全 文 ：两株滇产广义美味牛肝菌的分离培养及其分子鉴定?
王海坤1 , 2 , 李 涛1 , 赵丹丹3 , 李凌飞1 , 沙 涛1 , 赵之伟1
??
(1 云南大学 生物资源保护与利用国家重点实验室培育基地 , 微生物多样性可持续利用教育部重点实验室 , 云南 昆明 650091;
2 昆明师范高等专科学校 , 云南 昆明 650031 ; 3 云南省农业科学院园艺作物研究所 , 云南 昆明 650205 )
摘要 : 采用组织分离法从广义美味牛肝菌子实体分离获得 2 株稳定的菌株 , 初步研究了两菌株的分离和培
养条件。用 ITS序列分析 , 对分离菌株进行了分子鉴定。基于 ITS 序列构建的系统树表明两株菌属于美味
牛肝菌复合群 , 并与夏生牛肝菌 Boletus aestivalis (Paul .) Fr . 有较近的亲缘关系。
关键词 : 美味牛肝菌 ; 分离培养 ; 分子鉴定
中图分类号 : Q 945 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700 (2007) 05 - 559 - 04
Cultivation and Molecular Identification of Two Bolete Strains
Isolated from Boletus edulis Complex of Yunnan , China *
WANG Hai-Kun1 , 2 , LI Tao1 , ZHAO Dan-Dan3 , LI Ling-Fei1 ,
SHA Tao
1
, ZHAO Zhi-Wei
1 **
(1 Key Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-Resources, and Key Laboratory for Microbial Resources of Minitry of
Education, Yunnan University, Kunming 650091 , China; 2 Kunming Teachers College, Kunming 650031 , China;
3 Instituteof Horticultureof Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650205 , China)
Abstract : Two bolete strainswereobtained fromfruiting bodies by tissue isolation and culturemethods . Conditions for iso-
lation and cultivation of thetwo strainswere studied . Molecular identification was carried out based on sequenceanalysis of
the internal transcribed spacers ( ITS1-5.8S-ITS2) of the strains . Neighbour-joining analysis showed that the two isolates
belong to the Boletus edulis complex and havea close phylogenetic relationship to B. aestivalis .
Key words: Boletus edulis; Isolation and culture; Molecular identification
云南是全球野生食用菌最为丰富的地区之
一 , 尤其是牛肝菌资源 (臧穆 , 2006 )。牛肝菌
是一类著名的食用真菌 , 目前认为它们是一类与
栎和松树等树种根系共生形成外生菌根的真菌类
群 , 迄今为止 , 除个别种有人报道在实验室条件
下栽培成功外 ( Ohta and Fujiwara, 2003 ) , 绝大
多数种类尚不能通过人工栽培形成子实体 ( 黄年
来 , 1998) 。在云南 , 可食用的牛肝菌主要根据
子实体的颜色被通俗地分为“白牛肝”, “黄牛
肝”和“黑牛肝”, 其中“白牛肝”即广义的
“美味牛肝菌”在贸易中占有重要的地位。从分
类学上看 , 广义的美味牛肝菌复合群大致包括以
下 5 个种 : 美味 牛肝 菌 ( Boletus edulis Bull .:
Fr .)、褐 红 牛 肝 菌 ( B. pinophilus Pilát & Der-
mek)、铜色牛肝菌 ( B. aereus Bull .: Fr .)、网纹
牛肝 菌 ( B. reticulates Schaeff ) 和夏 生 牛 肝 菌
( B. aestivalis (Paul .) Fr .) (Wang等 , 1995; Salerni
and Perini , 2004) , 这 5 个种由于子实体形态很相
似 , 仅依据形态学特征进行种的鉴定非常困难
(Leonardi 等 , 2005; Mello 等 , 2006 )。
云 南 植 物 研 究 2007 , 29 (5) : 559～562
Acta Botanica Yunnanica

?
?? ?通讯作者 : Author for correspondence; E-mail : zhaozhw@ynu. edu. cn
收稿日期 : 2007 - 03 - 05 , 2007 - 06 - 11 接受发表
作者简介 : 王海坤 (1974 - ) 男 , 博士研究生 , 主要从事菌根生物学研究。 ?
基金项目 : 云南省自然科学基金 ( 2005C003M ) 资助课题
组织分离法是目前牛肝菌分离的常用方法 ,
研究人员曾从培养基、分离材料、分离环境、培
养方法等方面摸索了牛肝菌的分离技术 ( 应国华
等 , 2004; 邓百万和陈文强 , 2004 ) , 由于对所
分离到的菌株无法人工诱导纯培养菌丝体出菇 ,
因此 , 所得分离物是否为牛肝菌的纯培养物大多
仅依据菌丝萌发速度、菌丝生长状况、菌落形态
等特征来确定 ( 于富强等 , 2003; 邓百万和陈文
强 , 2004; 应国华等 , 2004 )。分子生物学方法
的发展和分子系统进化理论的完善 , 为对以组织
分离获得的菌丝体进行物种的分子遗传学鉴定提
供了可能。 ITS ( Internal transcribed spacer) 是核
糖体 DNA 中的非编码转录间隔区 , 属于中度保
守区域 , 其保守性基本上表现为种内相对一致 ,
种间差异比较明显 , 并且真菌的 ITS 易扩增 , 这
些特点使 ITS 区被广泛应用于外生菌根真菌的分
子鉴 定 ( Moor 等 , 2002; Thomas and Richard,
2004)。目前已开展的牛肝菌分子鉴定工作 , 大
都采用子实体作为实验材料 ( Jarosch and Bresin-
sky, 2000; Leonardi 等 , 2005; Mello等 , 2006) , 所
得到的基因序列为牛肝菌分离培养物的分子鉴定
研究提供了令人信服的比对数据。
本研究以云南产广义美味牛肝菌新鲜子实体
为材料 , 通过组织分离方法获得两株稳定的分离
培养物 , 用一对 ITS 通用引物 ( ITS4-ITS5 ) 对这
两株 菌 进行 了 PCR 扩 增 及 序 列测 定 , 通 过
BLAST 序列搜索 , 将已知序列与两株菌的序列进
行构树 , 确定了两株菌的系统地位。
1 材料与方法
1 .1 分离材料
“白牛肝”子实体分别于 2005 年 7 月 10 日购自云南
省昆明市集贸市场和 2005 年 7 月 17 日采自云南省易门
县龙泉镇国家级森林公园松树林下。选取生长健壮、刚
破土的新鲜子实体作为分离对象。
1 .2 培养基
1 .2 .1 分离培养基 : 本实验设计了一份供分离菌株用的
培养基 , 命名为“14 号培养基”, 具体配方如下 : 取自
然风干的牛肝菌生长的山地土壤、腐殖土和麦麸按 1∶1∶
0 .2 (w?w?w) 比例混合 , 加 3 倍自来水 , 沸水浴浸提 4～
5 h, 冷却后 4 000 r?min离心 15 min, 取上清液。40% 马铃
薯浸出液 (洗净去皮马铃薯 400 g, 切碎加水煮沸 30 min,
过滤 , 滤液加水补至 1 000 mL)。将土壤 - 麦麸浸出液和
40%马铃薯浸出液按 1∶1 ( v?v) 比例混合 , 补加 KH2 PO4
0 .1% , MgSO4 ·7H2 O 0 .05% , NaCl 0.1 % , ( NH4 ) 2 SO4
0 .3% , 谷酰胺 0 .1% , 甘蔗糖蜜 1 % , 葡萄糖 2 % , 琼脂
2 % , pH 6.0。然后在温度 121℃、9 .8 - 10 .8×104 Pa, 灭
菌 20 min后备用。
1 .2 .2 转接培养基 (6 种 ) 分别是 : ① 14 号培养基 ; ②
马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (PDA) : 马铃薯 200 g、葡萄糖
20 g、琼脂 20 g、水 1 L ; ③Ⅱ号培养基 : 葡萄糖 20 g、酵
母粉 7 g、黄豆粉 3 g、KH2 PO4 1 g、MgSO4·7H2 O 0 .5 g、
MnSO4·H2 O 0 .5 g、琼脂 20 g、水 1 L ; ④ I 号培养基 : 马
铃薯 200 g、葡萄糖 20 g、琼脂 20 g、MgSO4·7H2 O 0 .8 g、
KH2 PO4 2 g、水 1 L ; ⑤ PACH 培 养基 : KH2 PO4 1 g,
Na2 MoO4·2H2 O 0 .275 mg, MgSO4·7H2 O 0 .5 g, 麦芽糖 5 g,
CaCl2·2H2 O 0.05 g, 葡萄糖 20 g, H3 BO3 0.028 g, 维生素
B1 0 .1 mg, MnCl2·2H2 O 5 mg, 琼脂粉 16 g, ZnSO4·7H2 O
0 .11 mg, Fe EDTA 0 .02 g, 水 1 L , pH 6 .5 ; ⑥ 改良 MMN
培养基 : CaCl2·2H2 O 0 .05 g, 麦芽汁 ( 12 .7Beo ) 100 mL ,
NaCl 0 .025 g, 葡萄糖 10 g, KH2 PO4 0.5 g, 琼脂粉 16 g,
(NH4 ) 2 HPO4 0 .25 g, 维生素 B1 0 .1 mg, MgSO4·7H2 O 0 .15
g, 1 %FeCl3 1.2 ml , 水 1 L , pH 6 .5。然后在温度 121℃、
9 .8 - 10 .8×104 Pa, 灭菌 20 min后备用。
1 .3 子实体采集、组织分离及转接
于 2005 年 7 月在云南省牛肝菌主产区易门县龙泉镇
国家级森林公园松树林下采取“白牛肝”子实体 , 编号
为子实体 1 和子实体 2 , 采摘后立即用 75% 酒精进行表
面消毒 , 再用无菌刀片从菌柄中间切开 , 然后用消过毒
的刀片与镊子分别切取菌柄与菌盖交界处大小为 0 .5 cm
×0 .5 cm的组织块接入分离培养基斜面上。子实体 1 所
接斜面为 YM-1～YM-5 五支斜面 , 子实体 2 所接斜面为
YM-6～YM-10 五支斜面 , 并于当天带回实验室置于 24℃
下黑暗培养 , 培养期间每隔 3 天检查一次 , 除去污染。
形成菌落后转接入 6 种转管培养基斜面 , 每种转接培养
基接 2 支 , 24℃下黑暗培养 , 有菌落形成的斜面用相同
培养基再转管 2～3 次。本研究中采自易门供分离的子实
体标本保藏于本实验室中国西南野生生物种质资源库
(微生物库 ) 中 (编号为 : YMF1 .01501 和 YMF1 .01502 )。
购置市售“白牛肝”子实体后立即带回实验室于当天超
净工作台上进行组织分离 , 分离方法同上。
1 .4 分子鉴定
1 .4 .1 DNA 提取 菌丝体的总 DNA 提取参照曾东方等
(2001)。
1 .4 .2 PCR 扩增、测序 利用真菌 ITS 通用引物对
( ITS4: TCCTCCGCTTATTGATATGC; ITS5: GGAAGTAA
AAGTCGTAACAAGG) (White等 , 1990) 25μL 反应体系包
括 : 10×buffer 2 .5μL , MgCl2 2μL , dNTP 1μL , 引物各 1
065 云 南 植 物 研 究 29 卷
μL , Tag酶 0 .125μL , DNA 模板 1μL , 无菌去离子水补足
至 25μL。扩增程序 : 94℃ 5 min; 94℃ 30 sec, 52℃ 30
sec, 72℃ 30 sec, 30 个循环 ; 72℃ 7 min。PCR 扩增产物
用琼脂糖凝胶电泳检测 , EB 染色观察。用 WATSON胶回
收试剂盒回收并纯化扩增的目的片段 DNA。
纯化后的 PCR 产物直接由北京三博志远生物技术有
限公司依据四色荧光双脱氧末端终止法原理进行 DNA 序
列测序。
1 .4 .3 ITS 区段的系统发育分析 使用 DNASTAR 软件包
中的 SeqMan程序将测序获得的序列对照测序胶图仔细核
对 , 以确保序列的准确性。同时将得到的序列提交到
GenBank 数据库 , 序列登陆号为 : EF646277-EF646278 ,
并通 过 在 线 Blast 工 具 ( htts:?www. ncbi. nlm.nih.gov?
BLAST) 从 NCBI 下载 GenBank等数据库内已知同源序列
26 条作为参考序列 , 其中包括褐红牛肝菌 7 条序列、美
味牛肝菌 6 条序列 、铜色牛肝菌 4 条序列和夏生牛肝菌
6 条 序 列以 及 作为 外 群 的褐 黄 牛 肝 菌 ( B. luridus,
AY278765) 1 条。并将不同的 ITS 区段用 DNASTAR 软件
包中的 MegAlign程序进行排序 , 并对排序结果进行手工
调整 , 以保证对应碱基的同源性。然后用 PAUP * 4.0b
10 软件 ( Swofford, 2003 ) 进行邻接法 ( neighbor-joining
method) 分析 , 对分枝节点的置信度使用重抽样 ( Boot-
straping) 法进行评价 , Bootstrap抽样重复次数为 1000 次。
2 结果
2 .1 分离结果
2 .1 .1 “白牛肝”市售子实体分离结果 接种
的 10 支斜面 , 其中 4 支青霉污染 , 6 支 30 d 后
无生长。
2 .1 .2 “白牛肝”野外采集子实体分离结果
接种的 10 支斜面 , 30 d后 , 2 支未萌发 , 1 支青
霉污染 , 7 支菌落形态一致 , 为白色细绒状 , 从
组织块边缘长出 , 菌丝浓密 , 生长速度缓慢。
2 .2 转接结果
将分离到的 7 株菌用 6 种培养基转接 , 每个
处理设两个重复 , 仅转接出 2 个菌株 (YM-4 和
YM-6) , 它们的生长培养基是 I 号和Ⅱ号 , 其余
菌株均未转接成功。
培养 30 天后 , 菌株 YM-4 和 YM-6 在Ⅱ号培
养基上仅有少量菌丝生长 ; 在 I 号培养基上可形
成大量菌丝 , 菌落形态特征为白色细绒状 , 与培
养基结合紧密 , 产黄色液滴 ; 菌株 YM-6 产黄棕
色色素。用 I 号培养基上连续转接 3 代后 , YM-4
和 YM-6 菌丝体性状稳定。因此 , 本研究中所供
试的 6 种培养基中 , I 号培养基是最适于“白牛
肝”转接的培养基。
2 .3 PCR 扩增
用真菌 ITS 通用引物 ITS4 和 ITS5 对菌株
YM-4 和 YM-6 进行了 PCR 扩增。结果两个样品
都有大小在 750 bp左右扩增条带。
2 .4 测序结果及 NJ 树的构建
用测序引物 ITS4 和 ITS5 测序后 , 均得到清
晰的序列信号图。将 YM-4 和 YM-6 测序结果与
下载序列构建 NJ 树 (图 1)。从系统发育树上可
见分离到的 2 个菌株属于美味牛肝菌复合群 , 与
夏生牛肝菌 B. aestivalis ( Paul .) Fr . 有较近的亲
缘关系。
图 1 基于两株滇产广义美味牛肝菌 ITS1-5 . 8S-ITS2
序列构建的 Neighbour- joining树
Fig . 1 Neighbour- joining tree based on the ITS1-5 .8s-ITS2
sequences from two strains of the B. edulis
complex of Yunnan, China
3 讨论
已有对牛肝菌进行分离成功率为 41 .7% ～
58 .3%的报道 (于富强等 , 2003 ) , 本研究用 14
号培养基对美味牛肝菌的分离成功率是 70% ,
说明 14 号培养基较适于美味牛肝菌的分离。在
14 号培养基中 , 取牛肝菌采集地土壤浸出液作
1655 期 王海坤等 : 两株滇产广义美味牛肝菌的分离培养及其分子鉴定
为分离培养基的成分从而使人工培养基质接近牛
肝菌的野外生存营养环境 , 这可能是成功分离的
重要因素之一 , 但本研究的分离样较小 , 14 号
培养基的分离效果还需进一步验证。
牛肝菌子实体采摘后由于其呼吸强度较大而
易老化 , 再加之易受杂菌污染 , 不易于保藏 , 24
小时后就变暗 , 本实验从市售“白牛肝”子实体
的分离未获成功 , 可能与这一因素有密切关系。
而直接从新鲜子实体上获取组织块的生活力较
强 , 菌丝也较易萌发、生长。因此 , 采取子实体
于当地立即分离是成功分离的又一个重要因素。
在分离得到的 7 株菌中有 2 株 ( YM-4 和
YM-6) 用 I 号培养基转接 3 代后 , 菌丝体性状稳
定 , 其余菌株均未转接成活。用 14 号培养基不
能将分离菌株成功转接 , 原因可能是在分离培养
基上菌丝从组织块边缘萌发长出 , 与组织块关系
密切 , 转管培养时仅挑取菌丝 ( 不含组织块部
分 ) , 菌丝脱离组织块后就失去了生长能力。分
离菌株 YM-4 和 YM-6 在马铃薯葡萄糖琼脂培养
基上未能转接成活 , 但在此培养基中加入硫酸镁
和磷酸二氢钾后就能生长 , 一月后形成大量菌
丝 , 说明这两种无机盐是培养美味牛肝菌必不可
少的。本研究表明 I 号培养基是最适美味牛肝菌
转接的培养基。
有研究用 ITS 的限制性片段长度多态分析
(RFLPs) 来进行外生菌根真菌的鉴定 (Thomas,
2002; Cline等 , 2005)。但 RFLP 方法存在操作复
杂 , 多态信息含量低 , 对样品中靶序列拷贝数的
纯度要求高等缺点 (沙涛等 , 2004)。本研究直接
将待测菌株的 ITS 序列扩增测序 , 通过分子系统
进化方法分析待测菌株的分类地位 , 这种鉴定外
生菌根真菌的分子生物学方法更简便、可靠。
〔参 考 文 献〕
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