全 文 ：美味牛肝菌液体培养菌丝体的
研 究
王 化民 胡彦民 耿春兰 周隽
球干粉 0 19 , 以 50 m l 蒸馏水于沸水浴中抽提 3 次 ,每
次 2 小时 ,离心 、 合并 3 次抽提液 , 浓缩 至原体积的 l/
5
, 在搅拌下加入 3 倍量 95 %的乙醇 , 于冰箱中静置过
夜 . 次日离心 , 将沉淀依次用无水乙醇 、 丙酮洗涤 ,真空
千燥 至恒重 ,精确至 .0 0 0 1 9 。
(河北师范大学生物系 ,石家庄 。5 0 0 1 6) 二 、 结果与分析
美味牛肝菌 (oB le tu : 。 d以i : )是一种珍贵的食用及
药用真菌 。 早在 1 9 5 7 年就发现美味牛肝菌的热水提取
液对小白鼠肌癌有明显的抑制作用 , 近来又发现对艾
氏腹水癌的抑制率高达 90 % . 目前人工栽培美味牛肝
菌还没有成功的例子 ,有关该菌液体培养的报道也不
多见 。 本文通过液体培养的方法培养美味牛肝菌的苗
丝体 ,并对菌丝体的生长规律进行了初步研究 。筛选出
了适合该菌生长的较好的培养基 。
一 、 材料和方法
(一 )菌丝球直径 、密度和干重的变化 从表 1可
看出 , 利用 M I 培养基培养美味牛肝菌 ,菌球的直径变
化不大 , 在 。. 7~ 0 . 82 m m 之间 。 菌球密度随着培养时
间的延长而增加 , 从第 4 天开始再继续培养 , 菌球数 口
趋于稳定 。干重随着菌球数目的增加而增加 ,培养 4 天
后处于稳定期 。 从表 2 中得知 , 美味牛肝菌在 M Z 培养
基中生长产生较大的菌球 . 苗球直径在 1 . 2~ 1 . s m m .
梅 1 1苗液 中菌球个数在培养前期增长较快 , 但比在
M l 培养丛中少 , 并且在培养 4 天后趋于稳定 。 干重的
变化与菌球密度变化一致 。
表 l 在 入n 培养基中培养菌球直径 、 密度及干重的变化
培养 (小时 ) 直径 ( m m ) 密度 (个 / n 、 l ) 干重 ( g / I O om l )
J任勺白厂d叮自n乙OUO,山马乃JO..….三,`J丹J竹」
0248洲儿
(一 )菌种来源 实验用的美味牛肝菌引自中国农
科院 。
(二 )液体培养基 ①马铃薯糖液体培养基 ; ② M l
培养基 : 玉 米粉 2% , 葡萄糖 2% . 豆 粉 l % . 酵 母 膏
0
.
5%
,磷酸二氢钾 。 . 1% , 硫酸镁 0 . 05 % ,③ M Z 培养
基 : 豆粉 2% ,葡萄糖 2% ,磷酸二氢钾 。 . 1% , 硫酸镁
.0 0 5%
.
(三 )培养方法 ①菌种活化 : 将美味牛肝菌母种
转接在 P D A 斜面上 . 于 25 ℃ 恒温箱中培养 5 ~ 7 天 。
②一级摇瓶培养 :于 30 。蒯 三角瓶 内装 10 o nlr 马铃薯
糖培养基 ,高压灭菌后 , 接种 cI m Z 左右的活化斜面菌
种 ,置 24 ~ 26 ℃恒温箱中静置培养约 48 小时 , 之后于
同样 温度的 w D P 微生物多用培养箱中 , 以 10 ~ 1 20
转 /分的速度振荡培养 3天 . ③二级摇瓶培养 : 50 o ml
三角瓶内装 10 0nr l 上述发酵培养基 ,经高压灭菌后 , 以
10 写接种量接入一级摇瓶种子 , 置 24 ~ 26 ℃w CI , 型
微生物多用培养箱中培养 ,振速为 1 20 ~ 1 4 0 转 /分 。
( 四 )测定方法 ①菌球大小 : 随机取培养液中菌
球 3 0 ~ 50 个 , 置于培养皿中紧密排成一列 , 测量总直
径 ,求出菌球直径平均值 . 每次处理重复三次 。 ②菌球
密度 :取 10 m ! 培养液 , 按一定比例准确稀释 ,摇匀后取
一定量在直径为 90 m m 的培养皿中摊匀 , 培养皿下垫
黑 白相间的方格纸进行计数 ,求出每毫升培养液菌球
个数 。 每次处理重复三次 。 ③菌丝体干重 :将培 养好的
菌液 以 3 0 。。 转 /分离心 15 分钟 , 用蒸馏水洗涤苗球 ,
离心同上 。 菌球置于 105 ℃ 恒温箱中烘至恒重再称址 。
① p H 值 : 用精密 p H 试纸进行测定 。 ③蛋白质 :菌丝体
蛋白质用凯氏定氮法 ,菌液用考马斯兰法 . ⑥敏荃氮 :
甲醛滴定法 。 ⑦总搪 :裴林法 。⑧粗多糖 :取供干的苗丝
:::
0
.
7 1
0
.
7 0
0
.
7 6
0
.
8 2
0
.
8 2
0
.
8 0
0
.
8 2
2 10
3 7 0
48 0
55 8
64 4
6 5 0
5 5 4
表 2 在 入12 培养基中培养菌球直径 、 密度及千重的变化
培养 (小时 ) 直径 ( n、 m ) 密度 (个 / m l ) 干重 ( g / 10 ( ) n l一)
{
.
::
:::
18 ( ) 一
2 14 一
25 6 0
.
9 6
26 7 1
.
1 7
3 6 8 1
.
26
3 6 5 1 24
3 6 7 1
.
2 7
.15486
)1`吕q`八n(9``,勺`OJ
山此可见 , 利用 M I 培养荃作为培养美味牛肝苗
的液体荃质 , 菌球直径小 , 菌球密 度高 , 干重在培 养 4
少扣寸达到址高 。 这是 山于 M I 中玉米粉的作用 , 使苗球
个体变小 .发菌点多 ,增加菌球的数日 ,生物量较高 。这
样有利于积累菌丝体及其代谢产物 。
美味牛肝菌无论是在 M l 还是 M Z培养甚 中进行
液体培养 . 均表现 出前期生长较快 , 培养 4 天时 , 生物
量便达到最高 。 因此 ,液体培养美味牛肝菌菌丝体周期
短 , 生长快 , 利于在短时间内得到大量的菌丝体 .
(二 ) zo H 值的变化 我们对摇 瓶培养液的 p H 位
定时进行测定 ,结果表明 ,培养液的 p H 值在培养过程
中丛本保持不变 ( o ~ q s 小时 p H 为 5 . 6 , 7 2~ l `14 小时
pH 为 5 . 5 ) 。 说明美味牛肝菌在液体培养中并未形成
一 4 一
大量的有机酸等代谢产物 .
(三 )发酵液总糖 、蛋白质 、 氨基态氮及菌丝干重的
变化 发酵液中总糖 、蛋白质 、 氨基态氮的变化可以反
映菌丝体生长的情况 ,结果见表 3 。 随着培养时间的进
行 ,总糖不断被消耗 ,菌丝体干重不断增加 。 当总糖为
。 . 43 %时 ,菌丝体干重达到 3 . 5 4 9 / l 。。m l 。 蛋白质的变
化在培养过程中呈下降的趋势 , 随着菌丝生物量的增
加 ,基质中的蛋白质不断被分解并合成菌丝体蛋白质 。
氨基态氮随着培养时间的延长逐渐增加 , 而且在中后
期增长较快 ,可见菌丝体不断积累游离氨基酸等含氮
化合物 。
· 表 3 美味牛肝菌发酵液分折测定结果
羊肚菌液体培养特征及其蛋白电泳
林 彬 贾身茂
(河南省科学院生物研究所 ,郑州 4 5。。。 3)
培养时间
(小时 〕
总 糖
( % )
蛋白质 氮荃态氮
( m g / m l )
菌丝千重
( g八 o o m l )
3
。
8 9
3
。
1 0
2
。
3 5
l
。
3 2
0
。
4 3
0
.
4 0
0
。
0 5 4
0
.
0 6 8
0
.
1 24
0 2 3
0 2 8
0
.
34
1
.
8 0
2
.
9 7
3
.
54
3
.
4 0
,二已J月了4亡口飞二O即ùb.…1几,0
4
0U
2
月n自`4t才O甘
(四 )菌丝体中蛋白质 、粗多糖的变化 利用千菌
丝进行菌丝体蛋白质及粗多糖的测定 ,用图中曲线表
示其变化 . 菌丝体中蛋白质的含量随培养时问的延长
而逐渐增加 ,培养第 5 天时达到 ` 48 写 , 之后便缓慢下
降 . 蛋白质出现高峰期比干重的迟一天 ,因此尽管干重
不再增加 , 蛋白质仍然在积累 . 粗多糖在发酵第 4天含
量最高 ,再继续培养含量下降 。
粼厂教 l , , 7
杨 一 七二一一一一-
n 】 2 3
二冰叹:一 ` 、 、 、、
.
\ 蛋 日 质的变化
— 相 名掩的 变化 ;二
川 汽朴 J 气 二
液体培养菌丝体蛋白质 、粗多枪的变化
一 本文通过对羊肚菌的液体培养 ,详尽地了解三种
羊肚菌的培养特征 ,不同提取液对羊肚苗可拾性蛋白
的提取率 , 以及可溶性蛋白的电泳图谱 , 以求对这一资
源的开发和利用有所帮助 。
一 、 材料与方法
(一 j试验材料 . 。 菌种 : 尖顶羊肚菌( 九防 r c h el 。
co
n
ica )
.粗柄羊肚 菌 ( Mo cr le al ` ar ` s l’P e , ) . 羊 肚菌
. 人 Jcr 人“ al e cs “细 at ) , 均采集于郑州郊区 。 ②培养基 :
A
. 麦芽培养基为麦芽浸出物 5 . 0 9 ,硫酸镁 1 . 09 ,磷酸
二氢钾 1 . 09 , 蛋白陈 5 . 0 9 , 可溶性淀粉 ZOg . p H S . 0 ,水
1 0。。m l . B . 土豆培养基为土豆 2 0 0 9 , 硫酸镁 1 . 5 9 ,磷
酸二氢钾 5 . 0 9 ,水 1 0 o o m l 。
(二 )样品制备 将 10 oml 培养基装人 25 0 nlr 三角
瓶中 , 灭菌 , 每 瓶接种 1 支斜面 , 摇床 1 2OrP m , 27 ~
3 ℃培养 8天 。 过滤菌丝体 , 取 4 . 电 预冻 2 小时 ,加
4ml 提 取 液 (分 三 种 : ① T E B 提 取 液 , 。 . 1人r T r is 、
0
.
I M E D T A
、
0
.
1八引H 3 B O . 等量混合 p H S . 2 ; ②无离子
水 ;③ p H 6 . 7 0 . I M 磷酸缓冲液 ) .加入少量石英砂研
磨 , 4 0 。。 r p m 离心 10 分钟 , 取上清液待用 .
(三 )可溶性蛋白含量测定与电泳 采用考马斯亮
兰 G 2 5 o . 59 5 : l m 比色 .测定蛋白含量 。 聚丙烯酸胺凝胶
不连续垂直平板电泳 。 分离胶凝胶浓度 T = 7 . 5% ,
p H S
.
9
, 以过硫酸按诱发聚合 ,浓缩胶浓度 T = 3 . 1% ,
p H 6
.
7
, 以核黄素诱发聚合 , 每槽加样 5 0川 . 起始恒流
20 m A
,进入分离胶后恒流 2 4 m A ,电泳需 5~ 6 小时 。
三 、 结 语 二 、 结果与分析
用液体培养美味牛肝菌菌丝体方法简便 , 菌丝生
长快 ,周期短 ,用 M I 培养基培养该菌 ,菌丝球个体小 ,
密度大 ,生物量高 ,是较理想的培养基 。 美味牛肝菌适
于进行大规模的发酵工业生产 。 该菌在液体培养过程
中 ,菌丝体蛋白质含量和粗多糖含量分别在培养 5 天
及 4 天达到最高 ,为工业生产中选择最适宜的收获时
间提供依据。 美味牛肝菌菌丝体蛋白质含量为 48 % ,
粗多糖含量较高 ,这不仅使得美味牛肝菌在医药工业
上有着很高的价值 ,而且在食品 、 饲料等工业上都有着
广阔的前景 。 利用液体培养生产美味牛肝菌的菌丝体
及代谢产物 ,是综合利用该菌的良好途径 .
(一 )液体培养特征 同一品种在不同培养基上 ,
不同品种在同一培养基上 , 其特征各异 (见表 ) 。羊肚菌
在两种培养墓上的菌丝产量均居首位 . 在含淀粉培养
羊肚菌 的液体培养特征 (单位 :个 n/ 1 1、 m m 、 砂
菌球
个数
菌球
直径
I t ) ( )犷一1】
湿重
菌球
特征
发醉液
色 、味
尖顶羊肚菌 48 . 。
粗柄羊肚 菌 13 . 8
羊 肚 菌 2 0 , 。
尖顶羊肚菌 1 . 3 2
粗柄羊肚菌 3 7 . 。
羊 肚 荣 0 . 8 9
0
.
3 5 ~ 4 8
.
7 2 小光滑
0
.
8 ~ 5 7
.
9 8 均一光滑
( )
.
5~ 5 1 1
.
5 3 不规则
2
.
0~ 7 7
.
6 5 光滑
)`
.
5~ 7 7 8 0 多刺毛
2
.
0 ~ 1 3 1 3
.
5 5 光滑
浅黄芳香
浅黄芳香
浅黄芳香
橙黄芳香
徐红芳香
褐红
麦基芽质一土豆荃
一 5 一