high level of species discrimi鄄
nation (96% -100% ). Consequently, ITS / ITS2 could be considered as a potential barcode for identifying Begonia
species, which supports the proposal by the China Plant BOL Group that ITS / ITS2 should be incorporated into the
core barcode for seed plants.
Key words: Begonia; DNA barcoding; ITS; matK; rbcL; trnH鄄psbA
摇 DNA条形码 (DNA barcoding) 是利用一个或少数几个短的标准 DNA片段实现物种快速和准确识
植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 2013, 35 (6): 715 ~ 724
Plant Diversity and Resources摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI: 10. 7677 / ynzwyj201313064
*
**
基金项目: 中国科学院大科学装置开放研究项目 (2009鄄LSF鄄GBOWS鄄01); 中国国家自然科学基金 (NSFC40830209, 3170174);
中国科学院独立研究项目 (KSCX2鄄EW鄄J鄄24)
通讯作者: Author for correspondence; E鄄mail: ymshui@ mail. kib. ac. cn
收稿日期: 2013-03-26, 2013-07-12 接受发表
作者简介: 焦丽娟 (1988-) 女, 在读硕士, 主要从事秋海棠属分子生物学研究。 E鄄mail: jiaolijuan@ mail. kib. ac. cn
别和鉴定的一项技术 ( Hebert 等, 2003a, b;
Savolainen 等, 2005; Hollinsworth, 2011)。 线粒
体基因 COI ( cytochrome coxidase subunit I) 已经
成功应用于动物界大多数类群的鉴定 (Hebert
等, 2003a, 2004), 但在植物中线粒体基因进化
速率慢 (Kress等, 2005), 并且植物界进化过程
复杂, 杂交和多倍性现象普遍, 为寻找标准的植
物 DNA条形码的工作带来了极大的挑战 (Riese鄄
berg等, 2006; Fazekas等, 2009), 尤其是对一些
近缘种或近期演化物种 (Yan等, 2011)。
近年来, 植物 DNA 条形码的研究工作集中
于从单亲遗传的叶绿体基因组和变异较大的核基
因组中寻找理想的植物 DNA 条形码, 并相继提
出了不同的片段组合方案。 生命条形码联盟植物
工作组 [GBOL Plant Working Group (2009)] 建
议将 rbcL和 matK 组合作为陆地植物 DNA 条形
码核心条码; 此后, trnH鄄psbA 和 ITS 被建议作
为补充候选片段 (Hollinsworth 等, 2011)。 中国
植物条形码研究组通过对 1757 种 6286 个植物样
品的综合分析, 建议将核基因 ITS / ITS2 纳入种
子植物 DNA 条形码核心片段中 (Li 等, 2011)。
随后, 高连明等 (2012) 根据植物 DNA 条形码
研究的特点, 提出了植物 DNA 条形码研究的标
准规范, 为我国植物 DNA 条形码研究提供了详
细的参考资料。 李德铢等 (2012) 以 DNA 条形
码为核心, 首次提出构建新一代植物志 (iFlora)
的理念, 即将现代植物学、 DNA 测序技术与信
息技术相结合, 通过系列关键技术的集成和攻
关, 构建便捷、 准确识别植物和掌握相关数字化
信息的新一代植物志, 它将极大地促进植物分类
学和系统发育、 演化生物学、 生态学、 生物地理
学和保护生物学等相关学科的发展。
秋海棠属 (Begonia L. ) 是一个泛热带分布
的大属, 全世界约有 1 500 种, 以美洲和亚洲种
类居多, 各占 600 种左右 (Sosef, 1994), 中国
有 9 组, 约 150 余种, 主要分布于我国西南、 华
南各省 (Shui 等, 2002), 该属绝大部分的种类
分布具有明显的局域性, 属下各个组也往往限定
于某一洲, 甚至是某一地区。 秋海棠属植物形态
变异复杂, 性状受环境影响较大, 不同的种类在
习性、 生境、 体态、 叶形、 叶色及花色等方面表
现出多样性, 即使同一种类的不同居群, 在某些
性状上的变异也比较显著 (Thompson 和 Thomp鄄
son, 1981), 且近年来秋海棠属不断有新种、 自
然杂交种发表 ( Shui 等, 2002; Ku 等, 2004,
2006, 2008; Shui 和 Chen, 2005; Peng 等, 2005a,
b, 2007, 2008a, b), 因此在属、 组以及种类的划
分处理上存在着许多争议, 尤其近缘种类难以鉴
定。 同时该属大多是多汁草本植物, 传统方法压
制成的标本, 在叶片颜色、 花纹、 毛被颜色和花
被片颜色等方面都有很大程度的失真, 果实和子
房的形态解剖学特征 (子房室数、 胎座类型和
胎座裂片数) 等属下分组不可缺少的重要诊断
特征, 在多汁的果实被压干以后很难准确观察,
也是造成秋海棠属分类系统有些混乱的原因之
一。 DNA条形码技术仅需生物体的一部分组织
就可实现对物种的快速鉴定, 而所取组织可以来
自于生物体的任何部位、 甚至可能实现使用来自
保存较好的标本, 为秋海棠属植物的分类鉴定提
供了很好的辅助方法。
本文应用植物 DNA 条形码四个候选片段
( rbcL, matK, trnH鄄psbA 和 ITS) 对中国秋海棠
属植物进行了研究, 评价其 PCR 扩增和测序成
功率, 种内种间差异及物种鉴定能力, 筛选出适
合秋海棠属的候选 DNA条码。
1摇 材料和方法
1. 1摇 实验材料
采集分布于中国云南、 广西以及越南的秋海棠属植
物 26 种, 每种不同采集地点按照居群大小间隔 3 ~ 5 m采
集 1 ~7个个体, 共获得 136个个体。 标本存放于中国科学
院昆明植物研究所标本馆 (KUN), 详细采集信息见附录 1
(详见: http: / / journal. kib. ac. cn / UserFiles / File / JLJ. pdf)。
1. 2摇 实验方法
选取硅胶干燥或新鲜叶片, 采用改良的 CTAB 法提
取总 DNA (Doyle和 Doyle, 1987)。 PCR扩增采用 20 滋L
的反应体系, 包括正反向引物各 0. 5 滋L (0. 5 滋M), 模
版 DNA 1 滋L (30 ~ 50 ng), dd H2O 7. 5 滋L, 4%二甲基
亚砜 (DMSO) 0. 5 滋L, 2伊Taq PCR MasterMix 10 滋L [天
根 (天根生化科技, 北京); Taq聚合酶 0. 1 U, dNTP 0. 5
mM, Tris鄄HCl ( pH8. 3) 20 mM, KCl 100 mM, MgCl2 3
mM]。 引物序列及扩增反应程序见表 1。 PCR 产物经琼
脂糖凝胶电泳检测后, 使用 ExoSAP鄄IT 纯化酶 ( Affy鄄
metrix Inc. ) 进行纯化, 7 滋L反应体系: 5 滋L PCR 产物
和 2 滋L 10 倍稀释的纯化酶, 纯化反应程序为: 37 益15
617摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
min纯化, 80 益 15 min 使纯化酶失活, 4 益停止。 ABI
3730 XL自动测序仪进行正反向引物双向测序, 反应程
序为: 94 益预变性 10 s; 96 益变性 10 s、 50 益退火 5 s、
60 益延伸 4 min, 共 32 个循环; 4 益停止。
1. 3摇 数据分析
本研究对单个条形码片段: rbcL, matK, trnH鄄psbA,
ITS和 ITS2 (于 ITS 片段中截取); 叶绿体片段的组合:
rbcL+matK, rbcL+matK+trnH鄄psbA; 以及包含 ITS片段的
所有组合: ITS+ rbcL, ITS+matK, ITS+ trnH鄄psbA, ITS+
rbcL+matK, ITS+rbcL+ trnH鄄psbA, ITS+matK+ trnH鄄psbA,
ITS+rbcL+matK+trnH鄄psbA进行了分析。 如果某个种的个
体数小于 2 个, 则此种在分析中被去除, 且在构建联合
矩阵时, 如果某个体有缺失数据, 此个体也被去除。 应
用 Sequencher 4. 1. 4 软件 (Gene Codes) 完成序列编辑
和拼接, 应用 MAFFT 7. 0 的 G鄄INS鄄i 算法完成比对并做
部分手工调整 (Katoh 等, 2005; Katoh 和 Toh, 2008)。
应用 MEGA 4. 3 ( Tamura 等, 2007 ) 计算变异位点
(Variable sites)、 信息位点 (Parsimony鄄informative sites)
和 K2P距离 (Kimura 2鄄parameter distances), 结合一般
的统计软件完成呈现种内、 种间遗传距离分布频度的
“Barcoding gap冶 图。 应用 SPSS 16. 0 (SPSS 公司, 芝加
哥, IL) 完成 Wilcoxon 秩和检验, 评价不同条码种内、
种间距离的差异显著性。
应用建树方法对物种鉴定能力进行评价。 邻接法
(Neighbor鄄joining trees, NJ) 构建基因树, 采用 K2P距离
模型 (K2P distance model) 和配对剔除法 (pairwise de鄄
letion), 在 MEGA 4. 3 中运行, 自展分析 (Bootstrap a鄄
nalysis) 1 000 次抽样, 根据抽样自展值 (Bootstrap val鄄
ue, BS) 评估分支的可靠性。 NJ树上同种的个体聚成一
支且支持率 (自展值)逸50%则认为正确鉴定到种。
2摇 结果
2. 1摇 PCR扩增和测序成功率
136 个个体中, matK, trnH鄄psbA 和 ITS 的
PCR扩增成功率分别为: 68. 1%、 89. 9%和 77. 5%,
trnH鄄psbA的扩增成功率较高, matK 和 ITS 的扩
增成功率较低。 matK, trnH鄄psbA和 ITS的测序成
功率 (测序后获得高质量的序列且正反向序列顺
利拼接即判定为成功) 分别为: 95. 7%、 94. 4%
和 90. 7%。 最终分别获得 matK, trnH鄄psbA和 ITS
序列 90、 115和 95条, 另由 GenBank上获得 3 条
ITS序列。 对于 rbcL, 于30F和1400R引物扩增得
到的 rbcL序列全长中截取DNA条形码要求的 rbcL
序列 41条, 剩余 95 个个体获得 rbcL 序列 54 条,
PCR扩增和测序成功率分别为: 61. 1%和93. 1%,
共获得 rbcL序列 95条。
表 1摇 实验引物和 PCR扩增反应程序
Table 1摇 Primers and PCR amplification conditions used in this study
候选片段
DNA region
引物
Primer pairs
引物序列 (5忆鄄 3忆)
Primer sequences (5忆鄄 3忆)
扩增反应程序
Thermocycling conditions
文献来源
Source
trnH鄄psbA trnH CGC GCA TGG TGG ATT CAC AAT CC
94 益 4 min; [30 cycles:
94 益 1 min; Tate and Simpson, 2003
psbA GTT ATG CAT GAA CGT AAT GCT C 52 益 1 min; 72 益 1 min];72 益 10 min Sang et al., 1997
ITS ITS5 GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G
94 益 4 min; [30 cycles:
94 益 1 min; White, 1990
ITS4 TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 55 益 1 min; 72 益 1 min];72 益 10 min White, 1990
rbcL鄄1F ATG TCA CCA CAA ACA GAA ACT 94 益 4 min; [30 cycles:94 益 1 min; Fay et al., 1997
rbcL rbcL鄄724R CAT GTA CCT GCA GTA GC
52 益 1 min; 72 益 1 min];
72 益 10 min Fay et al., 1997
rbcL鄄30F AGC AAG TGT TGG ATT CAA AG 94 益 4 min; [30 cycles:94 益 1 min; Zhang et al., 2011
rbcL鄄1400R CRG CMG CTA GTT CRG GAC TC 52 益 1 min; 72 益 1 min];72 益 10 min Zhang et al., 2011
matK 3F CGT ACA GTA CTT TTG TGT TTA CGA G
94 益 4 min; [30 cycles:
94 益 1 min;
Hollingsworth et al.,
2009
1R ACC CAG TCC ATC TGG AAA TCT TGG TTC 52 益 1 min; 72 益 1 min];72 益 10 min
Hollingsworth et al.,
2009
7176 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 焦丽娟和税玉民: 中国秋海棠属 (秋海棠科) 植物的 DNA条形码评价摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
2. 2摇 序列多样性特征
四个候选片段和 ITS2 的序列特征如表 2 所
示, 三个叶绿体片段 rbcL, matK和 trnH鄄psbA的
变异 /信息位点个数分别为: 13 / 12、 12 / 12 和
11 / 8。 ITS比对后的长度为 867 bp, 变异 /信息位
点数为 272 / 245 个, 占比对长度的 31. 4 / 28. 3%。
ITS2比对后的长度为 427 bp, 变异 /信息位点数为
142 / 134个, 占比对长度的 33. 3 / 31. 4%。 有 5 个
个体 (40782鄄1, D鄄33鄄1, D鄄38鄄6, GBOWS1236鄄1,
GBOWS1236鄄2) 的核基因 ITS序列中发现 1 个套
峰, 1 个个体 (31397) 有 2 个套峰。 其中, 除
个体 31397 序列中的 1 个套峰出现在 ITS1 序列
内, 其余 6 个套峰均出现在 ITS2 序列内, 这些
位点使用简并碱基代替进行分析。
2. 3摇 种内和种间距离
由种内种间 K2P 距离得到 “barcoding gap冶
分布图结果显示 (图 1), 核基因 ITS / ITS2 存在
“barcoding gap冶, 但不明显, 有小部分的重叠,
rbcL, matK和 trnH鄄psbA不存在 “barcoding gap冶。
Wilcoxon秩和检验结果显示四个候选片段以及
ITS2 的种内距离变异不显著, 种间距离变异差
异大小顺序为 ITS2 >ITS> rbcL>matK> trnH鄄psbA
(表 3, 4)。
2. 4摇 物种鉴定有效性
2. 4. 1摇 建树方法摇 NJ树结果显示三个叶绿体片
段的物种鉴定能力不高: rbcL 鉴定 2 种, matK
鉴定 4 种, trnH鄄psbA 鉴定 4 种, 物种鉴定率分
别为: 9. 5% , 20% , 17. 4% ; rbcL 和 matK 联
合分析鉴定 3 种, 物种鉴定率为 18. 8% ; 三个
叶绿体片段联合分析鉴定 4 种, 物种鉴定率为
28. 6% (表 5)。 核基因 ITS 的物种鉴定率为
100% , 23 种秋海棠全部正确鉴定, 且除黄氏秋
海棠 (B. huangii Y. M. Shui & W. H. Chen) 的支
持率为 79%外, 其他 22 种支持率都在 90%以上
(图 2), 包含 ITS 的片段联合分析 ( ITS+ rbcL,
ITS+matK, ITS+trnH鄄psbA, ITS+rbcL+matK, ITS
+rbcL + trnH鄄psbA, ITS +matK + trnH鄄psbA, ITS +
rbcL+matK+ trnH鄄psbA) 的物种鉴定率同样都是
100% 。 ITS2 的物种鉴定率与 ITS 相比因癞叶秋
海棠 (B. leprosa Hance) 的支持率未达到 50% ,
物种鉴定率降为 95. 7% , 其它各种的支持率也
有所下降, 23 种秋海棠中有 4 种的支持率未达
到 90% , 黄氏秋海棠的支持率最低, 为 55%
(图 2)。
3摇 讨论
3. 1摇 DNA条形码引物通用性
在引物通用性方面, trnH鄄psbA 扩增成功率
较高, matK和 ITS扩增成功率较低 (表 2), 这
与以往的研究结果相符 (Kress 等, 2005; Chase
等, 2007; Kress 和 Erickson, 2007; Lahaye 等,
2008a; Newmaster 等, 2008; Ren 等, 2010)。 尽
管本文对四个候选片段的 PCR 反应条件进行了
优化, 其扩增成功率依然较低, 测序成功率也未
达到 100% (表 2), 这可能是因为样品 DNA 模
板的质量较差或实验技术方面的问题。 因此, 四
个候选条码在秋海棠属植物中的引物通用性是否
偏低或者有其特殊性还需要进一步探索。
表 2摇 四个候选片段序列多样性特征比较
Table 2摇 The comparisons of characteristics of the four candidate DNA regions
参数 Parameters
候选片段 Candidate DNA regions
rbcL matK trnH鄄psbA ITS ITS2
No. sampled species ( individuals) 21(97) 20(90) 23(115) 23(98) 23(98)
PCR success / % 61. 05 68. 12 89. 86 77. 54 —
Sequencing success / % 93. 10 95. 74 94. 35 90. 65 —
Aligned length (size, bp) 545(540-545) 759(759) 304(286-300) 867(676-698) 427(282-327)
No. of variable / parsimony informative sites 13 / 12 12 / 12 11 / 8 272 / 245 142 / 134
Indel length / bp 1-5 — 1-14 1-20 1-20
GC (range, % ) 44. 4 32. 6 20. 8 58. 3 58. 5
Total overlap (% observation) 0. 81 0. 26 2. 96 8. 59 4. 44
90% Overlap (% observation) 0. 75 0. 26 2. 96 0. 23 1. 63
Mean interspecific distance 0. 005依0. 002 0. 003依0. 002 0. 003依0. 002 0. 075依0. 010 0. 082依0. 017
Mean intraspecific distance 0. 0007依0. 0005 0. 0004依0. 0003 0. 0009依0. 0007 0. 0039依0. 0012 0. 0023依0. 0012
817摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
表 3摇 不同片段种间变异的Wilcoxon秩和检验
Table 3摇 Wilcoxon two鄄related鄄samples tests of interspecific divergence among DNA markers
W+ W- 相关等级 Relative ranks摇 摇 N值 N鄄value P值 P鄄value 结果 Result
ITS matK W+=7260 W-=0 120 P臆0. 001 ITS>matK
ITS trnH鄄psbA W+=11781 W-=0 153 P臆0. 001 ITS>trnH鄄psbA
ITS rbcL W+=9316 W-=0 136 P臆0. 001 ITS>rbcL
ITS ITS2 W+=7124 W-=23257 253 P臆0. 001 ITS
ITS2 trnH鄄psbA W+=11781 W-=0 153 P臆0. 001 ITS2>trnH鄄psbA
ITS2 rbcL W+=9316 W-=0 136 P臆0. 001 ITS2>rbcL
matK trnH鄄psbA W+=3948. 5 W-=1616. 5 136 P臆0. 001 matK>trnH鄄psbA
matK rbcL W+=636. 5 W-=4413. 5 120 P臆0. 001 matK
Table 4摇 Wilcoxon two鄄related鄄samples tests of intraspecific divergences among DNA markers
W+ W鄄 相关等级 Relative ranks摇 摇 摇 N值 N鄄value P值 P鄄value 结果 Result
ITS matK W+=35 W-=10 16 0. 139 ITS=matK
ITS trnH鄄psbA W+=42 W-=3 18 0. 021 ITS= trnH鄄psbA
ITS rbcL W+=33 W-=12 17 0. 214 ITS= rbcL
ITS ITS2 W+=62 W-=29 23 0. 249 ITS= ITS2
ITS2 matK W+=21 W-=7 16 0. 237 ITS2 =matK
ITS2 trnH鄄psbA W+=31 W-=5 18 0. 069 ITS2 = trnH鄄psbA
ITS2 rbcL W+=24 W-=12 17 0. 401 ITS2 = rbcL
matK trnH鄄psbA W+=6 W-=22 17 0. 176 matK= trnH鄄psbA
matK rbcL W+=2 W-=26 16 0. 043 matK= rbcL
trnH鄄psbA rbcL W+=5 W-=10 21 0. 500 trnH鄄psbA= rbcL
表 5摇 NJ树分析得到叶绿体片段及其组合正确鉴定的物种 (支持率逸50%)
Table 5摇 Species discrimination (bootstrap value 逸50% ) of three chloroplast loci and their combination based on the NJ tree
种名 Taxa
候选片段 Candidate DNA regions
rbcL matK trnH鄄psbA LK LKH
Section 玉. Coelocentrum Irmsch.
B. biflora 64 88 — 94 94
B. guangxiensis — — — 55 51
B. zhengyiana — 64 — — —
Section 域. Diploclinium (Lindl. ) A. DC.
B. cavaleriei — 66 68 64 65
Section 芋. Leprosae (T. C. Ku) Y. M. Shui
B. cylindrica 64 — 64 — —
Section 郁. Platycentrum (Klotzsch) A. DC.
B. megalophyllaria — — 63 — 60
Section 吁. Reichenheimia (Klotzsch) A. DC.
B. parvula — 72 53 — —
Note: LK ( rbcL+matK), LKH ( rbcL+matK+trnH鄄psbA)
9176 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 焦丽娟和税玉民: 中国秋海棠属 (秋海棠科) 植物的 DNA条形码评价摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
图 1摇 不同候选片段种内和种间 K2P距离分布图
Fig. 1摇 Relative distribution of the intraspecific and
interspecific distances Kimura 2鄄parameter
(K2P) distances for each locus
3. 2摇 物种分辨率的评价
以往部分研究结果显示三个叶绿体片段在某
些类群中具有较高的引物通用性和正确鉴定率
(Kress等, 2005, 2009; Kress 和 Erickson, 2007;
Fazekas 等, 2008; Lahaye 等, 2008a, b; New鄄
maste 等, 2008; Hollingsworth 等, 2009), 2009
年, 生命条形码联盟植物工作组提出将 rbcL 和
matK作为陆地植物 DNA 条形码核心候选片段
(CBOL Plant Working Group, 2009)。 在秋海棠属
中, 三个叶绿体片段不存在 “barcoding gap冶 (图
1), 种内、 种间距离较小, 物种正确鉴定率低于
20% , rbcL+matK和三个片段联合分析的物种正
确鉴定率不超过 30% (表 5), 这可能是由于三
个叶绿体片段在秋海棠属中进化速率慢、 谱系分
化不完全或是秋海棠属自身物种分化时间短等生
物学原因导致, 这种情况在石斛属 (Dendrobium
Sw. : 黄海等, 2010) 以及中国生命条形码联盟
(Li, 2011) 研究的 115 属中的 14 个属的植物种
类中也存在。
核基因 ITS 片段种内变异和种间变异最大,
存在 “barcoding gap冶, 单片段及包含有 ITS 片
段的联合分析物种正确鉴定率高达 100% , 能很
好地区分秋海棠属的不同种类, 可考虑作为秋海
棠属 DNA条形码鉴定的标准条码。 以往的研究
结果显示, ITS 片段在眼子菜科 ( Potamoget鄄
onaceae: Du 等, 2011)、 女贞属 (Ligustrum: Gu
等, 2011) 和蒟蒻薯属 (Tacca: 赵月梅和张玲,
2011) 中的物种分辨率也达到 100% , 在其它科
属中也具有最高的物种分辨率 ( Altschul 等,
1990; Kress 等, 2005; Sass 等, 2007; Liu 等,
2010; Ren 等, 2010; Shi 等, 2011; Xiang 等,
2011; Fu 等, 2011; Guo 等, 2011; Yan 等,
2011)。 因此, 在物种分辨率方面 ITS 片段作为
DNA条形码具有明显的优势, 但其引物通用性
较低、 存在 poly鄄A 结构、 序列多拷贝且变异位
点众多导致比对困难是其作为秋海棠属 DNA 条
形码的主要限制因素, 类似的结果在以前的研究
中也出现过 (赵丽嘉等, 2010; 赵月梅和张玲,
2011; Alvarez 和 Wendel, 2003; Bailey 等, 2003;
Kress等, 2005; Chase等, 2007; Kress和 Erickson,
2007; Sass 等, 2007; Lahaye 等, 2008b; Gonzalez
等, 2009; CBOL Plant Working Group, 2009;
027摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
图 2摇 ITS和 ITS2 分析得到秋海棠属的 NJ树, 分支上显示高于 50%支持率, 绎 ITS2 未能正确鉴定的种
Fig. 2摇 NJ tree based on ITS and ITS2 sequences for Begonia. Bootstrap values (>50% ) are shown above
the relevant branches. 绎 Species not discriminated using ITS2
1276 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 焦丽娟和税玉民: 中国秋海棠属 (秋海棠科) 植物的 DNA条形码评价摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Whitlock 等, 2010; Hollingsworth, 2011; Holling鄄
sworth等, 2011)。
近年来, ITS片段的一部分 ITS2 在一些类群
中已被证实具有很好的鉴定效果 (Gao 和 Chen,
2009; Chen 等, 2010; Shi 等, 2011; Xiang 等,
2011; Yao 等, 2011; Li 等, 2011)。 本研究中,
ITS2 种内距离小于 ITS、 种间距离大于 ITS, 存
在 “barcoding gap冶, 物种分辨率 (96% ) 和各
种支持率与 ITS相比虽然稍有降低, 但如果 ITS2
能够克服 ITS引物通用性低以及比对困难等问题
(Chen等, 2010; Liu 等, 2010; Hollingsworth 等,
2011), 那么 ITS2可以替代 ITS 作为秋海棠属植物
的 DNA条形码, 是 ITS的一个有效的补充片段。
综上所述, 叶绿体基因 rbcL, matK 和 trnH鄄
psbA种内和种间变异小, 对秋海棠属植物的鉴
别能力有限, 不适合作为秋海棠属 DNA 条形码
鉴定的标准条码; ITS / ITS2 片段种内和种间变异
大, 物种正确鉴定率高, 可考虑作为秋海棠属
DNA条形码鉴定的标准条码。 支持中国植物条
形码研究组建议将核基因 ITS / ITS2 纳入种子植
物 DNA条形码核心片段中的观点。 本研究中只
涉及秋海棠属部分种类, 且大多分布在中国云南
或广西, 因此, 对秋海棠属 DNA 条码的评价还
有待于进一步更加全面的研究。 我们期待随着植
物 DNA条形码的不断发展和新一代植物志 ( iF鄄
lora) 的构建与实施, DNA条形码鉴定技术与形
态分类相辅相成, 能够实现秋海棠属植物快速、
准确、 便捷的鉴定。
致谢摇 爱丁堡皇家植物园的 Michael Moeller 博士、 中国
西南野生生物种质资源库分子生物学实验中心的曾春霞
博士、 中国西南野生生物种质资源库的郁文彬博士、 中
国科学院昆明植物研究所标本馆的魏志丹博士在文章修
改和数据处理方面提出大量的宝贵意见和建议, 中国西
南野生生物种质资源库分子生物学实验中心的林春艳、
袁文斌、 王磊、 赵祥给予实验技术指导。
也参摇 考摇 文摇 献页
Altschul SF, Gish W, Miller W et al., 1990. Basic local alignment
search tool [J]. Journal of Molecular Biology, 215 (3): 403—410
Alvarez I, Wendel JF, 2003. Ribosomal ITS sequences and plant
phylogenetic inference [J] . Molecular Phylogenetics and Evolu鄄
tion, 29 (3): 417—434
Bailey CD, Carr TG, Harris SA et al., 2003. Characterization of an鄄
giosperm nrDNA polymorphism, paralogy, and pseudogenes [J] .
Molecular Phylogenetics and Evolution, 29 (3): 435—455
CBOL Plant Working Group, 2009. A DNA barcode for land plants
[ J] . Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unit鄄
ed States of America, 106 (31): 12794—12797
Chase MW, Cowan RS, Hollingsworth PM et al., 2007. A proposal
for a standardised protocol to barcode all land plants [ J] . Tax鄄
on, 56 (2): 295—299
Chen SL, Yao H, Han JP et al., 2010. Validation of the ITS2 region
as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species
[J] . Public Library of Science One, 5 (1): e8613
Doyle JJ, Doyle JL, 1987. A rapid DNA isolation procedure for small
quantities of fresh leaf material [ J] . Phytochemical Bulletin,
19: 11—15
Du ZY, Qimike A, Yang CF et al., 2011. Testing four barcoding
markers for species identification of Potamogetonaceae [ J ] .
Journal of Systematics and Evolution, 49 (3): 246—251
Fay MF, Swensen SM, Chase MW, 1997. Taxonomic affinities of Me鄄
dusagyne oppositifolia (Medusagynaceae) [J] . Kew Bulletin, 52
(1): 111—120
Fazekas AJ, Burgess KS, Kesanakurti PR et al., 2008. Multiple mul鄄
tilocus DNA barcodes from the plastid genome discriminate plant
species equally well [J] . Public Library of Science One, 3 (7):
e2802
Fazekas AJ, Kesanakurti PR, Burgess KS et al., 2009. Are plant
species inherently harder to discriminate than animal species u鄄
sing DNA barcoding markers? [J] . Molecular Ecology Resources,
9: 130—139
Fu YM, Jiang WM, Fu CX, 2011. Identification of species within
Tetrastigma (Miq. ) Planch. (Vitaceae) based on DNA barcod鄄
ing techniques [ J] . Journal of Systematics and Evolution, 49
(3): 237—245
Gao LM (高连明), Liu J (刘杰), Cai J (蔡杰) et al., 2012. A
synopsis of technical notes on the standards for plant DNA bar鄄
coding [J] . Plant Diversity and Resources (植物分类与资源学
报), 34 (6): 592—606
Gao T, Chen SL, 2009. Authentication of the medicinal plants in
Fabaceae by DNA barcoding technique [J] . Planta Medica, 75
(4): 417—417
Gonzalez MA, Baraloto C, Engel J et al., 2009. Identification of Am鄄
azonian trees with DNA barcodes [J] . Public Library of Science
One, 4 (10): e7483
Gu J, Su JX, Lin RZ et al., 2011. Testing four proposed barcoding
markers for the identification of species within Ligustrum L.
(Oleaceae) [ J] . Journal of Systematics and Evolution, 49
(3): 213—224
Guo X, Simmons MP, But PPH et al., 2011. Application of DNA
barcodes in Hedyotis L. (Spermacoceae, Rubiaceae) [J] . Jour鄄
227摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
nal of Systematics and Evolution, 49 (3): 203—212
Hebert PDN, Cywinska A, Ball SL et al., 2003a. Biological identifi鄄
cations through DNA barcodes [ J] . Proceedings of the Royal
Society of London Series B鄄Biological Sciences, 270 ( 1512 ):
313—321
Hebert PDN, Ratnasingham S, deWaard JR, 2003b. Barcoding ani鄄
mal life: Cytochrome coxidase subunit 1 divergences among close鄄
ly related species [J] . Proceedings of the Royal Society of Lon鄄
don Series B鄄Biological Sciences, 270: 96—99
Hebert PDN, Stoeckle MY, Zemlak TS et al., 2004. Identification of
birds through DNA barcodes [J] . Public Library of Science Biol鄄
ogy, 2 (10): e312
Hollingsworth ML, Clark AA, Forrest LL et al., 2009. Selecting bar鄄
coding loci for plants: evaluation of seven candidate loci with spe鄄
cies鄄level sampling in three divergent groups of land plants [ J] .
Molecular Ecology Resources, 9 (2): 439—457
Hollingsworth PM, 2011. Refining the DNA barcode for land plants
[J] . Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unit鄄
ed States of America, 108 (49): 19451—19452
Hollingsworth PM, Graham SW, Little DP, 2011. Choosing and u鄄
sing a plant DNA barcode [J] . Public Library of Science One, 6
(5): e19254
Huang H (黄海), Li JS (李劲松), Fu AJ (符岸军) et al., 2010.
Screening of potential DNA barcoding markers in Dendrobium
[J] . Chinese Journal of Tropical Crops (热带作物学报), 31
(10): 1669—1777
Katoh K, Kuma K, Toh H et al., 2005. MAFFT version 5: Improve鄄
ment in accuracy of multiple sequence alignment [ J] . Nucleic
Acids Research, 33 (2): 511—518
Katoh K, Toh H, 2008. Improved accuracy of multiple ncRNA align鄄
ment by incorporating structural information into a MAFFT鄄based
framework [J] . BioMed Central Bioinformatics, 9: 212
Kress WJ, Erickson DL, 2007. A two鄄locus global DNA barcode for
land plant: The coding rbcL gene complements the noncoding
trnH鄄psbA spacer region [ J] . Public Library of Science One, 2
(6): e508
Kress WJ, Erickson DL, Jones FA et al., 2009. Plant DNA barcodes
and a community phylogeny of a tropical forest dynamics plot in
Panama [J] . Proceedings of the National Academy of Sciences of
the United States of America, 106 (44): 18621—18626
Kress WJ, Wurdack KJ, Zimmer EA et al., 2005. Use of DNA bar鄄
codes to identify flowering plants [J] . Proceedings of the Nation鄄
al Academy of Sciences of the United States of America, 102
(23): 8369—8374
Ku SM, Kono Y, Liu Y, 2008. Begonia pengii (sect. Coelocentrum,
Begoniaceae), a new species from limestone areas in Guangxi,
China [J] . Botanical Studies, 49 (2): 167—175
Ku SM, Liu Y, Peng CI, 2006. Four new species of Begonia sect.
Coelocentrum ( Begoniaceae) from limestone areas in Guangxi,
China [J] . Botanical Studies, 47 (2): 207—222
Ku SM, Peng CI, Liu Y, 2004. Notes on Begonia ( sect. Coelocen鄄
trum, Begoniaceae) from Guangxi, China, with the report of two
new species [ J] . Botanical Bulletin of Academia Sinica, 45
(4): 353—367
Lahaye R, Savolainen V, Duthoit S et al., 2008a. A test of psbK鄄psbI
and atpF鄄atpH as potential plant DNA barcodes using the flora of
the Kruger National Park as a model system ( South Africa )
[OL]. Nature Precedings, < http: / / hdl. handle. net / 10101 /
npre. 12008. 11896. 10101>
Lahaye R, van der Bank M., Bogarin D et al., 2008b. DNA barcod鄄
ing the floras of biodiversity hotspots [J] . Proceedings of the Na鄄
tional Academy of Sciences of the United States of America, 105
(8): 2923—2928
Li DZ, Gao LM, Li HT et al., 2011. Comparative analysis of a large
dataset indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be
incorporated into the core barcode for seed plants [ J] . Proceed鄄
ings of the National Academy of Sciences of the United States of
America, 108 (49): 19641—19646
Li DZ (李德铢), Wang YH (王雨华), Yi TS (伊廷双) et al.,
2012. The next generation Flora: iFlora [ J] . Plant Diversity
and Resources (植物分类与资源学报), 34 (6): 525—531
Liu J, Moller M, Gao LM et al., 2010. DNA barcoding for the dis鄄
crimination of Eurasian yews (Taxus L., Taxaceae) and the dis鄄
covery of cryptic species [ J] . Molecular Ecology Resources, 11
(1): 89—100
Newmaster SG, Fazekas AJ, Steeves RAD et al., 2008. Testing can鄄
didate plant barcode regions in the Myristicaceae [J] . Molecu鄄
lar Ecology Resources, 8 (3): 480—490
Peng CI, Ku SM, Leong WC, 2005a. Begonia liuyanii (sect. Coelo鄄
centrum, Begoniaceae), a new species from limestone areas in
Guangxi, China [J] . Botanical Bulletin of Academia Sinica, 46
(3): 245—254
Peng CI, Shui YM, Liu Y et al., 2005b. Begonia fangii (sect. Coe鄄
locentrum, Begoniaceae), a new species from limestone areas in
Guangxi, China [J] . Botanical Bulletin of Academia Sinica, 46
(3): 83—89
Peng CI, Hsieh TY, Ngyuen QH, 2007. Begonia kui ( sect. Coelo鄄
centrum, Begoniaceae), a new species from Vietnam [J] . Bo鄄
tanical Studies, 48 (1): 127—132
Peng CI, Ku SM, Kono Y et al., 2008a. Two new species of Begonia
( sect. Coelocentrum, Begoniaceae ) from limestone areas in
Guangxi, China: B. arachnoidea and B. subcoriacea [ J] . Bo鄄
tanical Studies, 49 (4): 405—418
Peng CI, Liu Y, Ku SM, 2008b. Begonia aurantiflora (sect. Coelo鄄
centrum, Begoniaceae), a new species from limestone areas in
Guangxi, China [J] . Botanical Studies, 49 (1): 83—92
Ren BQ, Xiang XG, Chen ZD, 2010. Species identification of Alnus
(Betulaceae) using nrDNA and cpDNA genetic markers [ J] .
Molecular Ecology Resources, 10 (4): 594—605
Rieseberg LH, Wood TE, Baack EJ, 2006. The nature of plant spe鄄
3276 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 焦丽娟和税玉民: 中国秋海棠属 (秋海棠科) 植物的 DNA条形码评价摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
cies [J] . Nature, 440 (7083): 524—527
Sang T, Crawford DJ, Stuessy TF, 1997. Chloroplast DNA phyloge鄄
ny, reticulate evolution and biogeography of Paeonia ( Paeoni鄄
aceae) [J] . American Journal of Botany, 84 (8): 1120—1136
Sass C, Littlle DP, Stevenson DW et al., 2007. DNA barcoding in
the Cycadales: testing the potential of proposed barcoding marker
for species identification of cycads [J] . Public Library of Science
One, 2 (11): e1154
Savolainen V, Cowan RS, Vogler AP et al., 2005. Towards writing
the encyclopaedia of life: an introduction to DNA barcoding
[J] . Philosophical Transactions of the Royal Society B鄄Biological
Sciences, 360 (1462): 1805—1811
Shi LC, Zhang J, Han JP et al., 2011. Testing the potential of pro鄄
posed DNA barcodes for species identification of Zingiberaceae
[J] . Journal of Systematics and Evolution, 49 (3): 261—266
Shui YM (税玉民), Chen WH (陈文红), 2005. New data of sect.
Coelocentrum ( Begonia) in Begoniaceae [ J] . Acta Botanica
Yunnanica (云南植物研究), 27 (4): 355—374
Shui YM, Peng CI, Wu CY, 2002. Synopsis of the Chinese species
of Begonia (Begoniaceae), with a reappraisal of sectional delim鄄
itation [J] . Botanical Bulletin of Academia Sinica, 43 (4):
313—327
Sosef MSM, 1994. Studies in Begoniaceae V [ D]. Netherlands:
Wageningen Agricultural University (PhD), 1—306
Tamura K, Dudley J, Nei M et al., 2007. MEGA4: Molecular evolu鄄
tionary genetics analysis (MEGA) software version 4. 0 [ J] .
Molecular Biology and Evolution, 24 (8): 1596—1599
Tate JA, Simpson BB, 2003. Paraphyly of Tarasa (Malvaceae) and
diverse origins of the polyploid species [J] . Systematic Botany,
28 (4): 723—737
Thomas DC, Hughes M, Phutthai T et al., 2011. A non鄄coding plas鄄
tid DNA phylogeny of Asian Begonia (Begoniaceae): Evidence
for morphological homoplasy and sectional polyphyly [ J] . Mo鄄
lecular Phylogenetics and Evolution, 60 (3): 428—444
Thompson ML, Thompson EJ, 1981. Begonias, The Complete Refer鄄
ence Guide [M]. New York: Times Books Press, 1—356
White TJ, Bruns T, Lee S et al., 1990. Amplification and direct se鄄
quencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics [A].
In: Innis M, Gelfand D, Sninsky J et al. ( eds.), PCR Proto鄄
cols: a Guide To Methods and Applications [ M]. San Diego:
Academic Press, 315—322
Whitlock BA, Hale AM, Groff PA, 2010. Intraspecific inversions
pose a challenge for the trnH鄄psbA plant DNA barcode [ J] .
Public Library of Science One, 5 (7): e11533
Xiang XG, Zhang JB, Lu AM et al., 2011. Molecular identification
of species in Juglandaceae: A tiered method [ J] . Journal of
Systematics and Evolution, 49 (3): 252—260
Yan HF, Hao G, Hu CM et al., 2011. DNA barcoding in closely re鄄
lated species: A case study of Primula L. sect. Proliferae Pax
(Primulaceae) in China [J] . Journal of Systematics and Evolu鄄
tion, 49 (3): 225—236
Yao H, Song JY, Liu C et al., 2010. Use of ITS2 region as the uni鄄
versal DNA barcode for plants and animals [ J] . Public Library
of Science One, 5 (10): 370—375
Zhang SD, Soltis DE, Yang Y et al., 2011. Multi鄄gene analysis pro鄄
vides a well鄄supported phylogeny of Rosales [ J] . Molecular
Phylogenetics and Evolution, 60 (1): 21—28
Zhao LJ (赵丽嘉), Jia Y (贾渝), Zhou SL (周世良) et al.,
2010. The preliminary study on DNA barcoding of mosses—a
case of part of genera of Meteoriaceae [J] . Plant Diversity and
Resources (植物分类与资源学报), 32 (3): 239—249
Zhao YM (赵月梅), Zhang L (张玲), 2011. Using DNA barcoding
in genus Tacca (Dioscoreaceae) [ J] . Plant Diversity and Re鄄
sources (植物分类与资源学报), 33 (6): 674—682
427摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷