全 文 ：213
响应面法优化美味牛肝菌蛋白质的
酶解工艺
郭 磊，刘 辰，李 娜，郭 娟，阚 欢，刘 云
(西南林业大学西南山地森林资源保育与利用省部共建教育部重点实验室，云南昆明 650224)
收稿日期:2016 －02 －01
作者简介:郭磊(1981 －) ，男，硕士，讲师，研究方向:食品资源开发及利用，E －mail:guoleigift.student@ sina.com。
基金项目:云南省教育厅科学研究基金理工类重点项目(2015Z142) ;云南省“卓越工程师教育培养计划”建设项目(514006110)。
摘 要:为提高美味牛肝菌的食用价值，在单因素实验的基础上，选取酶解时间、酶解温度和料液比为影响因素，以美
味牛肝菌蛋白质的水解度作为响应值，通过三因素三水平的 Box －Behnken 响应面分析法优化美味牛肝菌酶解条件。
结果表明，最佳工艺条件为酶解时间 5 h、酶解温度 50 ℃、料液比 1∶ 36，在此条件下，蛋白质水解度达到 47.37%。水解
液富含多种营养物质，可进一步加工为美味牛肝菌调味品。
关键词:美味牛肝菌，蛋白质，水解，响应面法
Optimization of enzymatic hydrolysis conditions of
Boletus edulis proteins by response surface methodology
GUO Lei，LIU Chen，LI Na，GUO Juan，KAN Huan，LIU Yun
(Key Laboratory for Forest Ｒesources Conservation and Use in the Southwest Mountains of China，
Ministry of Education，Southwest Forestry University，Kunming 650224，China)
Abstract:In order to improve the edible value of Boletus edulis，hydrolysis － time，hydrolysis － temperature and solid
－ liquid ratio were studied on the basis of single factor experiment，a central composite design(CCD)involving 17
experiments of three variables(i.e.，hydrolysis － time，hydrolysis － temperature and solid － liquid ratio)at three levels
combined with response surface methodology was employed to attain the highest degree of hydrolysis(DH).When
the optimal hydrolysis － time，hydrolysis － temperature and solid － liquid ratio were 5 h，50 ℃，1 ∶ 36，respectively.
Under these conditions，the degree of hydrolysis was 47.37% .The hydrolysate was rich in many nutrients，and it
could be used for condiment.
Key words:Boletus edulis;protein;hydrolysis;response surface methodology
中图分类号:TS255.5 文献标识码:B 文 章 编 号:1002 －0306(2016)15 －0213 －05
doi:10． 13386 / j． issn1002 － 0306． 2016． 15． 033
美味牛肝菌(Boletus edulis Bull.)属于担子菌门
(Basidiomycota)、层菌纲(Hymenomycetes)、牛肝菌目
(Boletales)、牛肝菌科 (Boletaceae)、牛肝菌 属
(Boletus)。美味牛肝菌是一个广布种，分布于日本、
欧洲、北美和澳大利亚，我国见于吉林、黑龙江、江
苏、河南、贵州、四川、云南、西藏、湖北、湖南等地
区［1］。目前，认为牛肝菌是一类与栎和松等树种根系
共生形成外生菌根的真菌类群，迄今为止，除个别种
有人工报道在实验室条件下栽培成功外［2］，绝大多数
种类不能通过人工栽培形成子实体［3］。牛肝菌种类
以云南为最多，有 219 种，占总种数的 55.2%［4］，其菌
肉厚而细软，味道鲜美，营养丰富，是人们最喜欢的
野生食用菌之一［5］。
20 世纪 80 年代迄今，国内外学者对美味牛肝菌
的生物学特性、化学成分、药理作用及应用进行了大
量研究，其药用价值受到广泛重视［6］。美味牛肝菌含
有蛋白质［7］、脂肪［8］、黄酮类化合物［9］，三萜类化合
物［10］，多糖［11］等多种营养成分，长期食用能增强机体
免疫力，具抗肿瘤、抗突变、降血脂、抗病毒等作用。
近年来，随着人们生活水平的提高和消费观念
的改变，食用菌提取物具有很大的开发利用价值［12］。
国内有研究者应用酶解技术对香菇、蘑菇、茶树菇等
食用菌进行了酶解工艺的研究［13－15］，为食用菌的精深
加工提供了一定的理论依据。施汉钰等［16］通过对美
味牛肝菌液体发酵技术的研究，研发出具有其子实
体特点的配制酒的生产工艺。吕红英［17］通过实验确
定美味牛肝菌菌丝体液态发酵的优化条件，利用发
酵液研究出美味牛肝菌液体菌醋。李艳利等［18］以美
味牛肝菌和云南特色土鸡肉为主要原料，炖制出滋
味好、香气浓、色泽佳的牛肝菌土鸡汤。本文采用复
214
合酶法水解美味牛肝菌工艺条件的研究，探索酶解
工艺参数对美味牛肝菌蛋白质水解度的影响，确定
最佳工艺条件，为复合酶解法酶解蛋白质工艺的产
业化提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
美味牛肝菌 云南易门县康源菌业有限公司;风
味蛋白酶(2 × 104 U /g) ，纤维素酶(2 × 104 U /g) 南
宁庞博生物工程有限公司;甘氨酸，茚三酮显色剂，
无水乙醇，以上均为分析纯。
HH －2 型数显恒温水浴锅 国华电器有限公
司;DHG －9240A型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒
科技有限公司;BT224S 电子天平，酸度计 北京赛多
利斯仪器系统有限公司;电子万用炉 北京市永光明
医疗仪器有限公司;UV －2600 型紫外分光光度计 岛
津仪器(苏州)有限公司;高速冷冻离心机 SIGMA
公司。
1.2 实验方法
1.2.1 美味牛肝菌的酶解 参照杨文博［19］采用茚三
酮法测定蛋白质的水解度，绘制甘氨酸标准曲线，并
计算蛋白质的水解度。
水解度(%)= 水解液中氨基氮含量 /总氮量
× 100
1.2.2 单因素实验 以水解度为指标，采用单因素
实验，探讨酶解时间、酶解温度、料液比、复合酶(纤
维素酶和风味蛋白酶)比例、初始 pH 等因素对云南
美味牛肝菌酶解效果的影响。复合酶解的因素设以
下水平:固定酶解温度 55 ℃，料液比 1∶ 30(g /mL，下
同) ，复合酶(纤维素酶:风味蛋白酶)比例 50∶ 50(体
积比，下同) ，pH6，考查不同的酶解时间(3、4、5、6、
7 h)对水解度的影响;固定酶解时间 5 h，料液比
1∶ 30，复合酶比例 50∶ 50，pH6，考查不同的酶解温度
(40、45、50、55、60 ℃)对水解度的影响;固定酶解时
间 5 h，酶解温度 50 ℃，复合酶比例 50∶ 50，pH6，考查
不同的料液比(1∶ 10、1∶ 20、1∶ 30、1∶ 40、1∶ 50)对水解
度的影响;固定酶解时间 5 h，酶解温度 50 ℃，料液比
1∶ 30，pH6，考查不同的复合酶比例(100 ∶ 0、80 ∶ 20、
50∶ 50、20∶ 80、0 ∶ 100)对水解度的影响;固定酶解时
间 5 h，酶解温度 50 ℃，料液比 1 ∶ 30，复合酶比例
50∶ 50，考查不同的初始 pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)对
水解度的影响。
1.2.3 Box －Benhnken 中心组合实验设计 在单因
素实验的基础上，选择对酶解效果影响较大的三个
因素，每个因素选取三个水平，根据 Box －Behnken 实
验设计原理，采用 3 因素 3 水平的响应曲面分析方
法，以水解度为响应值，实验因素与水平设计见表 1。
共 17 个实验点，其中 12 个为析因点，5 个为中心点。
1.2.4 数据处理 采用 F 检验对实验数据进行方差
分析以评价模型的统计意义，数据分析软件采用
Design Expert 6.0.5。
2 结果与分析
2.1 甘氨酸标准曲线的绘制
在 570 nm 波长下测定吸光度，以吸光度(A)为
表 1 因素水平表
Table 1 Variables and levels
in the three －variable / three －level central composite design
因素
水平
－ 1 0 1
A酶解时间(h) 3 5 7
B酶解温度(℃) 40 50 60
C料液比 1∶ 10 1∶ 30 1∶ 50
纵坐标，甘氨酸标准溶液浓度(C)为横坐标，得出标
准曲线及回归方程:C = 0.0211A － 0.0076，Ｒ2 =
0.9996，线性范围在 0～20 μg /mL。
图 1 甘氨酸标准曲线
Fig.1 Standard curve of glycine
2.2 单因素实验
2.2.1 时间对酶解效果的影响 由图 2 可知，随着酶
解时间的延长，蛋白质水解度随酶解时间的增加呈
先增大后降低的趋势，酶解时间在 5 h 时，水解度达
到 46.04%。之后随时间的延长，可酶解蛋白质的浓
度差逐渐降低，同时可能还有一些细胞未被破坏，导
致水解度降低且变化较小，因此最适酶解时间为
5 h。
图 2 时间对蛋白质水解度的影响
Fig.2 Effect of hydrolysis time on the DH
2.2.2 温度对酶解效果的影响 由图 3 可知，酶解温
度 40～50 ℃，蛋白质水解度不断升高，温度为 50 ℃
时水解度达到 47.28%，50 ℃之后水解度明显下降。
酶解温度是影响酶促反应的一个重要因素，温度的
升高会加快酶促反应，但温度超过了酶的最适反应
温度时会降低酶促反应的速率，另外蛋白质可能由
于温度的升高而变性，故最适的酶解温度是 50 ℃。
2.2.3 料液比对酶解效果的影响 从图 4 可知，蛋白
质水解度随着料液比的增加呈先增大后减小的趋
势，当料液比达到 1 ∶ 30 时，水解度达到最大值
215
图 3 温度对蛋白质水解度的影响
Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on the DH
43.56%。但随着料液比的增加，酶解的蛋白质浓度
降低导致水解度降低，故最适的料液比为 1∶ 30。
图 4 料液比对蛋白质水解度的影响
Fig.4 Effect of solid －liquid ratio on the DH
2.2.4 复合酶比例对酶解效果的影响 从图 5 可知，
蛋白质水解度随着复合酶中风味蛋白酶比例呈先缓
慢增大后缓慢减小的趋势，变化幅度较小，当复合酶
比例达到 50∶ 50 时，水解度达到最大值 47.28%。随
着风味蛋白酶比例的增加，纤维素酶比例的下降，蛋
白质不能很好的被溶出导致水解度降低，故最适的
复合酶比例为 50∶ 50。
图 5 复合酶比例对蛋白质水解度的影响
Fig.5 Effect of composite enzyme ratio on the DH
2.2.5 初始 pH对酶解效果的影响 从图 6 可知，蛋
白质水解度随着初始 pH 的增加呈先缓慢增大后缓
慢减小的趋势，变化幅度较小，当 pH达到 6 时，水解
度达到最大值 46.04%。随着初始 pH 的增加，pH 影
响了酶的最佳反应条件，导致蛋白质的水解度降低，
故最适的初始 pH为 6。
从图 2～图 6 中可知，复合酶比例及初始 pH 对
蛋白质水解度影响很小，故本研究以影响蛋白质水
解度较大的三个因素酶解时间、酶解温度、料液比
图 6 初始 pH对蛋白质水解度的影响
Fig.6 Effect of pH on the DH
为自变量进行响应面分析来优化蛋白质的酶解
工艺。
2.3 酶解的响应面实验结果及数据分析
2.3.1 响应面实验方案及结果 在单因素实验结果
的基础上，由 Design －Expert 6.0.5 统计分析软件设计
出的实验方案及实验结果如表 2 所示，以蛋白质水
解度为响应值，以影响蛋白质水解度较大的三个因
素酶解时间(A)、酶解温度(B)、料液比(C)为自变
量，建立三因素三水平中心组合实验设计共包括 17
个实验方案，其中 12 个析因实验点，5 个中心实验
点，用以计算实验误差。
表 2 Box －Behnken实验设计及其实验结果
Table 2 Arrangement and results of
the three －variable / three －level central composite design
实验号
A酶解时间
(h)
B酶解温度
(℃)
C料液比
(g /mL)
水解度
(%)
1 － 1 － 1 0 27.19
2 1 － 1 0 23.47
3 － 1 1 0 26.94
4 1 1 0 23.47
5 － 1 0 － 1 3.44
6 1 0 － 1 9.81
7 － 1 0 1 24.64
8 1 0 1 30.02
9 0 － 1 － 1 8.24
10 0 1 － 1 7.57
11 0 － 1 1 30.74
12 0 1 1 28.37
13 0 0 0 44.80
14 0 0 0 46.79
15 0 0 0 47.78
16 0 0 0 46.04
17 0 0 0 43.56
2.3.2 回归方程拟合及方差分析 采用 Design －
Expert 6.0.5 统计软件对所得数据进行回归分析，回
归分析结果见表 3，对各因素回归拟合后，得到回归
方程:
Y = 45.79 + 0.57A －0.41B + 10.59C + 0.063AB－
0.25AC －0.43BC －11.14A2 －9.39B2 －17.68C2
回归模型的 Ｒ2 = 0.7773，Ｒ2Adj = 0.9615，由方差分
216
表 3 回归模型及方差分析
Table 3 Analysis of variance of regression equation
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 Pr ＞ F 显著性
模型 3344.04 9 371.56 45.44 ＜ 0.0001 ＊＊
A 2.60 1 2.60 0.32 0.5905
B 1.35 1 1.35 0.17 0.6963
C 896.97 1 896.97 109.70 ＜ 0.0001 ＊＊
AB 0.016 1 0.016 1.911E －003 0.9664
AC 0.25 1 0.25 0.030 0.8675
BC 0.72 1 0.72 0.088 0.7749
A2 522.48 1 522.48 63.90 ＜ 0.0001 ＊＊
B2 371.01 1 371.01 45.38 0.0003 ＊＊
C2 1315.69 1 1315.69 160.91 ＜ 0.0001 ＊＊
残差 57.24 7 8.18
失拟 46.26 3 15.42 5.62 0.0644
误差 10.98 4 2.74
总和 3401.28 16
注:＊＊p ＜ 0.01 极显著;* p ＜ 0.05 为显著。
析可知回归方程模型极显著(p ＜ 0.0001)［20］，说明该
模型与实际拟合良好，实验方法可靠，失拟项不显著
(p ＞ 0.05) ，说明所得方程与实际拟合中非正常误差
所占比例小，可用该回归方程代替实验真实点对实
验结果进行分析。结果表明，料液比(C)、酶解时间
二次项(A2)、酶解温度二次项(B2)、料液比二次项
(C2)对响应值影响显著，各因素对响应值显著性的
排序为 CAB。
2.3.3 响应面图分析 通过上述二次多项回归方程
所做的相应曲面图见图 7。通过该组动态图即可对
任何两因素交互影响酶解效应进行分析与评价，并
从中确定最佳因素范围。
图 7 三个图分别显示了料液比，酶解温度，酶解
时间为零水平时，酶解时间和温度、酶解时间和料液
比、酶解温度与料液比对美味牛肝菌蛋白质水解度
的交互影响效应。由图 7 可知，水解度随其中任意
两个变量的增加均呈上升趋势，达到某一定值时，曲
面稍下降或趋于平缓。
2.3.4 验证实验 对回归方程求解，即蛋白质水解
度达到最大值时的酶解条件为酶解时间 5.04 h、酶解
温度 49.7 ℃、料液比 1∶ 36 (g /mL) ，最大水解度达到
47.39%，为方便实际操作将实验条件定为酶解时间
5 h、酶解温度 50 ℃、料液比 1∶ 36 (g /mL)。取三等
份云南美味牛肝菌干燥粉末进行平行验证实验，验
证实验所得平均水解度为 47.37%。结果表明，经过
响应回归方程拟合出的理论值与实际值相吻合，证
明用响应面法可以有效的优化云南美味牛肝菌的酶
解工艺。
3 结论
本研究在单因素的基础上，以蛋白质的水解度
为指标，通过三因素三水平的响应面分析法对美味
牛肝菌的酶解工艺进行了优化，建立了蛋白质水解
度的回归模型，由该模型优化的蛋白质酶解条件为
酶解时间 5 h、酶解温度 50 ℃、料液比 1∶ 36 (g /mL)。
图 7 两因素的交互作用对多糖得率的响应面图
Fig.7 Ｒesponse surface plots of variable parameters
on the yield of polysaccharides
在此酶解条件下，蛋白质水解度为 47.37%，与模型预
测结果接近，进一步验证了该模型的可靠性。实验
证明，响应面分析法可以有效的优化美味牛肝菌的
酶解工艺条件，对工业化生产具有一定的指导意义。
217
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26 －28.
(上接第 212 页)
抑制作用，且在 pH6 时抑制作用最强，过酸或者过碱
时没有抑制作用。多糖是植物光合作用的产物，可
以作为人类的能源物质起作用。由于金桂果实多糖
具抑菌作用，所以，金桂果实多糖用于食品的防腐保
鲜有待于研究。这种研究为进一步开发和利用金桂
果实多糖提供了积极的指导作用。
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